r>[0045] PCR反應如下表：
[0046] 表 1
[0047]
[0048] PCR反應3后回收長度約4000bp的片段，swal和ppuMI酶切處理PCR產物及 PCDNA3. 1-LBNSE并進行連接、轉化，挑取陽性克隆，測序鑒定，測序引物為Tsp: GAGCAATATAACAAAAAACATG 〇
[0049] 1.3重組病毒LBNSE-DCBp的拯救
[0050] 參見文獻（Wen Y,Wang H，Wu H, Yang F,Tripp RA，et al · (2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination. J Virol 85:1634-1 ·) 〇具體如下：車專染前一 天將BSR細胞接種于六孔板，使細胞于第二天使用時達到80%的覆蓋度，按照轉染試劑 Superfect(QIAGEN公司）的產品說明說進行操作，將2ug的全長感染性克隆，0.5ug N輔助質 粒，0.25ug P輔助質粒，0.15ug G輔助質粒以及O.lug L輔助質粒共同轉染BSR細胞，轉染后 的細胞放入37°C培養箱，⑶2濃度為5%，孵育4小時，然后將上清倒掉，用含10%FBS的DMEM 培養基洗一次，再加入新鮮培養基培養。轉染后4天，7天移去舊的培養基，更換新鮮培養基， 并從第7天開始檢測病毒拯救結果。
[0051 ] 1.4拯救病毒的鑒定
[0052]將拯救的病毒與BSR細胞于96孔細胞板共培養48小時后，將上清棄掉，用預冷的 80 %丙酮于4 °C固定30分鐘，然后用PBS洗2遍，將異硫氰酸熒光素 （Fluoresce in isothiocyanate，FITC)標記的狂犬病毒核蛋白單克隆抗體(購于Fujirebio公司）進行1: 125稀釋，每孔加入50ul，放入37°C孵育1小時后用PBS洗三遍，在熒光顯微鏡（Leica DMIRES)進行觀察。
[0053] 1.5病毒滴定
[0054]取96孔細胞培養板，以4行X 9列為一個樣品區，每板兩個分區，將每個孔內加入90 μL的含10 %FBS的DMEM細胞培養液，每個樣品設4個重復，將10μ1的病毒原液加入到96孔細 胞板的第一列，充分混合后吸取1〇μ1混合液到第二列，充分混勻，再吸出l〇ul混合液到下一 列，依次連續進行10倍的倍比稀釋，至第9列孔后棄掉10μ1的混合液。每孔加入5X10 4的BSR 細胞后于37°C，5 %C02培養48h，然后棄細胞上清液，用80 %冷丙酮固定感染細胞。以抗狂犬 病毒N蛋白焚光抗體(FITC-conjugated anti-RV N antibodies)染色后，通過焚光顯微鏡 觀察并記錄抗原陽性區域(Antigen-positive foci)。根據Reed-muench法進行病毒毒力的 計算并記錄為FFU/ml(Fluorescent focus units per milliliter) 〇
[0055] 1.6重組病毒LBNSE-DCBp在BSR細胞上的生長特性
[0056] 將病毒以感染復數為0.01 (Μ0Ι = 0.01)感染BSR細胞，分別在感染后第1天，第2天， 第3天，第4天及第5天取50μ1的上清液，進行病毒滴定，記錄病毒在不同時間點的滴度，并繪 制出生長曲線。
[0057] 1.7體外驗證DCs的激活
[0058] 從6-8周齡此行Balbc小鼠的大腿骨中取BMC(骨髓細胞）以2 X105的密度重懸于含 有20ng/ml鼠 GM-CSF的10 %的1640培養基中，并于5 %⑶2的37°C溫箱中培養。培養的1，3，5 天半換液，于第7天收集全部細胞，按1 X 106鋪于12孔板中。24h后按照Μ0Ι = 1的比率感染 LBNSE，LBNSE-DCBp和LBNSE-DCCp，LPS作為陽性對照。感染后24小時，收集細胞，流式檢測 ⑶1 lc，⑶86和⑶80，比較各組DCs激活的比例及平均熒光強度。
[0059] 1.8動物實驗
[0060] 1.8.1重組病毒LBNSE-DCBp致病性實驗
[0061 ] 將6-8周齡的ICR小鼠，每組10只，分別用40μ1的DMEM或者1 X 107FFU的重組病毒 LBNSE，以腦內注射（i . c.)的方式進行感染，觀察每天觀察兩次，記錄小鼠的臨床發病及死 亡情況。
[0062] 1.8.2小鼠免疫試驗
[0063] 將6-8周齡的Balbc小鼠，每組6只，分別用無菌注射器將100ul含有1X106FFU的 LBNSE毒株和1 X 106FFU的重組病毒株LBNSE-DCBp進行大腿肌肉注射免疫或口服免疫，并分 另IJ于免疫后第2周、第3周、第4周、第5周、第6周進行采血測定中和抗體水平。
[0064] 1.8.3小鼠保護率實驗
[0065] 將6-8周齡的ICR小鼠，每組11只，免疫后21天，經腦感染狂犬病毒強毒株CVS24,感 染后每天記錄觀察小鼠的發病及死亡情況，統計各組疫苗對小鼠的保護率。
