，0.05 g七水硫酸鎂(MgS04.7H20)，0.2 g硫酸銨((NH4)2SO4)，溶解混勻后1210C高壓蒸汽滅菌20 min，得到霉菌液體發酵培養基。
[0022]3.霉菌好氧發酵
在100 mL霉菌液體發酵培養基中接入濃度1.10X 16個/mL的I mL黑曲霉孢子接種劑，錐形瓶置于恒溫搖床振蕩培養48 h，搖床溫度32°C，轉速180 r/min，得到發酵液。
[0023]黑曲霉孢子接種劑的制作:取I支培養有黑曲霉孢子的PDA培養基斜面試管，往斜面試管中加入15 mL的無菌生理鹽水，刮取斜面上的黑曲霉孢子振蕩混勻成孢子懸液，再取I mL孢子懸液加入30 mL的無菌生理鹽水中，混勻制成黑曲霉孢子接種劑，顯微鏡計數測定接種劑中的孢子濃度為I.1X 16個/mL;
4.發酵液后處理
將發酵液以10000 r/min的轉速離心3 min，取上層清液。經檢測，每毫升清液中的纖維素酶活達到4.80個單位。將上層清液在室溫下真空杯過濾濃縮，濾膜透過分子量小于500Da，制成纖維素酶濃縮液。
[0024]注:羧甲基纖維素酶活性檢測方法參考“輕工行業標準:羧甲基纖維素鈉法測定纖維素酶酶活QB 2583-2003”，I單位纖維酶活性定義為:I mL發酵液在I h催化生成I mg還原糖。
[0025]實施例2
以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的具體操作步驟如下:
1.制作纖維素酶誘導粉劑具體操作方法同實施例1。
[0026]2.制作竹筍殼降解產物的水浸提液
稱取50 g纖維素酶誘導粉劑于大燒杯中，加入5 L自來水，將大燒杯置于高壓蒸汽滅菌鍋中，105°C保溫30 min，然后靜置、冷卻，取上清液2 L置于5 L的不銹鋼發酵罐中。
[0027]3.配制霉菌液體發酵培養基在2 L上清液中加入如下物質:20.0 g葡萄糖，1.0 g氯化鈉(NaCl)，2.0 g磷酸二氫#(KH2PO4) ,1.0 g 七水硫酸鎂(MgS(V7H20)，4.0 g 硫酸銨((NH4)2SO4)，溶解混勻后 121°C高壓蒸汽滅菌20 min，得到霉菌液體發酵培養基。
[0028]4.霉菌好氧發酵
在2 L霉菌液體發酵培養基中接入濃度1.20 X 16個/mL的20 mL黑曲霉菌孢子接種劑，32°C攪拌培養36 h，發酵罐攪拌轉速800 r/min，通氣量0.5 L/min，得到發酵液。
[0029]黑曲霉孢子接種劑的制作:取I支培養有黑曲霉孢子的PDA培養基斜面試管，往斜面試管中加入15 mL的無菌生理鹽水，刮取斜面上的黑曲霉孢子振蕩混勻成孢子懸液，再取I mL孢子懸液加入30 mL的無菌生理鹽水中，混勻制成黑曲霉孢子接種劑，顯微鏡計數測定接種劑中的孢子濃度為1.20 X 16個/mL;
4.發酵液后處理
將發酵液以10000 r/min的轉速離心3 min，取上層清液。經檢測，每毫升清液中的纖維素酶活達到4.52個單位。將上層清液在-40°C真空冷凍干燥48 h，制成纖維素酶粉劑。
[0030]注:纖維素酶活測定方法及酶活單位定義同實施例1。
【主權項】
1.一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于操作步驟如下: (I)用竹筍殼制作誘導劑 (1.1)按重量比4:1將竹筍殼干粉和麩皮混和，加水拌勻、滅菌，制成發酵底料； (1.2)在發酵底料中接入平菇菌種，好氧固態發酵，當菌絲長密長實，發酵完成;發酵底料中的竹筍殼干粉被部分降解，成為平菇發酵料； (1.3)將平菇發酵料烘干至恒重，粉碎，得到纖維素酶誘導粉劑； (1.4)將纖維素酶誘導粉劑和自來水混和，加熱，沸水浸提，靜置冷卻，取上層清液蒸發濃縮制成纖維素酶誘導水劑； (2 )配制霉菌液體發酵培養基，培養基配方如下: 葡萄糖2.0 g、氯化鈉0.05 g、磷酸二氫鉀0.1 g、七水硫酸鎂0.05 g、硫酸銨0.2 g、纖維素酶誘導水劑1 mL和水90 mL ； (3)霉菌好氧發酵 在霉菌液體發酵培養基中接入黑曲霉孢子懸液，好氧恒溫發酵，得到發酵液； (4)發酵液后處理 將發酵液經過濾或離心處理，分離出其中的菌絲球，所得清液中纖維素酶活不低于4U/mL，將清液濃縮制成纖維素酶濃縮液或凍干制成纖維素酶粉劑。2.根據權利要求1所述的一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于:步驟(1.1)中竹筍殼干粉過40目篩，按重量比4:1將竹筍殼干粉和麩皮混和，再加入干物質重量2倍的自來水拌勾。3.根據權利要求1所述的一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于:步驟(1.2)中接種量為發酵底料重量的5%，溫度28 ± 2°C條件下，培養15 d。4.根據權利要求1所述的一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于:步驟(1.3)中將平菇發酵料在80°C溫度下烘干。5.根據權利要求1所述的一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于: 步驟(1.4)中纖維素酶誘導粉劑和自來水混和的比例是重量比1:10，沸水浸提20 min，蒸發濃縮制成纖維素酶誘導水劑的體積是原液體積的1/10。6.根據權利要求1所述的一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于: 步驟(3)中霉菌好氧發酵的工藝條件:搖瓶發酵時，100 mL霉菌液體發酵培養基中接入濃度(1.10?1.20) X 1fMVmL的I mL黑曲霉孢子懸液，恒溫搖床培養;轉速180 r/min、溫度32°C、發酵時間72 ho7.根據權利要求1所述的一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于:步驟(3)中霉菌好氧發酵的工藝條件:5 L發酵罐發酵時，2 L霉菌液體發酵培養基中接入濃度(1.10?1.20) X 1MVmL的20 mL黑曲霉孢子懸液，攪拌轉速800 r/min、通氣量0.5 L/min、溫度32°C、發酵時間72 h。8.根據權利要求1所述的一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法，其特征在于: 步驟(4)中處理清液的具體制劑方法是:-40°C真空冷凍干燥48 h，制成纖維素酶粉劑；或室溫下真空杯過濾濃縮，濾膜透過分子量小于500 Da，制成纖維素酶濃縮液。
【專利摘要】本發明公開了一種以竹筍殼降解產物為誘導劑培養霉菌生產纖維素酶的方法。具體操作步驟如下：（1）制作竹筍殼降解產物的水浸提液；（2）以葡萄糖為碳源、竹筍殼降解產物的水浸提液為溶劑配制液體發酵培養基；（3）在培養基中接入能產纖維素酶的霉菌菌種，好氧發酵；（4）將發酵液中的霉菌菌絲分離，所得清液中即含大量纖維素酶。本發明在培養基中不含纖維素類物質的情況下，實現了纖維素酶的液態發酵生產，同時提升了竹筍的綜合利用價值。
【IPC分類】C12R1/685, C12N9/42
【公開號】CN105647890
【申請號】
【發明人】章建國, 魏兆軍, 胡飛
【申請人】合肥工業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月6日