擬南芥tt4基因在植物抗鹽方面的新應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程應用技術領域，具體涉及擬南芥TT4基因(擬南芥基因組編碼為At 5g 13930 )在培育耐鹽植物新品種方面的應用。
【背景技術】
[0002]當前，全球水資源短缺日趨加劇，而人類大量使用化肥使土壤鹽漬化日益嚴重，制約了農業的持續生產和發展。隨著分子生物學和基因工程研究的深入，國際上很多科技工作者也在努力尋找與植物抗鹽相關的基因，擬通過基因工程技術改良作物的抗鹽性，但是目前可利用的成果甚少。
[0003]擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科鼠耳芥屬植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，是植物遺傳學、分子生物學常用的模式植物之一，也常用于植物逆境條件下抗性基因研究。
[0004]現有研究一般認為種皮的顏色除作為一個形態指示形狀外，也常與植物品質有所關聯，因此利用模式植物擬南芥開展種皮色素形成調控機理的研究也有較多成果。擬南芥種皮中色素主要是類黃酮，確切的說是花青素中的原花青素和櫟精中的黃酮醇。TT4基因(擬南芥基因組編碼為At5gl3930)是調控擬南芥種皮色素的基因之一，該基因所編碼的CHS蛋白作為類黃酮合成途徑中的第一個特異性酶，催化類黃酮合成途徑的第I步反應，即:4-_香豆酰-Co (I分子)+丙二酰-CoA( 3分子)—縮合形成查爾酮(又稱苯基苯乙烯酮，Chalcone)。而查爾酮為其他類黃酮合成提供基本骨架，因此CHS蛋白催化的反應是整個類黃酮合成途徑的重要限速步驟。已有的研究發現，TT4基因突變后類黃酮合成缺失引起擬南芥種皮色澤的變異，而這些聚酮化合物在植物器官著色、病蟲害防護和紫外輻射抵御等方面扮演著重要角色，然而關于此基因的其他用途，特別是植物抗鹽方面的研究尚無報道。
【發明內容】
[0005]在對TT4基因(At5gl3930基因)深入研究基礎上，發明人提供了 TT4基因(At5gl3930基因)在植物抗鹽特性方面的新應用，從而為培育抗鹽植物新品種提供新的可能性。
[0006]本發明所采用的技術方案如下所述。
[0007]擬南芥TT4基因在植物抗鹽方面的新應用，所述TT4基因為擬南芥基因組編碼At5gl3930基因，其⑶S長度為1188 bp，編碼395個氨基酸的蛋白，該基因與種子活力相關，該基因突變后使擬南芥種子活力得到釋放，即:該基因突變后可增強種子活力，使種子萌發更為迅速，萌發能力更強;進一步模擬干旱及模擬鹽漬環境實驗表明，該基因突變后可提高種子在萌發初期耐受鹽脅迫(NaCl脅迫)和干旱(甘露醇模擬干旱)生長環境的能力，換言之，該基因突變后，可使種子萌發時耐受鹽脅迫或干旱脅迫生長環境的能力得到增強。
[0008]進一步實驗表明，TT4基因突變后，可使擬南芥種子在萌發初期耐受不超過400 mM甘露醇的模擬干旱的脅迫生長環境，或可耐受不超過150 mM NaCl的鹽脅迫生長環境;在擬南芥種子萌發后，可耐受生長環境中不超過300 mM甘露醇的模擬干旱的脅迫生長環境，或可耐受不超過150 mM NaCl的鹽脅迫生長環境。
[0009]現有研究一般認為，擬南芥TT4基因主要是作為類黃酮合成途徑中的第一個特異性酶，參與調控了擬南芥的種皮和種皮色素的發育。而本發明通過對擬南芥TT4基因(At5gl3930基因)在模擬干旱或高鹽逆境中的研究，發現該基因特異性的調控植物對鹽等引起的滲透脅迫反應，進一步將該基因沉默掉后，其突變體植株在萌發初期表現出較好地抗鹽特性。因此通過該基因的進一步研究和轉化，可以將其用于培育新的優良的耐鹽植物新品種。
【附圖說明】
[0010]圖1為擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體通過TTC染色法測定種子活力的結果；圖A為擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體著色情況，其中Control組為對照組，為自然結實后種子情況，從圖中可以看出，野生型(WT)種子具有較深的天然色澤，而突變體種子則表現為近似無色；圖B為擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體著色種子所占比例的統計結果，其中橫坐標的“Stained Seeds”表示著色(染色)種子；
圖2為擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體在添加不同濃度NaCl的MS培養基上培養兩周時種子的萌發情況統計結果；
圖3為擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體在添加200 mM NaCl的MS培養基上培養時的萌發情況，其中圖A為擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體在添加200 mMNaCl的MS培養基上培養一周時種子萌發情況；圖B為擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體在添加200 mM NaCl的MS培養基上5天內種子每天的萌發情況統計結果；
