經過2周暫養后，分為兩組，一組為對照組不添加潛在益生菌，一組為實驗 驗證組，水體中添加1〇7 CFU/ml的上述菌株ZYTC1-1，每組設3個平行，每個平行放刺參30 頭，期間投喂鼠尾藻粉，24h換水一次，換水后重新添加菌液，浸浴實驗進行7d，7d后統計各 處理組刺參的存活率。結果表明在10 7 CFU/ml菌液的浸浴下，刺參并沒有出現患病和死亡， 表明上述潛在益生菌菌株ZYTC1-1對刺參幼體是安全的。
[0024] 實施例2 解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1對刺參稚參生長、免疫及抗病力的影響 實驗設對照組和益生菌添加組，每組分別設三個平行。每個平行放刺參35頭(初始體重 0.2106±0.001 g)。對照組投喂鼠尾藻粉;益生菌添加組在鼠尾藻粉中按109 CFU/g添加上 述解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1進行投喂。養殖實驗在室內靜水養殖系統開展，每天傍晚投喂一 次，每天換水50%，養殖周期為30天。期間海水的鹽度在27-30 ppt，pH7 · 8-8 · 1，溫度19-23 ° C，連續充氧保證溶氧充足。
[0025]養殖實驗結束后，對每個平行的所有刺參進行計數并稱重，以此求出每個平行所 有刺參的平均終末體重，并計算出特定生長率。每個平行中隨機取10頭刺參，無菌條件下用 手術刀解剖刺參腹部獲取體腔液和刺參腸道，獲取的體腔液加入等體積的抗凝劑，取一部 分抗凝體腔液用于體腔細胞計數及吞噬活性測定;另一部分抗凝體腔液離心收集體腔細胞 沉淀（4000rpm，10 min，4 °C)，獲取的細胞沉淀加入生理鹽水重懸，超聲波破碎后，離心 (4000rpm，10 min，4 °C)，所得上清液為體腔細胞破碎上清液(CLS)，上清液用于超氧化物 歧化酶、總抗氧化力及一氧化氮合酶活性的測定。獲取的刺參腸道稱重后，加入9倍體積的 生理鹽水，用勻漿器在冰上進行研磨，研磨得到的混合液體，離心(4000rpm，10 min，4 ° C) 得到的上清用于腸道淀粉酶活性、胰蛋白酶活性和脂肪酶活性的測定，并在24h內測定完 畢。取樣完畢后，每個平行隨機取20頭刺參，以燦爛弧菌為病原菌，進行浸浴攻毒，浸浴攻毒 進行7天，統計累積死亡率。
[0026]表2解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1對刺參生長、消化酶活性及免疫抗病力的影響
注:表中數據表示平均值土標準誤，不同的字母表示差異顯著(P<〇.05)。
[0027] 從表2可以看出，與對照組相比，添加了上述解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1的益生菌組 中刺參的終末平均體重、特定生長率、淀粉酶活性、吞噬活性、超氧化物歧化酶活性、總抗氧 化力活性和一氧化氮合酶活性分別提高了 17 · 72%、17 · 77%、81 · 34%、41 · 99%、8 · 47%、61 · 70% 及54.21%，而累積死亡率下降了 25%，從而說明本發明所述解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1顯著提 高了刺參腸道淀粉酶活力，對刺參的生長有顯著的促進作用，可以有效提高刺參的免疫力 及對燦爛弧菌的抵抗能力，因此可以作為益生菌廣泛應用于刺參稚參的養殖生產過程中。
【主權項】
1. 一株解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1，該菌種于2015年12月24日保藏于中國典型培養物保 藏中心，其簡稱為：CCTCC，其保藏編號為CCTCC NO:M 2015774,命名為Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1。2·按照權利要求1所述的一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1，其16S rDNA序列見附件序列表的序列。3. 