[0066] 2.實驗結果
[0067] 2.1感染性克隆LBNSE-DCBp的構建及拯救病毒檢測
[0068] LBNSE毒株是在SAD-B19的基礎上在G基因194位和333位進行突變，并且將G和L基 因之間的假基因敲除，加入兩個酶切位點BsiWI和Nhel。重組病毒LBNSE-DCBp或LBNSE-DCCp 是在LBNSE病毒的基礎上，將DCBP或者DCCP(對照）小肽按照圖1所示的策略PCR擴增后連入 到G基因信號肽序列之后（圖2)，利用反向遺傳技術拯救病毒，拯救的病毒用免疫熒光實驗 進行檢測，可以看到綠色的焚光灶。另外，為了檢測DCBp基因是否已插入到拯救的病毒中， 將拯救的病毒感染BSR細胞后，提取RNA進行反轉錄PCR檢測，檢測引物TSP設計在信號肽序 列前，使用引物Tsp進行測序驗證。
[0069] 2.2病毒的體外生長特性
[0070]為了研究DCBp基因的插入是否影響狂犬病毒自身的復制及增殖，將LBNSE毒株和 LBNSE-DCBp毒株感染BSR，并且于不同時間點測定其病毒的滴度，繪制出病毒的生長曲線 (圖3)，可以觀察到重組病毒LBNSE-DCBp和病毒LBNSE具有相似的生長曲線，這表明外源基 因 DCBp基因的插入并未影響病毒的復制和增殖，并且最高滴度與母本病毒也相差不大。重 組病毒LBNSE-DCBp在BSR細胞上達到的最高滴度為1 X 107.5FFU/ml在感染后第4天達到滴度 最高值。感染體外培養的樹突狀細胞，LBNSE-DCBp可以激活更多的樹突狀細胞(圖5)。
[0071] 2.3重組病毒致病性及肌肉免疫后中和抗體產生
[0072] 重組病毒LBNSE-DCBp腦內注射6-8周齡的ICR小鼠中，觀察2周，并記錄體重（圖4)。 期間并未出現任何發病癥狀，且體重影響不大，說明重組病毒對小鼠無致病性。
[0073] 2.4重組病毒免疫效果評價
[0074] 將重組病毒LBNSE-DCBp、LBNSE-DCCp或者LBNSE毒株分別肌肉免疫Balb/c小鼠，于 免疫后2周，3周，4周，5周和6周采血測定中和抗體滴度。誘導高的中和抗體水平是預防狂犬 病的有效手段，因此，中和抗體的測定作為狂犬病疫苗效果評價的方法。如圖6所示，重組病 毒LBNSE-DCBp誘導的中和抗體水平要顯著高于LBNSE毒株，在免疫后第4周中和抗體水平最 尚。
[0075] 將重組病毒LBNSE-DCBp、LBNSE-DCCp和LBNSE按1 X 106FFU的劑量肌肉或口服免疫 6-8周齡ICR小鼠，免疫后21天，經腦感染狂犬病毒強毒株CVS24,感染后每天記錄小鼠死亡 情況（圖7、圖9、圖11)。結果顯示LBNSE-DCBp組對小鼠的保護率顯著高于LBNSE-DCCp和 LBNSE 組。
[0076]總之，本發明中的重組狂犬病病毒LBNSE-DCBp對小鼠無致病性，安全性高。在免疫 效果上，與歐洲普遍用于野生動物口服免疫的疫苗株即實驗中的母本株LBNSE相比，LBNSE-DCBp經口服免疫可以誘導產生更高的中和抗體水平;在滅活情況下，LBNSE-DCBp比對照毒 株也可以產生更高水平的中和抗體，提供更好的保護力。因此，重組狂犬病病毒LBNSE-DCBp 可以作為潛在的新型狂犬病口服疫苗或者滅活疫苗的候選疫苗株。
【主權項】
1. 一株重組狂犬病疫苗毒株，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。2. -種制備權利要求1所述重組狂犬病疫苗毒株的方法，其特征在于：以狂犬病毒 LBNSE毒株為母本，將DCBP肽基因插入到所述LBNSE毒株的G基因信號肽序列之后，然后利用 反向遺傳技術拯救病毒，所述DCBP肽基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
【專利摘要】本發明公開了一株重組狂犬病疫苗毒株，其基因核苷酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。該毒株是以狂犬病毒LBNSE毒株為母本，將DCBP肽基因插入到所述LBNSE毒株的G基因信號肽序列之后，然后利用反向遺傳技術拯救病毒，所述DCBP肽基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。該毒株具有較高的安全性。可以誘導產生更高的中和抗體，提供更好的保護力，可作為新型狂犬病口服疫苗或者滅活疫苗的候選株。
【IPC分類】C12N15/85, C12R1/93, C12N7/01
【公開號】CN105647878
【申請號】
【發明人】趙凌, 張雅春, 傅振芳, 周明, 崔旻, 李瑩瑩
【申請人】華中農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月4日