并采用農桿菌侵染擬南芥花絮的方法獲得了野生型擬南芥轉化TT4-GUS的轉基因植株，然后對TT4基因在擬南芥組織中的表達情況進行具體分析。
[0027]具體實驗過程介紹如下。
[0028](1)制備？!74-口0艦81厶1391載體
從擬南芥網站(http://www.arabidopsis.0rg)上，獲得At5gl3930基因啟動子序列，根據PCAMBIA1391載體的多克隆位點，利用primer5.0軟件設計特異性引物，引物序列設計為:LP: 5，- GCCAGCCTGACGGCATCGGAAG -3，，
RP: 5 ’- GAGTTTGATGTTGCTGTTGTGT-3’；
以野生型擬南芥基因組DNA為模板，PCR擴增出At5gl3930基因啟動子的1355bp序列(具體序列如SEQ ID從).1所示)；
同時對擴增的At5gl3930基因啟動子序列和pCAMBIA1391質粒進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后回收，連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞后，提取質粒并進一步進行PCR鑒定、雙酶切篩選和測序比對，獲得正確的含有At5gl3930基因啟動子序列的pTT4-PCAMBIA1391 載體。
[0029](2)將步驟(I)中所制備pTT4-pCAMBIA1391載體轉化
將步驟(I)中所制備pTT4-pCAMBIA1391載體轉化農桿菌GV3101感受態細胞，篩選并挑取陽性農桿菌單菌落擴大培養至OD6qq=1.2?1.6。
[0030](3)浸染轉化
當擬南芥野生型WT幼苗花序長至5?10 cm高時(培養條件同實施例2)，利用步驟(2)中轉化后的農桿菌侵染擬南芥花絮進行轉化，具體過程為:將擬南芥花序浸沒在菌液中，每株浸花30 S，將浸花過的苗盆平放在托盤中，以塑料膜覆蓋保持濕度，避光放置16?24 h后取出，正常培養;5?7天后，重復侵染一次。
[0031](4)陽性植株篩選
將步驟(3)中農桿菌侵染后擬南芥繼續培養，收獲種子。
[0032]將所收獲的種子撒種于含25mg/L潮霉素的MS培養基平板上，4°C春化3 d，移到材料室培養一周(培養條件同實施例2)。
[0033]陽性植株對潮霉素有抗性，可正常生長，陰性植株對潮霉素敏感，不能正常生長最后死亡。基于此特性，篩選陽性植株，所獲得陽性植株可初步認為其成功轉錄有GUS基因，并且該基因獲得了正確表達。
[0034](5)染色鑒定
將步驟(4)中所篩選獲得的陽性幼苗移栽到栽培基質中(所述栽培基質為，質量比1:2的營養土/蛭石)，201:±2°(:、光暗周期16 h / 8 h、相對濕度80%培養。對2周大的幼苗分別取幼嫩葉片進行GUS染色檢測，將檢測為陽性的幼苗繼續培養至種子成熟，所得種子繼續用潮霉素篩選并做GUS染色檢測鑒定，并將陽性苗進一步擴大繁殖。
[0035]上述擬南芥培養過程中，將擬南芥種子播種于培養基時，擬南芥種子均需消毒，具體方法為:將擬南芥種子置于1.5 mL的離心管中，用0.1%升汞表面消毒5 min，以無菌水沖洗5?8次，然后選取尖頭滴管吸取種子進行點播。
[0036]擬南芥種子采用培養基培養時，所采用的MS固體培養基配方為:MS鹽+3%蔗糖+
0.6%瓊脂，pH 6.0;培養條件為:光/暗16 h / 8 h，光照強度0.3-0.4 mmol.m—2.s-、溫度 18°C~22°C。
[0037]上述步驟(5)中GUS染色液的配制方法為:稱取I mg的X-Gluc (5_溴_4氯_3_吲哚-β-葡糖醛酸)放入錫箔紙包好的1.5mL的EP管中，加入I?2滴N，N-二甲基甲酰胺使X-Gluc完全溶解，然后依次加入980 uL 100 mM磷酸緩沖液(pH=7.0)UOyL 5mM鐵氰化鉀和10 pL5 mM亞鐵氰化鉀，最后加入I uL Triton X-100，混勻即可。
[0038]上述步驟(5)中GUS染色方法為:將所采集的植株的器官組織浸沒于GUS染液中(GUS染液用量依據組織器官大小適量取用，以完整浸沒組織器官為限)，避光條件下，37°C水浴染色至少4?5h，然后依次用50%乙醇脫色、75%乙醇脫色和無水乙醇進行脫色，直至葉綠素全部被脫去，最后進行染色情況觀察并照相；染色時對各個組織器官(根、莖、葉以及花等)均進行采集染色。
