大豆苷元的制備方法

大豆苷元的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種大豆苷元的制備方法。
【背景技術】
[0002] 大豆異黃酮(Soybean Isoflavones，SIF)是大豆中具有重要生理活性的多酸類黃 酮化合物，母體結構如下：
[0003]
[0004] 大豆異黃酮在天然大豆中的主要存在方式是以3-苯并吡喃為母核，并結合了糖基 的糖苷，種類共12種。
[0005]
[0006] 大豆素(Daidzein)、黃豆黃素(Glycitein)和染料木素(Genistein)，這3種為游離 型，總稱為大豆苷元;還有就是與其對應的9種結合型糖苷:葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷和丙 二酰基葡萄糖苷各3種。在天然的大豆異黃酮產品中，易被人體吸收的活性功能成分是游離 型苷元，此部分僅占大豆異黃酮總量的2%~3%，其余是不易被人體吸收的結合型糖苷，占 97 %~98%。結合型中的乙酰基葡萄糖苷和丙二酰基葡萄糖苷不穩定，加熱后會發生轉化， 使游離型苷元含量增加。
[0007] 天然大豆苷元的獲得主要有兩種途徑：一是從大豆中直接提取，二是由結合型大 豆異黃酮轉化而來。與轉化相關的技術主要有酸堿水解法、酶水解法，最主要的酶有葡萄 糖苷酶、葡萄糖酸酶、α-半乳糖苷酶、乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等;微生物降解法，對產 葡萄糖苷酶的菌種研究主要集中在酵母、曲霉、木霉以及細菌。綜合目前的相關研究，存 在的問題是，大豆苷元的提取率和轉化率都比較低，市售的大豆異黃酮產品總黃酮含量在 30%~80%，而且其中苷元含量也很低。

