醇上相溶液148ml。
[0041] (6)將步驟(5)中的硫酸鎂溶液用8000Da的透析袋透析除鹽。
[0042] 經檢測延胡索酸酶的酶活性回收率為92%，純化倍數7.8倍。
[0043] 實施例2:
[0044] (1)短桿菌接種于肉湯瓊脂培養基后培養，挑取1環單菌落，接入裝有種子培養液 的錐形瓶中，控制體積裝液量20%，35°C、200r/min搖床中培養28h得種子液;按8%的體積 接種量接種到發酵培養基中，發酵罐體積裝液量為30%，控制溫度為30°C，攪拌速率 300rpm，pH控制在7.0，發酵培養26h得發酵液。其中：種子培養基組分為:葡萄糖15g/L，酵母 浸粉5.(^/1，玉米漿3(^/1，1%3〇4*7出0 0.28/1，控制?!17.5。發酵所用培養基包括下述組 分：葡萄糖 17g/L，酵母浸粉3g/L，玉米漿21g/L，MgS04 · 7H20 0.5g/L，氯化鈉5g/L，KH2P〇4 2g/L〇
[0045] (2)將發酵液在7000r/min條件下離心25min，過濾制得菌絲體，將菌體細胞加入去 離子水中，制得質量濃度為35%的細胞懸浮液。用KQ-1001型超聲機超聲破碎，得含有延胡 索酸酶的粗酶液92ml，調節pH至8.5。
[0046] (3)配置磷酸氫二鈉溶液200ml，加入PEG 1000，使得聚乙二醇在體系中質量百分 比為20%，磷酸氫二鈉的質量百分比為7%，充分混勻。
[0047] (4)將步驟(2)所得粗酶液與步驟(3)所得體系按1:2體積比混合，攪拌均勻，靜置 40min分相，制得磷酸氫二鈉下相89ml，含延胡索酸酶的聚乙二醇上相187ml。
[0048] (5)向步驟(4)中得到的上相溶液中加入磷酸氫二鈉，使得磷酸氫二鈉在總體系中 的質量濃度為3%，用硫酸調節pH到7.0,充分混勻。震蕩萃取，靜置40min。得含有延胡索酸 酶的下相磷酸氫二鈉溶液55ml及聚乙二醇上相溶液132ml。
[0049] (6)將步驟(5)中的磷酸氫二鈉溶液用8000Da的透析袋透析除鹽。
[0050]經檢測延胡索酸酶的酶活性回收率為95%，純化倍數10.2倍。
[0051 ] 實施例3:
[0052] (1)短桿菌接種于肉湯瓊脂培養基后培養，挑取1環單菌落，接入裝有種子培養液 的錐形瓶中，控制裝體積液量25%，37°(：、220以1^11搖床中培養2511得種子液;按10%的體積 接種量接種到發酵培養基中，發酵罐體積裝液量為40 %，控制溫度為37 °C，攪拌速率 400rpm，pH控制在7.5，發酵培養32h得發酵液。其中：種子培養基組分為:葡萄糖17g/L，酵母 浸粉4.0g/L，玉米漿27g/L，MgS〇4· 7H20 0.6g/L，控制pH 7.5。發酵培養基組分:葡萄糖208/ L，酵母浸粉 1.0g/L，玉米漿30g/L，MgS〇4· 7H20 0.6g/L，氯化鈉5g/L，KH2P〇4 48/匕（2)將發 酵液在8000r/min條件下離心25min，過濾制得菌絲體，將菌體細胞加入去離子水中，制得質 量濃度為45%的細胞懸浮液。用KQ-1001型超聲機超聲破碎，得含有延胡索酸酶的粗酶液 415ml，調節pH至8 · 0。
[0053] (3)配置硫酸銨溶液800ml，加入PEG 1500,使得聚乙二醇在體系中質量百分比為 20%，硫酸銨的質量百分比為15%，充分混勻。
[0054] (4)將步驟(2)所得粗酶液與步驟(3)所得體系按1:1.6體積比混合，攪拌均勻，靜 置40min分相，制得硫酸銨下相369ml。含延胡索酸酶的聚乙二醇上相710ml。
[0055] (5)向步驟(4)中得到的上相溶液中加入硫酸銨，使得硫酸銨在總體系中的質量濃 度為4%，用硫酸調節pH到6.5,充分混勻。震蕩萃取，靜置30min。得含有延胡索酸酶的下相 硫酸銨溶液213ml及聚乙二醇上相溶液497ml。
[0056] (6)將步驟(5)中的硫酸銨溶液用lOOOODa的透析袋透析除鹽。
[0057]經檢測延胡索酸酶的酶活性回收率為93%，純化倍數5.6倍。
【主權項】