圖4為TT4基因的組織表達定位情況，其中圖A為擬南芥生長7天時轉基因幼苗中TT4基因的組織表達情況；圖B為子葉、莖中TT4基因的組織表達情況；圖C為根毛區中TT4基因的組織表達情況；圖D為根成熟區中TT4基因的組織表達情況；圖E為根尖和分生區中TT4基因的組織表達情況;圖F為TT4基因在花器官中的組織表達情況;圖G為TT4基因在花中表達情況；圖5為野生型與tt4-2突變體在300mM甘露醇、150 mM NaCl處理下的生長情況;其中A為將野生型與tt4-2突變體的種子直接點到脅迫培養基中生長15天后的表型;B為正常培養基中生長的幼苗移栽到脅迫培養基后，野生型與tt4-2突變體幼苗的生長情況。
【具體實施方式】
[0011 ]下面結合實施例對本發明做進一步地解釋說明。
[0012]實施例1
本實施例主要對TT4基因(At5gl3930基因)與植物種子活力的關系進行簡要說明。
[0013]前期基礎研究過程中，發明人認為TT4基因(At5gl3930基因)與植物種子活力相關，為此，發明人以擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體為例對此結論進行了對比實驗驗證。相關實驗過程介紹如下。
[0014]將干燥后的擬南芥野生型(WT)、tt4_2和tt4_3突變體種子分別置于含有氯化三苯四唑氮(TTC)的溶液中，溫度30°C，避光染色48h，觀察并統計種子的著色請況。
[0015]所述tt4-2和tt4-3突變體均為從擬南芥資源中心獲得的TT4基因(At5gl3930基因)分別通過基因敲除三個堿基、多一個堿基的突變體(具體突變情況為:tt4-2突變體在5號染色體4489272?4489274的位置敲除掉三個堿基TGC; tt4_3突變體在5號染色體4489274的位置插入一個堿基C，致使其發生移碼突變)，該突變體的TT4基因失活，不能正確編碼相關蛋白質。
[0016]需要說明的是，采用氯化三苯四唑氮(TTC)染色種子(種子生活力四唑染色測定法)是一種判定植物種子活力較為直觀的方法，由德國的H.Lakon于1942年首先發明，1995年我國將其列入農作物種子檢驗規程，其原理是無色的三苯基四氮唑被種子吸收后，在胚部活細胞中脫氫酶的作用下還原成紅色、穩定、不擴散的三苯基甲，因而可根據染色的部位和深淺來直觀的反應和區分種子的活性。
[0017]實驗結果如圖1所示。從圖中可以看出，tt4_2和tt4_3突變種子被染成紅色的比例明顯比野生型(WT)植株種子多，且著色較深。這表明TT4基因(At5gl3930基因)突變后擬南芥種子的活力得到了增強。
[0018]實施例2
在實施例1基礎上，發明人認為TT4基因突變后可以提尚種子的活力，也有可能提尚其耐鹽能力，因而發明人做了進一步的實驗驗證。相關過程簡要介紹如下。
[0019]將擬南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突變體種子分別播種于含有100 mM NaCK150 mM NaCU200 mM NaCl的MS培養基上，同時設置未添加其他物質的MS培養基作為對照，MS培養基瓊脂質量含量為0.6%。
[0020]所述tt4_2和tt4_3突變體來源同實施例1。
[0021]種子播種完成后，培養生長環境為:光/暗周期為8/16h，溫度22°C，黑暗溫度18°C，相對濕度70%，光照強度90 nmol.m-2.s—1。
[0022]對擬南芥種子萌發過程進行具體觀察并統計種子的萌發率。
[0023]實驗結果如圖2、3所示。從圖中可以看出，鹽脅迫條件下，隨著鹽濃度的升高，野生型(WT)植株種子萌發率逐漸下降，且濃度越高，種子萌發率下降越明顯；而TT4基因突變體(tt4-2和tt4-3突變體)種子的萌發率在一定鹽濃度(150 mM NaCl)的條件下，其萌發率不受影響，只有在鹽濃度超過一定程度時才造成種子萌發率的下降，但在200 mM NaCl濃度條件下，即使野生型(WT)植株種子萌發率降低為O時，TT4基因突變體(tt4-2和tt4-3突變體)種子仍有較高萌發率;而就具體突變類型而言，較高濃度鹽環境條件下，tt4-2突變體又比tt4-3突變體種子萌發率稍高。而且在實際觀察中，TT4基因突變體(tt4-2和tt4-3突變體)種子萌發速度也較野生型(WT)種子萌發速度快。
[0024]需要解釋的是，對TT4基因耐鹽功能驗證同時，發明人設計有相關的滲透對照實驗(以不同濃度甘露醇研究滲透壓影響，由于該部分實驗與本申請關聯度不高，因而不再單獨說明)，最終結果表明，TT4基因耐鹽功能實現不依賴于滲透因素，而僅與鹽的作用相關。
[0025]實施例3
基于實施例2的研究結果，發明人認為有必要對TT4基因在擬南芥組織中的表達情況進行進一步分析，相關實驗過程簡要介紹如下。
[0026]對TT4基因在擬南芥組織中的表達情況進行分析時，所采取的技術方案為:將TT4基因啟動子與PCAMBIA1391載體上的⑶S報告基因的編碼區融合，構建pTT4-pCAMBIA1391載體，