一種人肺腺癌細胞株ha1221及其建立方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于細胞生物學技術領域，具體地說，本發明涉及一種新的人肺腺癌細胞株HAl 221及其建立方法。
【背景技術】
[0002]體外建立肺癌細胞系為研究腫瘤的基礎和臨床研究提供了極其重要的細胞實驗模型。但是隨著實驗的不斷開展，常需要對細胞系進行不斷的體外傳代，于是一些生物學特征會漸漸的改變或消失，所以不斷建立新的細胞系已經成為研究肺癌的發病機理和探尋新的治療方法的重要環節。
[0003]原代細胞的培養難易程度與取材時的組織類型、分化程度、年齡等密切相關，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養。
[0004]現有技術大多采用手術中切除的早中期病人腫瘤組織進行原代培養，包括直接將組織進行消化培養或是將病人腫瘤組織移植至小鼠體內，待成瘤后，再取出小鼠腫瘤組織進行消化培養。
[0005]胸水細胞的主要成分為淋巴細胞、粒細胞、樹突狀細胞、少量脫落的上皮細胞、成纖維細胞及腫瘤細胞等，成分相對較為復雜，胸腔積液中的腫瘤細胞屬于高分化的成熟細胞，比較脆弱，一般而言比較難培養。但是相對于原發腫瘤灶，胸水取材容易，如果能建立穩定的培養體系，對肺癌原代細胞的建立有很大的推廣意義。
【發明內容】
[0006]基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種新的人肺腺癌細胞株HAl 221及其建立方法。
[0007]為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案:
[0008]—種人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法，包括以下步驟:
[0009](I)、去除中晚期肺癌病人胸腔積液中的血塊，離心后得到上清液和沉淀；
[0010](2)、將步驟(I)的沉淀用兩倍體積的PBS重懸，再按1:1的體積比緩慢貼壁加入到人外周血淋巴分離液的液面上，離心；
[0011 ] (3)、小心吸取分離液面交界處的液體，得到腫瘤細胞和部分上皮細胞、內皮細胞，無菌PBS清洗，離心棄上清；
[0012](4)、使用含0.5?2wt%的青-鏈雙抗的步驟(I)的上清液作為條件培養基培養步驟(3)的細胞；
[0013](5)、待細胞長滿時，用0.25?0.5wt%的胰酶消化，離心后，用PBS將沉淀重懸成細胞懸液;所述PBS與沉淀的體積比為2?3:1;
[0014](6)、預先在干凈離心管中依次緩慢貼壁加入40%的比重為1.056的percoll液和20%的比重為1.031的口6代011液；
[0015](7)、將步驟(5)的細胞懸液緩慢貼壁加入到步驟(6)的離心管中，離心；
[0016](8)、吸取40 %的per CO 11液面處的液體，無菌PBS清洗，離心棄上清，得到腫瘤細胞，使用步驟(4)中的條件培養基進行培養；
[0017](9)、重復步驟(4)-(8)—次，然后進行細胞傳代，傳代時，步驟(4)的條件培養基的上清液的比例每次減少20%，再相應增加20%含10 %胎牛血清的DMEM培養基，到第五代時條件培養基為加青-鏈雙抗的10 %胎牛血清的DMEM培養基；
[0018](10)、將傳代五次后的細胞注射小鼠成瘤，殺小鼠取腫瘤并消化，得到原代人肺腺癌細胞株HA1221。
[0019]在其中一些實施例中，步驟(2)所述人外周血淋巴分離液的比重為1.077。
[0020]在其中一些實施例中，步驟(I)所述離心是在4°C 1000rpm/min離心1min;步驟(2)所述離心是在20 °C 1350rpm/min升速5，降速O，水平離心25分鐘；步驟(7)所述離心是在20°C2000rpm/min，升速5，降速O，水平離心25分鐘。
[0021]在其中一些實施例中，步驟(4)的青-鏈雙抗的含量為lwt%
[0022]在其中一些實施例中，步驟(4)中置于37°C、5%C02的細胞培養箱中培養細胞。
[0023]在其中一些實施例中，步驟(5)中所述PBS與沉淀的體積比為2:1。
[0024]本發明還提供了上述建立方法建立的人肺腺癌細胞株HA1221。
