一種二萜化合物variediene合成基因Au13192及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種從焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)中克隆得到的二砲化合物￥&1^6(116116合成基因41113192及其應用。
【背景技術】
[0002] 蛇孢假殼素(Ophiobolin，以下簡稱Oph)是一類具有5-8-5三環結構的二倍半砲， 到目前為止發表的具有5-8-5三環母核結構的蛇孢假殼素類化合物主要有蛇孢假殼素 A、C、 F、H、M、L(M.ORSENIGO.Estrazione e purificazione della cochliobolina，una tossina prodotta da Helmintosporium 〇^2&6.卩117如卩&也.2.1957,29，189-196)、蛇抱假殼素0、 Q、R、S(CL Tipton，T Tovrea,G Whitehurst.The effect of ophiobolin A on glucose uptake by animal 〇6118.?^1^1'.1^口.11^.23,723-727(1981))等。二倍半碗由五個異戊二 烯單元組成，是萜類化合物中的稀有類型，只占萜類總數不到2%。目前還沒有二倍半萜類 的藥物，但一些二倍半萜化合物表現出了良好的生物活性。該類化合物顯示廣譜的抗菌活 性(如抗真菌、抗細菌)和抗線蟲、抗病毒等活性，此外還對多種腫瘤細胞株具有顯著細胞毒 活性(Au，T.K.，Chick，W.S.H.&Leung，P.C.The biology of ophiobolins .Life Sci .67, 733-742(2000))。
[0003] Oph A作為首個被發現的Oph化合物，除具有多種生物活性外，還是一種重要的鈣 調蛋白抑制劑，可以作為探針（Leung，P.C.，Taylor，W.A.，Wang，J.H.&Tipton，C.L.Role of calmodulin inhibition in the mode of action of ophiobolin a.Plant Physiol.77, 303-308(1985);Peters，C.&Mayer，A.Ca2+/calmodulin signals the completion of docking and triggers a late step of vacuole fusion.Nature·396，575-80(1998))〇 最新的研究表明〇ph A在腦膠質瘤和帕金森病的治療中有潛在應用（Dasari，R.et al.Fungal metabolite ophiobolin Aas a promising anti-glioma agent: In vivo evaluation,structure-activity relationship and unique pyrrolylation of primary amines.Bioorg Med Chem Lett.25,4544-4548(2015)；Xue,D.et al.3-anhydr〇-6-hydroxy-ophiobolin A,a fungal sesterterpene from Bipolaris oryzae induced autophagy and promoted the degradation of α-synuclein in PC12cells.Bioorg Med Chem Lett. 25,1464-1470(2015))。華北制藥集團新藥研究開發中心曾測試過Oph G和Oph K對人結腸癌細胞株Hct-15/Hct-116;人乳腺癌細胞株MDA-MB-231/MCF-7、人肺癌細胞株 A549和人白血病細胞K562的抑制作用，發現這兩種化合物對上述癌細胞的IC5Q均低于30ug/ mL并呈較好的量效關系(朱京童，范玉玲，路新華，董悅生，鄭智慧，張華，賀建功.二倍半萜 類化合物蛇孢菌素抗腫瘤活性的體外實驗研究.《癌變?畸變?突變》，2007,19(5):388-391)。有研究發現Oph 0可以增加阿霉素耐藥的乳腺癌細胞的敏感性，Ο.ΙμΜ Oph 0與阿霉 素聯合用藥，可以使耐藥細胞的阿霉素 IC50從74.00±0.18μΜ降低到6.67±0.98μΜ，降低約 11倍(Sun，W.et al.0phiobolin-〇 reverses adriamycin resistance via cell cycle arrest and apoptosis sensitization in adriamycin-resistant human breast carcinoma(MCF_7/ADR)cells.Mar Drugs·11,4570-84(2013))〇
[0004] 由于Oph化合物在藥物開發中的良好前景，大量制備化合物是一個重要的前提。從 1992年開始陸續有關于蛇孢假殼素類化合物及其母核化學合成的報道，但該類化合物的復 雜結構使其化學合成的研究極具挑戰性，到目前僅完成了蛇孢假殼素 A的全合成(Kazuhiro Tsuna,Naoyoshi Noguchi,Masahisa Nakada.Enantioselective total synthesis of ( + )-〇phiobolin A.Chemistry-A European Journal.2013,19,5476-5486；Ke Li ,Cheng Wang,Gang Yin,et al.Construction of the basic skeleton of ophiobolin A and variecolin.Organic&Biomolecular Chemistry.2013,11,7550-7558)，而且合成步驟繁瑣 不易操作，因此利用生物合成法制備〇ph是獲得大量化合物的重要途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明的首要目的在于提供一種二萜化合物variediene合成基因，二萜化合物 variediene的結構如圖1所示。本發明的另一目的在于提供一種二砲化合物variediene合 成酶。本發明的再一目的在于所述基因或酶的應用。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0007] 在研究焦曲霉094102(CCTCC Ν0:Μ 208153)代謝產物Oph化合物的生物合成過程 中，本發明通過敲除與萜類化合物合成相關的基因簇，檢測〇ph化合物的產量變化，發現 P0C13192基因簇（圖2)的敲除使Oph化合物產量與野生型在相同培養條件下相比顯著降低 (圖3 )，表明P0C13192基因簇影響Oph化合物的合成。通過對基因簇基因功能分析，得知在 P0C13192基因簇中Aul3192基因與萜類合成相關，說明在P0C13192基因簇中Aul3192基因參 與了 〇ph化合物的生物合成。進一步通過異源表達AU13192基因獲取AU13192蛋白進行體外 酶促反應驗證了Aul3192基因是一種二砲化合物variediene的合成基因。
[0008] -種二砲化合物variediene合成基因，為從焦曲霉094102中克隆得到的Au 13192 基因，其基因序列如SEQ ID N0.1所示。所述的Aul3192基因含有8個內含子，其cDNA大小為 2127bp，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009] -種二砲化合物variediene合成酶，即為Aul3192基因編碼的蛋白，命名為 Aul3192蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID勵.3所示。六1113192蛋白具有催化底物鏈長延伸和結 構環化的功能，Aul3192蛋白能催化DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸）、GPP(香葉基焦磷酸）或 FPP (法尼基焦磷酸)與IPP反應合成variediene。
[0010] 本發明所述的Aul3192蛋白可通過大腸桿菌原核表達系統對Aul3192基因進行異 源表達得到，同時可通過鎳離子金屬螯合親合層析得到純化的AU13192蛋白。
[0011] 一種表達上述AU13192蛋白的載體，含有上述Aul3192基因的真核或原核表達載 體。
[0012] 一種表達上述Aul3192蛋白的宿主細胞，含有上述載體。
[0013] 基于Aul3192蛋白可以合成二砲化合物variediene，能夠輔助Oph化合物母核合 成，上述Aul3192基因或Aul3192蛋白可用于合成二砲化合物variediene、合成砲類化合物、 輔助合成〇ph化合物(蛇孢假殼素類化合物）。
[0014]本發明具有如下有益效果:本發明發現了合成二砲化合物variediene的Aul3192 基因，其編碼的Aul3192蛋白能夠輔助Oph化合物母核合成。本發明為Oph化合物的生物合成 提供了新的資源，為提高該類化合物的生物產量提供一種選擇。在Oph化合物的生物合成 中，通過共表達Aul3192基因能夠提高Oph化合物的產量。
【附圖說明】
[0015] 圖1是二ijjg化合物variediene的結構圖。
[0016] 圖