一種利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養技術，特別提供了一種利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法。
【背景技術】
[0002]星形膠質細胞是中樞神經系統中體積最大、數量最多、分布最廣的一種膠質細胞，具有大量的放射狀突起。星形膠質細胞在神經發育、突觸形成、血腦屏障構建、能量代謝等多個方面發揮決定性作用，對維持腦內穩態與神經元的正常功能至關重要。
[0003]星形膠質細胞存在靜息態和激活態兩種狀態。當神經系統受到各種有害因素，如低氧、外傷、炎癥等損傷刺激后，星形膠質細胞從靜息態轉化為激活態，成為活化星形膠質細胞。活化膠質細胞的作用為“雙刃劍”。一方面，活化的膠質細胞迅速迀移并包圍損傷區域，避免損傷范圍的進一步擴大；此外，還可分泌多種營養因子保護多巴胺能神經元，例如，NGF、BDNFn GDNF、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)等。另一方面，活化膠質細胞的反應性增生形成的膠質瘢痕對于神經系統損傷后軸突再生起嚴重阻礙作用。當再生的神經軸突遇到膠質瘢痕時，會形成一種萎縮的末端小球狀結構，后者不能再伸展形成生長錐，從而使再生的神經軸突停滯在膠質瘢痕處，影響神經軸突的生長。
[0004]目前既有的激活神經膠質細胞的方法如機械損傷、低氧、炎癥因子刺激等，均無法避免激活帶來的反應性膠質瘢痕的形成。因此，開發一種激活神經膠質細胞后即可發揮其促神經再生的作用又限制其反應性增生的新技術，具有重大的應用前景。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種簡便的通過凸凹不平的表面微結構激活神經膠質細胞的方法，該方法獲得的神經膠質細胞既可發揮其促神經再生的作用又能限制膠質瘢痕的形成。
[0006]本發明是通過下述技術方案得以實現的:
[0007]—種利用培養物表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，具體步驟如下
[0008](I)采用濕法刻蝕等微加工方法，獲得帶有凸凹不平的微米級表面微結構的模板，用PDMS澆筑后固化，將其揭下后獲得帶有凸凹不平微結構的PDMS細胞培養表面；
[0009](2)采用原代培養的神經膠質細胞為激活對象，待細胞生長至細胞融合，將細胞用
0.25%胰酶消化后制成細胞懸液，
[0010](3)將細胞懸液添加至微結構表面，細胞貼壁后培養1-14天；
[0011](4)從上述方法獲得的星形神經膠質細胞經鑒定表現為細胞發生EMT轉化、細胞干性增強、葡萄糖轉運增強等一系列激活表現。
[0012]所獲得的凸凹不平微結構PDMS表面特征如下:表面帶有陣列式形狀規則的微凹陷或微凸起，其形狀可為圓形、方形、五邊形、六邊形、橢圓、三角形、直線、曲線或這些形狀的組合體。
[0013]所述微凹陷與其周邊隆起之間的高度差為5?100 μ m，邊緣隆起的寬度為O?50 μ mD
[0014]所述所述的陣列式形狀規則的微凹陷，其形狀的邊長為5?100 μm0
[0015]所述帶有表面微結構的模板材質為娃板、玻璃或SU-8 ；
[0016]所述帶有微結構的細胞培養表面，其材質可以為PDMS、PMMA、聚苯乙烯、PLGA、殼聚糖或其他多種高分子材料。
[0017]所述獲得的星形神經膠質細胞在14天內具有EMT轉化、細胞干性增強、葡萄糖轉運增強等一系列激活表現。
[0018]所產生的活化星形神經膠質細胞用于神經系統外傷及缺血缺氧性腦病的治療。
[0019]所產生的活化星形神經膠質細胞用于帕金森及阿爾茨海默病的治療。