【發明內容】

[0008] 本發明是要解決現有轉化方法大豆苷元的轉化率，純度低的問題，提供一種大豆 苷元的制備方法。
[0009]本發明大豆苷元的制備方法，按以下步驟進行：
[00? 0] -、原料熱處理:對原料進行預處理，預處理的具體方法為炒制，炒制時間為103s， 炒制溫度為130~140°C;所述原料為大豆異黃酮；
[0011]二、發酵：
[0012]將步驟一炒制過的原料加入到BHI液體培養中，然后接入河生腸桿菌LJ-G1菌液， 接種量為5%，發酵條件為:初始pH為7.8~8.2，溫度為38~40°C，時間為38~40h;
[0013]三、耦合酶解發酵：
[0014]將液態黑曲霉β_葡萄糖苷酶稀釋8000倍后，與質量分數2%的海藻酸鈉緩沖溶液 混合均勻，然后用注射器緩慢的滴入到質量分數2%的殼聚糖溶液和質量分數2%的CaC12 溶液組成的混合液中，形成微膠囊，然后將其放于4°C硬化2h，再用真空抽濾機進行抽濾，移 至體積分數〇. 2%的戊二醛中，于40~45°C交聯1~1.5h，用蒸餾水洗滌3遍，沖去未結合的 游離酶以及固定化酶表面的戊二醛，得到海藻酸鈉-殼聚糖-β_葡萄糖苷酶-固定化酶；
[0015] 待步驟二的發酵時間剩余3~4h時，添加固定化酶于發酵液中，進行耦合酶解發 酵，初始pH為6.5~7.5、酶解時間為3~4h，得酶解發酵液；
[0016] 四、純化干燥：
[0017] 將酶解發酵液于3000~3500r/min離心30~40min，取上清液用活性炭進行脫色30 ~40min，每50mL上清液加入3g活性炭，再經大孔樹脂純化，得到大豆苷元甲醇溶液，旋轉蒸 發除去溶劑，干燥，制得大豆苷元產品。
[0018] 步驟一中所述大豆異黃酮購買自石家莊健禾生物科技有限公司。
[0019] 步驟二中所述河生腸桿菌LJ-G1已于2014年在文獻《一株素食者產雌馬酚腸道菌 的分離與鑒定》(李笑梅.賈冰心.食品科學，2014年03期）中公開。
[0020] 步驟二中河生腸桿菌LJ-G1菌液的活菌數為55 X 105CFU/mL。
[0021] 步驟二中炒制過的原料質量與BHI液體培養基的體積比為lg: 166mL。
[0022] 步驟三中稀釋后的黑曲霉β_葡萄糖苷酶液與海藻酸鈉緩沖溶液的體積比是1:10。 [0023] 步驟三所述混合液中殼聚糖溶液和CaCl2溶液的體積比為1:1。
[0024]步驟三中加了酶的海藻酸鈉緩沖溶液與混合液的體積比為11:20。
[0025]步驟三中固定化酶的質量與發酵液的體積比為1 g: 14.5mL。
[0026]步驟三中質量分數2 %的海藻酸鈉緩沖溶液是由海藻酸鈉和緩沖溶液組成，其中 海藻酸鈉的質量分數為2%，緩沖溶液由0.2mol/l磷酸二氫鈉和O.lmol/1醋酸組成，pH為5。 [0027]步驟四中大孔樹脂純化條件為:料液比1:1.8，pH為4,解析時間為6~7h。
[0028] 本發明的有益效果：
[0029] 1、本發明方法對原料進行熱處理的目的是將結合型大豆異黃酮糖苷結構中糖苷 鍵處理成易于酶水解狀態，其中炒制的方法更有利于對大豆苷元的轉化，而且具有設備簡 單、成本低、易于實現的特點。
[0030] 2、本發明方法將黑曲霉β-葡萄糖苷酶束縛在載體上，使得價格昂貴的β-葡萄糖苷 酶可以反復使用，降低成本。
[0031] 3、本發明方法是集物理加熱、酶解、微生物發酵于一體的復合技術，設備、工藝條 件較簡單，易于實現，適合工業化生產。而且酶利用率高，產生的廢液污染小，易處理。本發 明方法的大豆苷元轉化率可達到60%~76.8%，制備的產品大豆苷元的純度可達35%~ 47.3%〇
【附圖說明】
[0032]圖1為實施例2中三種預處理方法對大豆苷元含量變化的影響。
【具體實施方式】
[0033] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0034] 一:本實施方式大豆苷元的制備方法，按以下步驟進行：
[0035] -、原料熱處理:對原料進行預處理，預處理的具體方法為炒制，炒制時間為103s， 炒制溫度為130~140°C;所述原料為大豆異黃酮；
[0036]二、發酵：
[0037]將步驟一炒制過的原料加入到BHI液體培養中，然后接入河生腸桿菌LJ-G1菌液， 接種量為5%，發酵條件為:初始pH為7.8~8.2，溫度為38~40°C，時間為38~40h;
[0038]三、耦合酶解發酵：
[0039]將液態黑曲霉β_葡萄糖苷酶(為市售商品）稀釋8000倍后，與質量分數2%的海藻 酸鈉緩沖溶液混合均勻，然后用注射器緩慢的滴入到質量分數2%的殼聚糖溶液和質量分 數2%的CaCl2溶液組成的混合液中，形成微膠囊，然后將其放于4°C硬化2h，再用真空抽濾 機進行抽濾，移至體積分數0.2%的戊二醛中，于40~45°C交聯1~1.5h，用蒸餾水洗滌3遍， 沖去未結合的游離酶以及固定化酶表面的戊二醛，得到海藻酸鈉-殼聚糖-β-葡萄糖苷酶-固定化酶；
[0040]待步驟二的發酵時間剩余3~4h時，添加固定化酶于發酵液中，進行耦合酶解發 酵，初始pH為6.5~7.5、酶解時間為3~4h，得酶解發酵液；
[0041 ] 四、純化干燥：
[0042] 將酶解發酵液于3000~3500r/min離心30~40min，取上清液用活性炭進行脫色30 ~40min，每50mL上清液加入3g活性炭，再經大孔樹脂純化，得到大豆苷元甲醇溶液，旋轉蒸 發除去溶劑，干燥，制得大豆苷元產品。
[0043]步驟一中所述大豆異黃酮購買自石家莊健禾生物科技有限公司。
[0044]步驟三中所述河生腸桿菌LJ-G1已于2014年在文獻《一株素食者產雌馬酚腸道菌 的分離與鑒定》(李笑梅.賈冰心.食品科學，2014年03期）中公開。
【具體實施方式】 [0045] 二:本實施方式與一不同的是:步驟二中河生腸桿菌 LJ-G1菌液的活菌數為55 X 105CFU/mL。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0046] 三:本實施方式與一不同的是: