施例的一種地衣芽抱桿菌(Ba c i 11 u s licheniformis SffJ S33 ,CGMCCN0.7388)在產氨肽酶中的應用，取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCN0.7388)于種子培養基(蛋白胨5g，酵母粉Ig，人工海水IL，pH 7.4)中培養，將所得菌株用于發酵的培養基及培養條件如下:分別以甘油、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉作為碳源5g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.3g，硫酸銨lg，氯化鈣lg，氯化鈉40g，去離子水lL，pH7.2;裝液量為10%，搖床轉速150rpm，在37°C溫度下發酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
[0034]本實施例以不同物質作為碳源時所得粗酶液的氨肽酶活性測定結果如圖3所示。由圖3可以看出，以可溶性淀粉作為碳源時，氨肽酶活力最高，其次是果糖、葡萄糖。
[0035]實施例4
[0036]本實施例的一種地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis SffJ S33 ,CGMCCN0.7388)在產氨肽酶中的應用，取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCN0.7388)于種子培養基(蛋白胨5g，酵母粉Ig，人工海水IL，pH 7.4)中培養，將所得菌株用于發酵的培養基及培養條件如下:可溶性淀粉5g，分別以酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、牛肉膏、SIP酶解物、酪蛋白酶解物、大豆蛋白胨、硫酸銨和尿素作為氮源10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.3g，硫酸銨Ig，氯化鈣Ig，氯化鈉40g，去離子水IL，pH7.2 ；裝液量為1 %，搖床轉速150rpm，在37 °C溫度下發酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
[0037]本實施例以不同物質作為氮源時所得粗酶液的氨肽酶活性測定結果如圖4所示。由圖4可以看出，以酵母粉作為氮源時，氨肽酶活力最高，以SIP酶解物、大豆蛋白胨作為氮源時活力為酵母粉作為氮源時的50%左右，其它有機或無機氮源則不合適本發明菌株生產氨肽酶。
[0038]實施例5
[0039]本實施例的一種地衣芽抱桿菌(Ba c i 11 u s licheniformis SffJ S33 ,CGMCCN0.7388)在產氨肽酶中的應用，取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCN0.7388)于種子培養基(蛋白胨5g，酵母粉Ig，人工海水IL，pH 7.4)中培養，將所得菌株用于發酵的培養基及培養條件如下:可溶性淀粉5g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂
0.3g，硫酸銨Ig，氯化鈣Ig，氯化鈉分別為Og、20g、30g、40g和50g，去離子水IL，pH7.2;裝液量為10%，搖床轉速150rpm，在37°C溫度下發酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
[0040]本實施例在不同氯化鈉濃度下(0、2%、3%、4%、5% )所得粗酶液的氨肽酶活性測定結果如圖5所示。由圖5可以看出，添加一定量的氯化鈉能顯著提高產氨肽酶的水平，氯化鈉添加量4%時產氨肽酶活力最高。
[0041 ] 對以上實施例Bacillus licheniformis SWJS33所產氨肽酶進行串聯質譜鑒定:
[0042]將菌株所產氨肽酶經分離純化后凝膠電泳只有一個條帶，將此條帶回收后用trypsin酶解，利用輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)和Mascot數據庫檢索對酶蛋白進行鑒定，結果如圖6所示。在得到的數條肽段中，“HLDDKASVALLIELIR”與“AGHDIVHGLIGPGIDASHAFER”與Bacillus licheniformis ATCC 14580的氨肽酶(gi52079505)相匹配。蛋白質評分為395，可信度為100%，鑒定此酶為氨肽酶。
[0043]對以上實施例Bacillus licheniformis SWJS33所產氨肽酶酶學性質進行分析:
[0044]最適溫度:分別測定純化后的氨肽酶在20?90°C下的活力，結果如圖7所示。由圖7可以看出，所得氨肽酶在60°C時活性最高，將此時活力作為100%，50?80°C范圍內活力在50%以上，溫度低于或高于此范圍，酶活力大大降低，溫度升高至90°C時，氨肽酶基本上失去活力。因此該氨肽酶的最適溫度為60°C。
[0045]最適pH:分別測定純化后的氨肽酶在pH3?10下的活力，結果如圖8所示。由圖8可以看出，所得氨肽酶在pH 8.0?9.6范圍內有較高的活力，其中pH 8.0?8.5活力最高，pH低于7或高于10，酶的活力都較低。因此該氨肽酶的最適pH為8.0?8.5，屬于堿性蛋白酶。
[0046]底物特異性:在相同的條件下，分別測定不同的氨基酸-對硝基苯胺AA-pNA(LeU-
的活力，結果如圖9所示。由圖9可以看出，氨肽酶對Leu-ρΝΑ的底物特異性最強，氨肽酶活力較高，以Leu-pNA作為底物時的活力為100%，對其他底物的特異性則較弱，不及Leu-pNA作為底物時的10 %。
[0047]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌為Bacillus licheniformis SWJS33，于2013年3月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7388。2.根據權利要求1所述的一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的培養基及培養條件如下:碳源5?6質量份，氮源10?15質量份，磷酸二氫鉀O?0.5質量份，硫酸鎂0.1?0.3質量份，硫酸銨O?I質量份，氯化鈣0.5?I質量份，氯化鈉20?50質量份，水1000質量份，pH7.0?7.6;裝液量10%?40%，搖床轉速150?250rpm，在 25 ?40°C 發酵 36 ?60h。3.根據權利要求2所述的一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的培養基及培養條件如下:碳源5質量份，氮源10質量份，磷酸二氫鉀0.5質量份，硫酸鎂0.3質量份，硫酸錢I質量份，氯化媽I質量份，氯化鈉40質量份，水1000質量份，pH7.2;裝液量1 %，搖床轉速150rpm，在37 °C發酵48h。4.根據權利要求1或2所述的一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用，其特征在于:所述的碳源為可溶性淀粉、果糖或葡萄糖。5.根據權利要求4所述的一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用，其特征在于:所述的碳源為可溶性淀粉。6.根據權利要求1或2所述的一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用，其特征在于:所述的氮源為酵母粉、SIP酶解物或大豆蛋白胨。7.根據權利要求6所述的一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用，其特征在于:所述的氮源為酵母粉。8.—種通過權利要求1?7任一項所述的應用所產的氨肽酶，其特征在于:所述氨肽酶的最適溫度為60°C，最適pH為8.0?8.5，對N端為亮氨酸的肽鍵具有水解特異性。
【專利摘要】本發明屬于微生物篩選及發酵技術領域，公開了一種地衣芽孢桿菌在產氨肽酶中的應用。所述地衣芽孢桿菌為Bacillus？licheniformis？SWJS33，于2013年3月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.7388。該菌株可應用于發酵生產氨肽酶，所得氨肽酶的最適溫度為60℃，最適pH為8.0～8.5，對N端為亮氨酸的肽鍵具有水解特異性。
【IPC分類】C12N9/48, C12R1/10
【公開號】CN105647891
【申請號】
【發明人】趙謀明, 雷芬芬, 趙強忠, 林戀竹
【申請人】華南理工大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月2日