[0020]采用濕法刻蝕等微加工方法，獲得帶有凸凹不平的微米級表面微結構的模板，將Sylgard 184單體和引發劑Silicone Ela Stomer按體積比10:1混合均勾，饒筑于模板上，800C 30分鐘后PDMS固化。用鑷子將PDMS揭下，將帶有微結構的一面朝上放入培養皿中，利用PDMS本身的黏性將其固定于培養皿底部。紫外照射過夜滅菌。
[0021]從上述方法獲得的星形神經膠質細胞經鑒定表現為細胞發生EMT轉化、細胞干性增強、葡萄糖轉運增強等一系列激活表現。EMT轉化具體表現為細胞內波形蛋白表達增加，b-連環蛋白向細胞核內發生轉位。細胞干性增強表現為S0X-2及0CT-4表達增加。葡萄糖轉運增強表現為葡糖糖轉移酶GLUT-1表達增加。
[0022]本發明提供的利用表面微結構激活神經膠質細胞的方法，所述細胞包括原代提取的哺乳類神經膠質細胞，也包括永生化的神經膠質細胞系。
[0023]本發明的優點是可以利用培養物表面物理微結構激活神經膠質細胞，且可以避免形成膠質細胞反應性增生導致的膠質瘢痕。本發明在神經系統損傷性及退行性疾病的治療中具有廣闊應用前景。
【附圖說明】
[0024]圖1帶有正六邊形凹陷陣列微結構的PDMS芯片電鏡圖
[0025]圖2邊長30 μπι正六邊形凹表面微結構促進神經膠質細胞波形蛋白表達以及b-連環蛋白核轉位；其中IPDMS平表面培養的神經膠質細胞表達的b-連環蛋白主要位于細胞膜上，在細胞周邊呈連續性表達；2邊長30 μ m正六邊形凹表面培養的神經膠質細胞表達的b-連環蛋白主要位于細胞質及細胞核中。
[0026]圖3與PDMS平表面相比，邊長30 μ m正六邊形凹表面微結構可促進神經膠質細胞S0X-2 及 0CT-4 表達；
[0027]圖4與PDMS平表面相比，邊長30 μ m正六邊形凹表面微結構可促進神經膠質細胞GLUT-1 表達；
[0028]圖5與PDMS平表面相比，邊長30 μ m正六邊形凸表面微結構可促進神經膠質細胞波形蛋白及S0X-2表達；
【具體實施方式】
[0029]下面的實施例將對本發明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發明。
[0030]實施例1
[0031]利用計算機輔助設計和濕法刻蝕方法，制作邊長為30 μπι的正六邊形凸表面膜板，正六邊形之間距離為5 μπι，凸表面與凹槽之間的高度差為60 μπι。將PDMS單體和引發劑按10:1的比例混合均勻，澆筑于模板上進行反膜，80°C 30分鐘后PDMS固化。用鑷子將PDMS揭下，獲得帶有凹表面正六邊形微結構的PDMS芯片(見圖1)。將帶有微結構的一面朝上放入培養皿中，利用PDMS本身的黏性將其固定于培養皿底部。紫外照射過夜滅菌。
[0032]原代提取新生24h乳鼠大腦皮層星形神經膠質細胞，去除雜細胞后待細胞生長至融合，將細胞用0.25%胰酶消化后制成細胞懸液，將細胞懸液添加至PDMS微結構表面，置入培養箱中貼壁培養1-14天。對凹表面上生長的神經膠質細胞進行鑒定，結果顯示細胞發生EMT轉化、細胞干性增強、葡萄糖轉運增強等一系列激活表現。細胞內波形蛋白表達增加，b-連環蛋白向細胞核內發生轉位(見圖2)，干性相關蛋白S0X-2及0CT-4表達增加(見圖3)，葡糖糖轉移酶GLUT-1表達增加(見圖4)。
[0033]實施例2
[0034]制作邊長為30 μ m的正六邊形凹表面膜板，正六邊形之間距離為5 μ m，凹表面與周圍凸起的邊框之間的高度差為60 μπι。用PDMS反膜后獲得帶有凸表面正六邊形微結構的PDMS芯片。將帶有微結構的一面朝上放入培養皿中，利用PDMS本身的黏性將其固定于培養皿底部。紫外照射過夜滅菌。
[0035]將原代提取的乳鼠星形神經膠質細胞懸液添加至PDMS微結構表面，置入培養箱中貼壁培養1-14天。對凸表面上生長的神經膠質細胞進行鑒定，結果顯示細胞發生了與凹表面相似的變化，細胞內波形蛋白及干性相關蛋白S0X-2表達均增加(圖5)。