[0025]本發明創建了一種從中晚期病人的癌性胸腔積液中分離純化腫瘤細胞進行培養并建系的方法。分離得到活力高的腫瘤細胞后，用胸腔積液加培養基進行培養，每次傳代，利用上皮和內皮細胞容易脫落，而腫瘤細胞貼壁更牢固的特點，丟棄先脫落的細胞，剩下腫瘤細胞進行培養，逐步剔除內皮和上皮細胞。本發明通過以下幾個特殊的處理實現了本發明的發明目的:
[0026]1、本發明的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法中分離腫瘤細胞時采用了兩次雙密度梯度離心法，第一次雙密度梯度離心法，得到含量較高的腫瘤細胞和部分成纖維細胞及內皮細胞，由于成纖維細胞通常比腫瘤細胞生長更快，導致腫瘤細胞生長抑制甚至死亡，因此本發明利用反復貼壁法剔除成纖維細胞和內皮細胞，再次采用雙密度梯度離心法，分離除去凋亡和死亡細胞，得到活力高的腫瘤細胞；
[0027]2、由于成熟腫瘤細胞在體外培養條件與體內環境變化劇烈，細胞不容易適應，容易造成生長緩慢甚至死亡，因此本發明采用了在培養初期，用自體胸腔積液加二抗為主的條件培養基，使細胞適應生長環境，視長出的細胞量適當加大含10%胎牛血清的DMEM量，逐步過渡到細胞穩定生長時不加胸腔積液上清；
[0028]3、為了得到活力高的腫瘤細胞，本發明將培養的腫瘤細胞接種至裸鼠中，通過裸鼠體內的自然篩選，那些生長能力較強的細胞群體(腫瘤細胞)繼續生長存活，相對生長能力較弱的群體(包括人成纖維細胞及內皮細胞)就會慢慢丟失，再將裸鼠體內的移植瘤取出作原代細胞培養，從而得到本發明所需要的高活力的原代人肺腺癌細胞。
[0029]本發明所述的人肺腺癌細胞株HA1221已在中國典型培養物保藏中心(中國，武漢，武漢大學)保藏，保藏日期為2016年I月28日，保藏編號為CCTCC No:C201618。
[0030]與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點:
[0031]由于中晚期肺癌病人的組織標本一般難以獲得，成熟的高分化腫瘤細胞較難體外培養，本發明從比較容易獲得又不為病人帶來痛苦的胸腔積液中分離純化高分化的腫瘤細胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更簡單方便且成功率大大提高。
【附圖說明】
[0032]圖1為160X光學顯微鏡下，細胞稀疏與密集生長的狀態圖；
[0033]圖2分別為15000X和30000X透射電鏡下的細胞內部結構圖，其中2-1中，A為胞核，B為自噬體，C為核仁;2-2中，A為胞核，B為胞核，C為核仁，D為線粒體;2_3中，A腔內的微絨毛;B線粒體;C內漿網；
[0034]圖3分別為500X掃描電鏡下的細胞生長情況圖和4000 X掃描電鏡下的細胞表面結構圖；
[0035]圖4分別為流式細胞儀檢測細胞周期結果圖和細胞周期各階段DNA含量圖；
[0036]圖5為染色體核型分析結果；
[0037]圖6為細胞生長曲線圖；
[0038]圖7分別為克隆形成圖和克隆形成率圖；
[0039]圖8為HA1229細胞體外成瘤能力檢測圖。
【具體實施方式】
[0040]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，所采用的技術手段通常為本領域技術人員所熟知的常規手段。[0041 ]本發明的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法的主要流程為:
[0042]胸腔積液—人外周血淋巴分離液—得到腫瘤細胞和部分上皮細胞、內皮細胞用胸腔積液加培養基進行培養—雙密度梯度離心得到活力高的腫瘤細胞—反復貼壁法—剔除內皮及上皮細胞—逐步減少胸腔積液比例—直接用含胎牛血清的培養基培養—培養細胞注射小鼠成瘤—殺小鼠取腫瘤并消化—活力好的原代腫瘤細胞。
[0043]實施例1人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法
[0044]包括以下具體步驟:
[0045](1)、將中晚期肺癌病人的胸腔積液過ΙΟΟμπι濾網除去血塊，4°C1000rpm/min離心I Omin得到上清液和沉淀，將上清液吸出另外保存；
[0046](2)、在離心管中準備人外周血淋巴分離液(LTS1077，天津灝洋，比重為1.077)，將步驟I的沉淀用兩倍體積的PBS重懸，