步驟二中炒制過的原 料質量與BHI液體培養基的體積比為lg: 166mL。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0047] 四：本實施方式與一不同的是:步驟三中稀釋后的黑 曲霉葡萄糖苷酶液與海藻酸鈉緩沖溶液的體積比是1:10。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0048]五:本實施方式與一不同的是:步驟三所述混合液中 殼聚糖溶液和CaCl2溶液的體積比為1:1。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0049] 六:本實施方式與一不同的是:步驟三中加了酶的海 藻酸鈉緩沖溶液與混合液的體積比為11:20。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0050] 七:本實施方式與一不同的是:步驟三中固定化酶的 質量與發酵液的體積比為lg: 14.5mL。其它與一相同。
[0051]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟四中大孔樹脂純 化條件為:料液比1:1.8，pH為4，解析時間為6~7h。其它與【具體實施方式】一相同。
[0052]為驗證本發明的有益效果，進行以下試驗：
[0053] 實施例1:
[0054]本實施例大豆苷元的制備方法，按以下步驟進行：
[0055] -、原料熱處理:對原料進行預處理，預處理的具體方法為炒制，炒制時間為103s， 炒制溫度為134°C;所述原料為大豆異黃酮;經檢測其大豆苷元轉化率達到67.35%。
[0056]二、發酵：
[0057]將步驟一炒制過的原料加入到BHI液體培養中，然后接入河生腸桿菌LJ-G1菌液， 接種量為5%，發酵條件為:初始pH為8,溫度為38°C，時間為38h;
[0058]三、耦合酶解發酵：
[0059]將液態黑曲霉β_葡萄糖苷酶(為市售商品）稀釋8000倍后，與質量分數2%的海藻 酸鈉緩沖溶液混合均勻，然后用注射器緩慢的滴入到質量分數2%的殼聚糖溶液和質量分 數2%的CaC12溶液組成的混合液中，形成微膠囊，然后將其放于4°C硬化2h，再用真空抽濾 機進行抽濾，移至體積分數0.2%的戊二醛中，于40°C交聯lh，用蒸餾水洗滌3遍，沖去未結 合的游離酶以及固定化酶表面的戊二醛，得到海藻酸鈉-殼聚糖-β_葡萄糖苷酶-固定化酶；
[0060] 待步驟二的發酵時間剩余3h時，添加固定化酶于發酵液中，進行耦合酶解發酵，初 始pH為7、酶解時間為3h，得酶解發酵液；
[0061] 四、純化干燥：
[0062] 將酶解發酵液于3000r/min離心30min，取上清液用活性炭進行脫色30min，每50mL 上清液加入3g活性炭，再經大孔樹脂純化，得到大豆苷元甲醇溶液，旋轉蒸發除去溶劑，干 燥，制得大豆苷元產品。
[0063]步驟一中所述大豆異黃酮購買自石家莊健禾生物科技有限公司。
[0064]步驟二中所述河生腸桿菌LJ-G1已于2014年在文獻《一株素食者產雌馬酚腸道菌 的分離與鑒定》(李笑梅.賈冰心.食品科學，2014年03期）中公開。
[0065] 步驟二中河生腸桿菌LJ-G1菌液的活菌數為55 X 105CFU/mL。
[0066] 步驟二中炒制過的原料質量與BHI液體培養基的體積比為3g: 50mL。
[0067] 步驟三中稀釋后的黑曲霉β_葡萄糖苷酶液與海藻酸鈉緩沖溶液的體積比是1:10。 [0068] 步驟三所述混合液中殼聚糖溶液和CaCl2溶液的體積比為1:1。
[0069]步驟三中加了酶的海藻酸鈉緩沖溶液與混合液的體積比為11:20。
[0070]步驟三中固定化酶的質量與發酵液的體積比為1 g: 14.5mL。
[0071] 步驟四中大孔樹脂純化條件為:料液比1:1.8，pH為4,解析時間為6h。
[0072] 本實施例的大豆苷元轉化率為76.8%，制備的產品大豆苷元的純度為47.3%。 [0073] 實施例2:
[0074]采用烘箱、微波和炒制三種預處理方法對原料進行處理，并與液態黑曲霉β_葡萄 糖苷酶處理相結合，考察不同預處理方法對大豆苷元含量變化的影響。結果如圖1所示。 [0075]由圖1可知，經過烘箱、微波處理以后與原料相比，大豆苷元含量變化不顯著(P> 0.05)，經炒制處理大豆苷元含量變化顯著(P<0.05)，具有統計學意義，高出原料34.29% ; 炒制后再經酶解大豆苷元含量變化，均顯著高于只經酶解和烘箱干燥、微波加酶解(P< 0.05)，高于只經酶解37.24%。
【主權項】
1. 大豆苷元的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進行： 一、 原料熱處理:對原料進行預處理，預處理的具體方法為炒制，炒制時間為103s，炒制 溫度為130~140 °C;所述原料為大豆異黃酮； 二、 發酵： 將步驟一炒制過的原料加入到BHI液體培養中，然后接入河生腸桿菌LJ-G1菌液，接種 量為5%，發酵條件為:初始pH為7.8~8.2，溫度為38~40°C，時間為38~40h; 三、 耦合酶解發酵： 將液態黑曲霉β-葡萄糖苷酶稀釋8000倍后，與質量分數2%的海藻酸鈉緩沖溶液混合 均勻，然后用注射器緩慢的滴入到質量分數2%的殼聚糖溶液和質量分數2%的CaC12溶液 組成的混合液中，形成微膠囊，然后將其放于4°C硬化2h，再用真空抽濾機進行抽濾，移至體 積分數0.2%的戊二醛中，于40~45°C交聯1~1.5h，用蒸餾水洗滌3遍，沖去未結合的游離 酶以及固定化酶表面的戊二醛，得到海藻酸鈉-殼聚糖-β_葡萄糖苷酶-固定化酶； 待步驟二的發酵時間剩余3~4h時，添加固定化酶于發酵液中，進行耦合酶解發酵，初 始pH為6.5~7.5、酶解時間為3~4h，得酶解發酵液； 四、 純化干燥： 將酶解發酵液于3000~3500r/min離心30~40min，取上清液用活性炭進行脫色30~ 40min，每50mL上清液加入3g活性炭，再經大孔樹脂純化，得到大豆苷元甲醇溶液，旋轉蒸發 除去溶劑，干燥，制得大豆苷元產品。2. 根據權利要求1所述的大豆苷元的制備方法，其特征在于步驟二中河生腸桿菌LJ-G1 菌液的活菌數為55 X 105CFU/mL。3. 根據權利要求1所述的大豆苷元的制備方法，其特征在于步驟二中炒制過的原料質 量與BHI液體培養基的體積比為1 g: 166mL。4. 根據權利要求1所述的大豆苷元的制備方法，其特征在于步驟三中稀釋后的黑曲霉 β-葡萄糖苷酶液與海藻酸鈉緩沖溶液的體積比是1:10。5. 根據權利要求1所述的大豆苷元的制備方法，其特征在于步驟三所述混合液中殼聚 糖溶液和CaC12溶液的體積比為1:1。6. 根據權利要求1所述的大豆苷元的制備方法，其特征在于步驟三中加了酶的海藻酸 鈉緩沖溶液與混合液的體積比為11:20。7. 根據權利要求1所述的大豆苷元的制備方法，其特征在于步驟三中固定化酶的質量 與發酵液的體積比為lg: 14.5mL。8. 根據權利要求1所述的大豆苷元的制備方法，其特征在于步驟四中大孔樹脂純化條 件為:料液比1:1.8，pH為4，解析時間為6~7h。
【專利摘要】大豆苷元的制備方法，涉及一種大豆苷元的制備方法。本發明是要解決現有轉化方法大豆苷元的轉化率，純度低的問題。方法：一、原料熱處理；二、發酵；三、耦合酶解發酵；四、純化干燥，制得大豆苷元產品。本發明方法是集物理加熱、酶解、微生物發酵于一體的復合技術，設備、工藝條件較簡單，易于實現，適合工業化生產。而且酶利用率高，產生的廢液污染小，易處理。本發明方法的大豆苷元轉化率可達到60％～76.8％，制備的產品大豆苷元的純度可達35％～47.3％。本發明用于制備大豆苷元。
【IPC分類】C12N11/10, C12P17/06, C12R1/01
【公開號】CN105647987
【申請號】
【發明人】李笑梅, 王金鳳, 楊春華, 馬慧玲
【申請人】哈爾濱商業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月29日