按照權利要求1所述的一株解淀粉芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 、制備培養基 制備芽孢桿菌分離培養基、制備改良的TSB培養基、制備淀粉水解培養基、制備酪素水 解雙層平板培養基； 2) 、篩選 健康刺參從養殖場采集后，加冰運輸至實驗室，無菌條件下解剖獲得刺參腸道，腸道稱 重后，加入9倍體積的無菌生理鹽水，用勻漿器在冰上進行研磨，充分研磨后進行10倍梯度 稀釋，接種芽孢桿菌分離培養基，28 ° C培養24h-48h，選取均勻清晰的單菌落，在改良的TSB 培養基上劃線純化，純化后的細菌，用改良的TSB培養基擴大培養，用甘油生理鹽水-80°C保 存形成但菌落，將單菌落過夜培養16-18h，分別點種于淀粉水解培養基和酪素水解雙層平 板培養基上，每種菌點種3個重復，28 ° C恒溫培養，48 h形成明顯菌落。4. 按照權利要求1所述的一株解淀粉芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于 所述芽孢桿菌分離培養基:葡萄糖l〇g，磷酸鈣5g，硫酸銨0.5g，氯化鉀0.2g，七水硫酸 鎂O.lg，硫酸錳O.OOOlg，硫酸亞鐵O.OOOlg，酵母提取物〇.5g，蒸餾水1000ml，pH6.8-7.2,瓊 月旨 20g，121 °C滅菌 30min; 所述改良的TSB培養基:胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)30g，氯化鈉10g，蒸餾1000ml， PH7.4-7.6,配制固體培養基加入15-20g的瓊脂，121°C滅菌20min; 所述淀粉水解培養基:牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水1000ml， PH7.2-7.4,配制固體培養基加入15-20g的瓊脂，115 °C滅菌20min; 所述酪素水解雙層平板培養基： 溶液A:蛋白胨10 g、酵母膏3 g、瓊脂10 g、陳海水1000m 1; 溶液B:酪蛋白10g、蒸餾水250ml; 溶液C:瓊脂10g、蒸餾水250ml; 在堿性條件下溶解酪蛋白，配制溶液B時，滴加 NaOH溶液使酪蛋白剛好全部溶解;分別 將三種溶液滅菌（121 ° C，20min)，待其都冷卻到50 °C左右，先將B液和C液混合，倒入平板形 成一薄層，待薄層凝固后將A液倒入，制成雙層平板。5. 按照權利要求1所述的一株解淀粉芽孢桿菌的應用，其特征在于所述解淀粉芽孢桿 菌作為益生菌應用于刺參的養殖生產過程中。6. 按照權利要求1所述的一株解淀粉芽孢桿菌的應用，其特征在于所述解淀粉芽孢桿 菌作為益生菌應用于刺參的養殖生產過程中的具體操作步驟為：當刺參苗變態為稚參后， 攝食能力進一步加強，每斤刺參在2000-4000頭時，在鼠尾藻粉中以10 9CFU/g的添加量投喂 上述解淀粉芽孢桿菌，并連續投喂一個月。
【專利摘要】本發明涉及功能微生物篩選及應用技術領域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌的篩選及其在刺參養殖上的應用。本發明的一株解淀粉芽孢桿菌，于2015年12月24日保藏于中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，地址為：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心；請求保藏人：魯東大學；保藏編號為CCTCC？NO：M2015774，該菌命名為解淀粉芽孢桿菌<i>Bacillus？amyloliquefaciens？</i>ZYTC1-1。本發明解淀粉芽孢桿菌篩選自健康刺參腸道，該菌株具有較強的產蛋白酶和淀粉酶能力，能夠提高刺參腸道中淀粉酶活力，促進刺參的生長，提高刺參的免疫力和抗病力，可廣泛應用于刺參的養殖及水產飼料領域。CCTCC NO：M201577420151224
【IPC分類】A01K61/00, C12R1/07, A23K10/18, C12N1/20, A23K50/80
【公開號】CN105647833
【申請號】
【發明人】趙彥翠, 袁磊, 孫虎山, 萬軍利, 王旭靜, 王敏, 陳昌
【申請人】魯東大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月7日