以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于煙草復烤前添加的可提高煙草品級的酶制劑。 技術背景
[0002] 木聚糖酶(xylanase)是專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的 總稱，主要有:① β-l，4-D-木聚糖內切酶(EC3.2.1.8)，簡稱木聚糖酶，功能是水解木聚糖主 鏈內部的1，4_糖苷鍵作用于木聚糖無側枝區產生低聚糖和有側枝的寡聚糖，水解產物主要 是木二糖和木寡糖，可使木聚糖溶液的粘度迅速下降。②β-l，4-D-外切木聚糖酶 (EC3.2.1.92 )，從木聚糖的非還原性末端，以單個木糖單位(糖基)為切割單位，水解將木糖 殘基(糖基)使之成為木糖，使反應體系因木糖量的增加而還原性也增加。③β-D-木糖苷酶 (EC3.2.1.37)為外切酶，是木聚糖類半纖維素徹底降解為單糖的關鍵酶之一，從木聚糖水 解后的產物低聚木糖和木二糖的非還原性末端逐一水解切下木糖苷單位形成木糖。該酶能 夠水解對-硝基苯-β-D-木糖基(PNPX)等人工底物。因 β-l，4_木聚糖外切酶(EC3.2.1.92)也 能水解低聚木糖和木二糖使木聚糖徹底降解為木糖，在這點上與β-木糖苷酶(EC3.2.1.37) 同屬外切酶的功能相同。在多數資料中未將兩種酶分列說明，僅少數資料明確木糖苷酶 (EC3.2.1.37)是水解低聚木糖和木二糖的。木糖苷酶存在于細菌和真菌中，一般不分泌到 細胞外為胞內酶（劉士清，張無敵，尹芳，等。沼氣發酵實驗教程。北京：化學工業出版社， 2013，ρ114-126,127-138)。大多數微生物產生的木聚糖酶的最適作用pH值在6~7,其中一 些微生物能夠產生在較低pH條件下保持較高酶活力和穩定性的耐酸或酸性木聚糖酶，即酸 性木聚糖酶，這些微生物的木聚糖酶顯示的酸穩定性，提供了以工業化生產的微生物酸性 木聚糖酶市售商品的來源（田永，等，酸性木聚糖酶的應用研究進展，糧油加工，2008，（5): 110 ~113)〇
[0003] 相關專利文獻中，"一種復合酶制劑及將該復合酶制劑用于煙梗生產的工藝"（戴 麗君等，ZL2005101044436)研究了淀粉酶、果膠酶和木聚糖酶復合酶制劑，經復合酶處理后 的煙梗、梗膏和再造煙葉的水溶性糖含量有較大的變化。但不是單一的酸性木聚糖酶制品。
【發明內容】
[0004] 本發明旨在提供以商品化的酶源制備單一的酸性木聚糖酶，用于新鮮煙草烘烤 后，對復烤前的片煙用水稀釋替代片煙復烤的自然陳化時原有的第二潤葉用水的煙草活性 添加劑，更好地降解煙草中的半纖維素，達到提高煙草品質的作用。
[0005] 本發明上述目的通過以下方法實現： (一)以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑 該制劑酸性木聚糖酶的酶活力在50°C和pH4.5下為3000~4000U/mL。
[0006] 優選的，所述的酶制劑的酸性木聚糖酶的最佳酶活力為3500U/mL。
[0007] (二)制備本發明輔助酶制劑的方法 包括以下步驟： (1) 用pH4.5緩沖液溶解蛋白酶活性抑制劑PMSF，PMSF在緩沖液中的濃度為0.0 lmo 1/L， 再按緩沖液與水的體積比1:4稀釋緩沖液;將市售的酸性木聚糖酶固體物酶源與稀釋緩沖 液該兩者按重量體積比1 g: 10~20mL混勻得混合液，加入NaCl攪拌溶解，混合液與NaCl的 重量體積比為〇. 75g /L;過濾，收集濾液作為待精制處理的粗酶液，靜置。
[0008] 上述緩沖液為Britton-Robinsion緩沖液； 上述在市售的酸性木聚糖酶固體物酶源中加入PH4.5的稀釋緩沖液的量與酶源的原始 酶活力呈正相關； (2) 步驟（1)靜置lh的粗酶液，加入(NH4)2S〇4，（NH4)2S〇4濃度為25 %，緩慢攪拌溶解，靜 置2h;繼續按上清液體積加入(NH4)2S〇4濃度為至80%，靜置過夜。離心要沉淀。收集的上清液 中補加 l〇%(NH4)2S〇4,再過夜，重復離心得二次沉淀，合并兩次沉淀； 所述(NH4)2S〇4濃度為重量體積比； (3) 配制濃度為0.1%的EDTA溶液，該溶液與沉淀的體積比為1:2; 將步驟(2)收集的沉淀與pH4.5的稀釋緩沖液按體積比2:1混勻后加入以上EDTA溶液， 靜置，離心，得到去除金屬離子的酶上清液； (4) 往酶上清液加入濃度為0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液與蔗糖低聚物的體積比為 100:1，作為初制品，-8 °C冷凍干燥濃縮至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力為3000~4000U/ mL濃縮的酸性木聚糖酶原液制劑，其中，濃縮的酸性木聚糖酶原液制劑的最佳酶活力為 3500U/mL； 所述蔗糖低聚物濃度為重量體積比。