[0039]GUS染色原理為:GUS基因編碼β-葡萄糖苷酸酶，該水解酶以β-葡萄糖苷酸酯類物質為作用底物，其反應產物可用多種方法檢測出來；由于該基因僅存在于一些細菌基因組內，而在植物基因組中并不存在，因此可用通過GUS基因的表達，可特異性檢測與該基因相關聯的欲檢測基因(如本申請中At5gl3930基因)在植物組織中的表達位置。對該基因的組織化學法檢測原理為:以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)作為反應底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細胞中轉入有GUS基因，并成功表達出Gus蛋白，在適宜條件下，該酶就可將底物水解生成藍色產物，使具Gus活性的部位或位點呈現藍色，進而可通過肉眼或顯微鏡觀察得到，且在一定程度下可根據染色深淺反映Gus活性，并進而反映出欲檢測基因的表達量等表達情況。
[0040]GUS染色結果如圖4所示。從圖中可以看出，ΤΤ4基因在擬南芥根、莖、葉和花中均有表達，并且根的成熟區、莖和花器官中表達量相對更高。
[0041 ] 實施例4
在前述關于ΤΤ4基因基本功能與其在植物組織中表達情況已有基本研究的基礎上，發明人對ΤΤ4基因(At5gl3930基因)調節擬南芥抗鹽能力進行了進一步的檢測驗證，相關試驗情況簡介如下。
[0042]將春化過的種子(野生型WT和突變體tt4-2)直接點在含300 mM的甘露醇和150mM氯化鈉的0.6%MS培養基中，光照材料間培養2?3周(具體培養條件參考實施例2)，觀察結果。
[0043]對栽培結果進行統計，結果顯示，突變體tt4_2在含300mM的甘露醇的培養基中萌發率能達到96%以上，葉子變綠的能達到90%以上;而在含150 mM氯化鈉的培養基中萌發率能達到92%以上，葉子變綠的在87%以上;野生型(WT)在含150 mM氯化鈉的培養基中萌發率不到3%，大部分不能萌發，葉子變綠僅有1%左右;而在含300 mM甘露醇的培養基中萌發率只有10%左右，葉子變綠在5%左右;具體表型可參見圖5A所示。
[0044]另外一組實驗中，將春化過的種子(野生型胃1'和突變體《4-2)先點到正常的0.8%MS培養基中，豎直培養，待根長至Icm左右時，再移至含150mM氯化鈉或300mM的甘露醇的
0.8%MS培養基中，光照材料間豎直培養2周左右(具體培養條件參考實施例2)。
[0045]實驗結果表明，野生型幼苗在移栽到含氯化鈉培養基中后，不再生長，并且葉子很快發黃干枯，接近死亡狀態，而與之相對應的tt4_2突變體則生長良好，表現明顯的對鹽的耐受性(或者說抗性);而同等濃度的甘露醇處理條件下，tt4_2突變體與野生型并沒有明顯的表型區別，這一結果表明，tt4_2突變體對鹽的抗性表現，可能不依賴于其對滲透脅迫調控。相關表型結果如圖5B所示。
[0046]綜上所述，發明人認為，TT4(At5gl3930)基因可能是抗鹽脅迫的關鍵性負調控因子，其突變后可賦予擬南芥較強的抗鹽脅迫的能力，可明顯提高幼苗抗高濃度鹽環境能力(在環境濃度150mM時，種子萌發與生長基本不受影響；而在環境中NaCl濃度達到200mM時，種子萌發受到影響的效果才能得到較為明顯的表現)。發明人認為，本發明可為培育抗鹽抗干旱的轉基因作物新品種提供新的借鑒和參考，即，利用TT4基因的抗鹽功能特點，通過干擾該基因在作物中翻譯表達情況，有望開發培育出新的豐產抗鹽作物新品種，因而使得本申請具有進一步深入研究開發的價值。
【主權項】
1.擬南芥TT4基因在植物抗鹽方面的新應用，其特征在于，所述TT4基因為擬南芥基因組編碼At5gl3930基因，其⑶S長度為1188 bp，編碼395個氨基酸的蛋白，該基因與種子活力相關，該基因突變后可增強種子活力。2.如權利要求1所述擬南芥TT4基因在植物抗鹽方面的新應用，其特征在于，TT4基因突變后，種子萌發初期，可耐受不超過150 mM NaCl的鹽脅迫生長環境。3.如權利要求1所述擬南芥TT4基因在植物抗鹽方面的新應用，其特征在于，種子萌發后，可耐受生長環境中不超過300 mM甘露醇的模擬干旱的脅迫生長環境，或可耐受不超過.150 mM NaCl的鹽脅迫生長環境。
【專利摘要】本發明屬于基因工程應用技術領域，具體涉及擬南芥<i>TT4</i>基因（擬南芥基因組編碼為At5g13930）在培育耐鹽植物新品種方面的應用。所述<i>TT4</i>基因，其CDS長度為1188？bp，編碼395個氨基酸的蛋白，該基因與種子活力相關，該基因突變后使擬南芥種子活力得到釋放，即：該基因突變后可增強種子活力，使種子萌發更為迅速，萌發能力更強。<i>TT4</i>基因主要是作為類黃酮合成途徑中的第一個特異性酶，參與調控了擬南芥的種皮和種皮色素的發育。本發明通過對<i>TT4</i>基因在模擬干旱或高鹽逆境中的研究，發現該基因特異性的調控植物對鹽等引起的滲透脅迫反應，將該基因沉默掉后，其突變體植株在萌發初期表現出較好地抗鹽特性。
【IPC分類】C12N15/82, A01H5/00, C12N9/10
【公開號】CN105647883
【申請號】
【發明人】張驍, 趙翔, 趙青平, 蔡欣媛, 王琳丹
【申請人】河南大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月4日