誘導樹突狀細胞成熟的方法和樹突狀細胞的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及組織工程領域，特別涉及一種誘導樹突狀細胞成熟的方法和樹突狀細 胞。
【背景技術】
[0002] 細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補了傳 統的手術、放療、化療的弊端，已經被公認為二十一世紀腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有 發展前途的一種治療手段，也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細胞的治療手段。
[0003] 細胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細胞，經過體外培養，使其數量成千倍增 多，靶向性殺傷功能增強，然后再回輸到人體來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變 的細胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前在 臨床中使用最多的細胞免疫治療療法主要是DC治療、CIK治療和DC-CIK聯合免疫治療。
[0004] DC是目前發現的功能最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)， 一方面，其能夠刺激初始的T細胞增殖，啟動免疫應答;另一方面，樹突狀細胞還能夠呈遞抗 原給MHC-I類限制性CD8+和MHC-II類限制性CD4+T淋巴細胞，誘導特異性免疫反應，被稱為 "天然免疫佐劑"，因此，樹突狀細胞在誘導免疫應答中具有獨特的地位。
[0005] 近年來，以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為基礎的腫瘤免疫治療及DC疫苗已 取得較大進展，體外制備的DC疫苗顯示出明顯誘發抗腫瘤免疫應答的能力，具有良好的臨 床應用前景。目前，從外周血單個核細胞(PBMC)經GM-CSF、IL-4體外誘導培養DC的方法已基 本得到公認，但DC體外促成熟的方案尚沒有統一的標準，國內主要采用TNF-a因子，但該方 法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培養得到的DC功能缺陷，很大程度 上限制了DC疫苗的臨床應用工作的開展。因此，有必要對現有DC細胞培養方案進行進一步 完善，以有效提高DC疫苗在誘導抗炎或抗腫瘤免疫應答中的作用。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術培養出的樹突狀細胞體外誘導成熟 率低，細胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一種能夠提高樹突狀細胞成熟率及抗 原提呈性能的誘導樹突狀細胞成熟的方法。
[0007] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:提供一種誘導樹突狀細胞成熟的方 法，包括以下步驟：
[0008] 獲取樹突狀細胞前體單個核細胞，經第一誘導劑培養4~7天，每隔2~3天更換培 養基，獲得未成熟樹突狀細胞；
[0009] 然后，再添加第二誘導劑培養所述未成熟樹突狀細胞2~4天至樹突狀細胞成熟；
[0010] 其中，第一誘導劑包括:rhGM-CSF、GM-CSF、IL-4、rhIL-4和IL-13;
[0011] 第二誘導劑包括rhTNF-α、沒食子酸或核桃青皮提取物。
[0012] 在本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法中，所述第一誘導劑中，rhGM-CSF的 濃度為 800 ~1200U/ml、GM-CSF 的濃度為 5 ~15ng/mL、IL-4 的濃度為 5 ~15ng/mL、rhIL-4 的 濃度為800~1200U/ml和IL-13的濃度為5~15ng/mL。
[0013] 在本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法中，所述第一誘導劑中，rhGM-CSF的 濃度為 l〇〇〇U/ml、GM-CSF 的濃度為 10ng/mL、IL-4 的濃度為 10ng/mL、rhIL-4 的濃度為 1000U/ ml和IL-13的濃度為10ng/mL。
[0014] 在本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法中，所述第二誘導劑中，rhTNF-α的濃 度為800~1200U/ml、沒食子酸5~15μg/ml，或核桃青皮提取物的濃度為10~30μg/ml。 [0015]在本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法中，所述第二誘導劑中，rhTNF-a的濃 度為1000U/ml、沒食子酸10μg/ml，或核桃青皮提取物的濃度為20μg/ml。
[0016] 在本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法中，所述樹突狀細胞前體單個核細胞 來源于外周血。
[0017] 在本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法中，所述樹突狀細胞前體單個核細胞 的獲取過程，包括以下步驟：
[0018] 抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血 單個核細胞;用完全培養基懸浮細胞濃度至(2~6) X 106個/ml，孵育1~3小時，更換新的完 全培養基，收集細胞懸液，即為樹突狀細胞前體單個核細胞懸液。