1. 一種短桿菌，菌種的拉丁學名是Brevibacterium sp.，參據的微生物： NJWGY2133，保藏日期為2008年5月26日，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 2520。2. -種從如權利要求1所述的短桿菌的發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法，具體步 驟如下： (1) 發酵培養:將短桿菌菌株接種于肉湯瓊脂培養基后培養;挑取1環單菌落接種至種 子培養基，控制體積裝液量15 %~25 %，溫度28~37°C，轉速180~220rpm，置于搖床中培養 20~28h得種子液；以2%~10%的體積接種量接種于發酵產酶培養基中，發酵罐體積裝液 量為20~40%，控制溫度為25~37°(：，攪拌速率220~400印111，？田空制在7.0~7.5，培養24~ 32h得發酵液； (2) 粗酶液的制備:將步驟(1)所得短桿菌發酵液離心，過濾制得菌絲體;將菌體細胞加 入去離子水中，制得質量濃度為35~45%的細胞懸浮液；用KQ-1001型超聲機超聲破碎，得 含有延胡索酸酶的混合物； (3) 雙水相萃取劑的制備：向無機鹽水溶液中添加聚乙二醇，并不斷攪拌混合均勻，制 得聚乙二醇-無機鹽雙水相體系溶液;其中雙水相體系中無機鹽的質量百分比為5~15%， 聚乙二醇的質量百分比為15~20% ; (4) 雙水相萃取:將步驟(2)得到的粗酶液調節pH至8.0~8.5,加入步驟(3)中聚乙二 醇-無機鹽雙水相體系溶液，雙水相體系溶液與粗酶液的體積比為1: (1.5~2.0)，震蕩萃 取;靜止待分層后，分別得無機鹽下相溶液和含有延胡索酸酶的聚乙二醇上相溶液； (5) 二次萃取:將步驟(4)制得的聚乙二醇上相溶液調節pH至6.5~7.0,加入無機鹽，使 無機鹽在總體系中的質量百分比為2~4%;震蕩萃取，靜止待分層后，分別得含有延胡索酸 酶的無機鹽下相溶液和聚乙二醇上相溶液； (6) 將步驟(5)制得的含有延胡索酸酶的無機鹽下相溶液，透析除鹽，冷凍干燥，制得延 胡索酸酶。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)中種子培養基組分為：葡萄糖 15~20g/L，酵母浸粉 1.0~5.0g/L，玉米漿20~35g/L，MgS〇4 · 7H20 0.3~0.7g/L，控制pH 7.0~7.5。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)中發酵培養基包括下述組分： 葡萄糖 15~20g/L，酵母浸粉 1.0~5.0g/L，玉米衆20~35g/L，MgS〇4 · 7H2〇 0.3~0.7g/L，氯 化鈉2~5g/L，KH2P〇4 2~4g/L。5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中離心轉速為6000~8000r/min， 離心時間為15~25min。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)、（4)和(5)中的聚乙二醇分子量 均為1000、1500或2000任意一種;無機鹽選自硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鈉或磷酸氫 二鉀任意一種。7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(4)和(5)中的靜置分相時間均為20 ~40min〇8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（6)中透析選用分子量8000~ lOOOODa的透析袋。
【專利摘要】本發明涉及一種短桿菌及從短桿菌發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法，菌種的拉丁學名是Brevibacterium？sp.，參據的微生物：NJWGY2133，保藏日期為2008年5月26日，保藏中心登記入冊編號為CGMCC？No.2520。分離提純延胡索酸酶方法的具體步驟為：經過短桿菌發酵液培養、超聲破碎制得粗酶液、聚乙二醇-無機鹽雙水相萃取體系的配制；雙水相萃取分離；透析除鹽，冷凍干燥，制得延胡索酸酶。本發明工藝簡單，生產周期短，操作條件溫和，成本低，可從微生物中獲得高純度的酶，且酶活回收率在90％以上。CGMCC No.252020080526
【IPC分類】C12R1/13, C12N1/20, C12N9/88
【公開號】CN105647834
【申請號】
【發明人】胡永紅, 曹翠翠, 楊文革, 曹洋, 吳剛, 王春曉, 章泳
【申請人】南京工業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月14日