[0009] 所述步驟（1)中的酶源原始酶活力5，000U/g，酸性木聚糖酶固體物與pH4.5的稀釋 緩沖液該兩者按重量體積比1 g: 10mL:酶源的原始酶活力10，000U/g，酸性木聚糖酶固體物 與pH4.5的稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1 g: 20mL。
[0010]所述步驟(4)中可以濃度為0.01%的β-環糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液與β-環糊 精的體積比為100:1，作為初制品，-8°c冷凍干燥濃縮至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力為 3000~4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶原液制劑。
[0011 ]進一步，其中原液制劑的酶活力是以PH4.5的稀釋緩沖液中加有Ca(N〇3)2、MgS〇4、 ZnS〇4和FeS〇4,其中，Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和FeS〇4分別與緩沖液的重量體積比為0.3g / 100mL，以恢復酸性木聚糖酶酶活力，及在50°C下所測定的酶活力。
[0012] (三)應用酸性木聚糖酶作為煙草加工輔助添加的酶制劑的方法 該酶制劑以戊聚糖含量在11%~19%的煙草作為適宜的處理對象。
[0013] 所述的應用方法是:將酶活力為3000~4000U/mL的濃縮的酸性木聚糖酶制劑稀釋 250倍作為片煙復烤前的第二次潤葉用水，其使用的酶活力范圍為12~16U/mL。
[0014] 優選的，所述的應用方法是:將酶活力為3500U/mL的濃縮的酸性木聚糖酶制劑稀 釋250倍作為片煙復烤前的第二次潤葉用水，其最佳酸性木聚糖酶酶活力為14U/mL。
[0015] 本發明的進步及意義是： 本發明中所用的起始酶源主要來源于市售的酸性木聚糖酶商品，該商品的酶活力為 5000U/g或10000U/mL，價格低，來源廣。本發明產品為單一的酸性木聚糖酶產品，質量有保 障、應用易控制，效果穩定和良好。
[0016] 本發明以商品酶生產酸性木聚糖酶，商品酶源中有調制穩定其質量的填充物等； 酶源中還存在的金屬離子、酶及蛋白質等雜物，這些雜物破壞了酸性木聚糖酶的產品質量 及處理煙草的效果，本發明通過純化、濃縮的精制工藝盡可能地除去雜物，作為用于煙葉烘 烤后，在復烤前的加工過程中輔助添加的酶制劑。
[0017] 本發明煙草活性添加劑為一種能破壞煙葉中細胞壁，降解半纖維素，改善與提高 煙草品質的單一酸性木聚糖酶，酸性木聚糖酶的酶活力在3000~4000U/mL，最佳酶活力為 3500U/mL，性狀為濃縮液酶制劑，適用于處理煙葉中戊聚糖(半纖維素)含量在11%~19%范 圍內不同等級和不同產地的大多數品種煙草。
[0018] 本發明使用時將產品用水稀釋250倍，代替片煙復烤時的第二次潤葉用水，極其簡 易，改善煙葉內在品質，提尚煙葉品級。
[0019] 本發明也可用于自然陳化但結果不理想的煙草，以及用于煙支制成前的改善。按 照本發明控制測定方法，酸性木聚糖酶產品具有2年以上穩定的商品特性。
[0020] 本發明在過氧化物相關的系列酶類并形成穩定產品的基礎上，進行著水解酶類的 研究和開發，提高和改善了煙草品質，具有廣泛應用前景。
[0021] 以下結合實施例及附圖對本發明做進一步說明。
【附圖說明】
[0022] 圖1為酶源粗品酶而進行精制的具體制備方法。
【具體實施方式】
[0023] ( - )用市售的酸性木聚糖酶固體物生產酸性木聚糖酶發酵液 實施例1: (1)將原始酶活力為10,000U/g的酸性木聚糖酶固體粗制品按粗酶重50g與PH4.5的緩 沖液lOOOmL混勾得混合液;所述緩沖液是按1^;[1:1:011-1?013；[118；[011緩沖液2001111^與水8001111^稀 釋的緩沖液，即二者體積比為1: 4。在混合液中按重量體積比為0.7 5 g / L加入0.7 8 7 5 g NaCl，攪拌充分溶解，過濾，收集濾液，靜置lh待后續處理。
[0024]或者，將原始酶活力為5，000U/g的酸性木聚糖酶固體粗制品按粗酶重100g與 pH4.5的緩沖液1000mL混勾得混合液;所述緩沖液是按Britton-Robinsion緩沖液200mL與 水800mL稀釋的緩沖液，即二者體積比為1:4。在混合液中按重量體積比為0.7