【主權項】
1.一種利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下: (1)采用濕法刻蝕等微加工方法，獲得帶有凸凹不平的微米級表面微結構的模板，用PDMS澆筑后固化，將其揭下后獲得帶有凸凹不平微結構的PDMS細胞培養表面； (2)采用原代培養的神經膠質細胞為激活對象，待細胞生長至細胞融合，將細胞用0.25%胰酶消化后制成細胞懸液； (3)將細胞懸液添加至微結構表面，細胞貼壁后培養1-14天； (4)從上述方法獲得的星形神經膠質細胞經鑒定表現為細胞發生EMT轉化、細胞干性增強、葡萄糖轉運增強等一系列激活表現。2.按照權利要求1所述的利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于所獲得的帶有凸凹不平微結構的PDMS表面特征如下:表面帶有陣列式形狀規則的微凹陷或者微凸起，其形狀可為圓形、方形、五邊形、六邊形、橢圓、三角形、直線、曲線或這些形狀的組合體。3.按照權利要求2所述的利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于所述微凹陷與其周邊隆起之間的高度差為5?100 μm，邊緣隆起的寬度為O?50 μm。4.按照權利要求2所述的利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于所述所述的陣列式形狀規則的微凹陷，其形狀的邊長為5?100 μπι。5.按照權利要求1所述的利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于所述帶有表面微結構的模板材質為硅板、玻璃或SU-8 ;所述帶有微結構的細胞培養表面，其材質可以為PDMS、ΡΜΜΑ、聚苯乙烯、PLGA、殼聚糖或其他多種高分子材料。6.按照權利要求1所述的利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于其中所述獲得的星形神經膠質細胞在14天內具有EMT轉化、細胞干性增強、葡萄糖轉運增強等一系列激活表現。7.按照權利要求1所述的利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于所產生的活化星形神經膠質細胞用于神經系統外傷及缺血缺氧性腦病的治療。8.按照權利要求1所述的利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，其特征在于所產生的活化星形神經膠質細胞用于帕金森及阿爾茨海默病等神經退行性疾病的治療。
【專利摘要】本發明提供一種利用表面微結構激活星形神經膠質細胞的方法，屬細胞培養技術領域，具體步驟為：(1)獲得帶有凸凹不平微結構的PDMS細胞培養表面；(2)采用原代培養的神經膠質細胞為激活對象，待細胞生長至細胞融合，將細胞用0.25％胰酶消化后制成細胞懸液，(3)將細胞懸液添加至微結構表面，細胞貼壁后培養1-14天；(4)從上述方法獲得的星形神經膠質細胞經鑒定表現為細胞發生EMT轉化、細胞干性增強、葡萄糖轉運增強等一系列激活表現。本發明的優點是可以利用培養物表面物理微結構激活神經膠質細胞，且可以避免形成膠質細胞反應性增生導致的膠質瘢痕。本發明在神經系統損傷性及退行性疾病的治療中具有廣闊應用前景。
【IPC分類】A61K35/30, A61P25/00, A61P9/10, C12N5/079, A61P25/28, A61P25/16
【公開號】CN105647868
【申請號】
【發明人】秦建華, 張敏, 張旭, 許慧
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年12月4日