[0019] 在本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法中，所述完全培養基中含有10%~ 15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素。在本發明提供的誘導樹突狀 細胞成熟的方法中，還包括以下步驟:添加所述第一誘導劑之前，需調節所述樹突狀細胞前 體單個核細胞濃度為(1~3) X106個/ml。
[0020] 本發明還提供一種樹突狀細胞，是由上述誘導樹突狀細胞成熟的方法所獲得的。
[0021] 實施本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法，可以達到以下有益效果：與現有 培養樹突狀細胞的方式相比，本發明通過第一誘導劑和第二誘導劑對樹突狀細胞進行兩個 階段的誘導活化，促進提高樹突狀細胞的細胞活性，提高樹突狀細胞的增值率及成熟率，進 而提尚樹突狀細胞的抗原提呈性。
【具體實施方式】
[0022] 本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法，包括以下步驟：
[0023] S1、獲取樹突狀細胞前體單個核細胞；
[0024] S2、采用第一誘導劑將樹突狀前體細胞當個核細胞誘導分化成未成熟樹突狀細 胞；
[0025] S3、采用第二誘導劑將未成熟樹突狀細胞誘導分化成成熟的樹突狀細胞。
[0026] 具體地，步驟S1中，優選地，樹突狀細胞前體單個核細胞來源于新鮮外周血，相比 經過冷庫儲存或者培養傳代之后的樹突狀細胞，從新鮮血液中制備的樹突狀細胞前體單個 核細胞離體時間較短，其細胞活性和狀態的減弱或者形態改變程度都較少，更加利于保持 其免疫性能。在本發明中，樹突狀細胞前體單個核細胞的具體獲取過程為：
[0027]抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血 單個核細胞；
[0028] 用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素的完全 培養基懸浮細胞濃度至(2~6) X106個/ml，孵育1~3小時，更換新的完全培養基，收集細胞 懸液，即為樹突狀細胞前體單個核細胞懸液。
[0029]步驟S2的具體過程為：
[0030] 取步驟S1獲得的樹突狀細胞前體單個核細胞懸液，離心洗滌后計數，使細胞濃度 達到（1~3) X106個/ml，用完全培養基培養，并與培養當天添加第一誘導劑，培養4~7天， 每隔2~3天更換培養基。
[0031] 其中，第一誘導劑包括rhGM_CSF(Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，重組人粒-巨細胞集落刺激因子）、GM_CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，粒-巨細胞集落刺激因子）、IL_4( Interleukin 4,白細胞介素 4)、rhIL_4(Recombinant human interleukin 4,重組人白細胞介素 4)和IL-13(Interleukin 13,白細胞介素 13);其中，rhGM-CSF的終濃度為800~1200U/ml、GM-CSF的 終濃度為5~15ng/mL、IL-4的終濃度為5~15ng/mL、rhIL-4的終濃度為800~1200U/ml和 IL-13的終濃度為IL-13的濃度為5~15ng/mL。
[0032] 第一誘導劑所含成分能夠誘導樹突狀細胞前體單個核細胞轉化為未成熟的樹突 狀細胞，增大細胞體積，并促進細胞的生長增殖和分化，促進細胞形成集落；同時，對已分化 的未成熟樹突狀細胞進行預刺激，使未成熟樹突狀細胞能夠快速成熟。
[0033] 步驟S3的具體過程為：
[0034] 向步驟S2a獲得的未成熟樹突狀細胞中添加第二誘導劑培養2~4天至未成熟的樹 突狀細胞全部成熟；其中，第二誘導劑包括rhTNF_a(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重組人腫瘤壞死因子α)、沒食子酸或核桃青皮提取物;且rhTNF-α的終濃度為800 ~1200U/ml、沒食子酸的終濃度為5~15μg/ml或核桃青皮提取物的終濃度為核桃青皮提取 物的濃度為10~30μg/ml。
[0035] 其中，rhTNF-α能夠刺激樹突狀細胞成熟，以提高樹突狀細胞抗原提呈能力。而核 桃青皮提取物的主要成份包括沒食子酸、甲醇、石油醚、氯仿、正丁醇等，對金黃色葡萄球菌 等細菌具有強抗菌作用，并且對真菌也有明顯抑制作用；另外，還能夠清除自由基，具有較 強的抗氧化活性，以提高樹突狀細胞的細胞活性，促進其成熟和正常的生長增殖。
[0036] 基于本發明的上述誘導樹突狀細胞成熟的方法，本發明還提出一種由上述方法制 備得到的樹突狀細胞。
[0037] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限 定本發明。
[0038] 實施例1
[0039] 本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法，包括以下步驟：
[0040] Sla、獲取樹突狀細胞前體單個核細胞；
[0041]抽取外周靜脈血3-5ml，生理鹽水1:1稀釋，然后沿管壁緩緩加入到3~5ml比重為 1 ·077±0 .OOlg/ml的Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液上，1500r/min離心15分鐘，分離獲取 外周血單個核細胞，用含10 %胎牛血清、100