子IF3編碼基因的克隆
[0073] 1.1大腸桿菌K12基因組DNA的提取
[0074] 參照百泰克公司基因組提取試劑盒說明書提取基因組DNA。
[0075] 1.2引物設計與合成
[0076]根據IF3編碼基因序列設計兩條引物：
[0077] F:GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，
[0078] R:CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG，
[0079]由上海生工生物技術公司合成。
[0080] 1.3利用PCR進行基因序列擴增及產物回收
[0081 ] (1)以F和R為引物，以基因組DNA為模板，進行PCR擴增;PCR反應條件為:95°C預變 性 5min;95°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 個循環；72°C 終延伸 5min。 [0082] PCR擴增體系（50yL)如下： 滅菌蒸餾水 32.2 μL 5xTransStart FastPfu _壤}命版 10 μL^. L〇〇83J dNTP 混合物 ' 5 pL 引物F (50μΜ) 0.4 .uL 引物R (50μΜ ) 0.4 [iL
[0084] 基因組 DNA 1 pL Trans Start FastPfu DNA 1 tiL
[0085] (2)對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果獲得一條約500bp的DNA片段。然 后用Omega公司的DNA回收試劑盒按照其說明回收擴增出的DNA片段，制得基因 if3。
[0086] 2.表達載體及表達菌株的構建
[0087] (i)DNA片段與表達載體酶切
[0088] 將制得的基因 if3和載體pET_22b用Ndel和Xhol雙酶切，酶切反應體系如下： 緩沖液 2 μL. 基因矽或載體pET-22b S jxL
[0089] Ndcl _1 μL^. Xhol 1 pL 滅菌蒸餾水 8 pL
[0090] 蓋緊蓋子，手指輕彈離心管，混勻樣品，在離心機上瞬時離心2sec，把樣品集中在 管底，37°C溫浴30min。
[0091] (ii)對酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠，然后用Omega公司的 DNA回收試劑盒按照其說明回收目的DNA片段。
[0092] (iii)DNA片段與表達載體連接
[0093]連接反應體系如下：
[0094] 酶切后的載體pET-22b lyL
[0095] 酶切后的基因if 3 4yL
[0096] Solution I 5yL
[0097] 蓋緊蓋子，手指輕彈離心管，混勻樣品，在離心機上瞬時離心2sec，把樣品集中在 管底，16 °C連接過夜。
[0098] (iv)按《分子克隆實驗指南》上的熱激轉化方法將連接好的重組pET-22b_if3載體 轉至大腸桿菌BL21(DE3)感受態。
[0099] (v)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)涂于含lOOyg/l氨芐青霉素 LB培養基，37°C過夜培 養。
[0100] (vi)轉化子送上海生工生物技術有限公司測序驗證，獲得轉入重組pET-22b-if·3 載體的表達菌株。
[0101] 實施例2
[0102] 1.重組菌株的發酵培養
[0103] (1)種子的培養
[0104] 挑取平板上的轉入重組pET-22b-if3載體的表達菌株到100mL加入了終濃度為100 Pg/mL氨芐青霉素的液體LB培養基中，37°C，180rpm過夜培養。
[0105] (2)按照1%接種量，將培養好的種子液轉接到裝液量為1L的搖瓶中。37°C，180rpm 培養至菌液在波長為600nm吸光度為0.8時，將培養條件改為20°(：，120印111，繼續培養3〇1^11 后，加入終濃度為0.1 mM的IPTG。繼續培養24hr。
[0106] 2.提純IF3蛋白
[0107] (1)提純蛋白所用的緩沖液為
[0108] 裂解緩沖液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0。
[0109] 沖洗緩沖液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0。
[0110] 洗脫緩沖液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。
[0111] (2)10000rpm離心5min收集菌體，按照1L菌液收集的菌體用50mL裂解緩沖液的比 例加入裂解緩沖液重懸菌體，壓力（lOOObar)破碎細胞。
[0112] (3)將步驟(2)得到的細胞破碎液，在4 °C溫度下，12000rpm離心50min去除不可溶 沉淀。
[0113] (4)將上述離心后的上清液，上樣鎳柱(每根鎳柱裝2mL鎳膠）。待上清液流過鎳膠 后，每根鎳柱用20mL裂解緩沖液平衡，之后每根鎳柱用20mL沖洗緩沖液沖洗。最后每根鎳柱 用10mL的洗脫緩沖液洗脫蛋白。即得到提純的目的蛋白IF3。
[0114] 實施例3
[0115] 1.2' 環形核苷單磷酸混合物的提取
[0116] (1)將洗脫得到的目的蛋白，0°C靜置3d，此時蛋白溶液將會出現明顯的沉淀。將蛋 白溶液12000rpm離心20min，得到上清液。
[0117] (2)將步驟（1)中得到的上清液，用截留分子量為3K的超濾管超濾，去除殘留的蛋 白，超濾膜濾過液即為含有4種2' 環形核苷單磷酸溶液。
[0118] 2.四種環形核苷酸2/，3/-〇厶103,2 /，3/-〇6103,2/，3/-(^10 3和2/，3/-(：1]]\03純品的提 取
[0119] (1)將得到的2' 環形核苷單磷酸溶液，采用C 18反向色譜柱進行高效液相色譜 分離得到四種2'，3~環形核苷單磷酸純品。所用的流動相為:A液，10mM醋酸銨溶液，pH 5 · 0; B液，75 % A液加入25 %甲醇。
[0120] (2)上述步驟中所用的分離程序為:Omin，B液0 % ; 2.5min，B液0% ; 5min，B液30 % ; 10min，B液60% ;14min，B液 100% ;21min，B液 100% ;22min，B液50% ;23min，B液0% ;30min， B液0%。流速為10ml/min，檢測波長為254nm〇
[0121] 對上述4種2' 環形核苷單磷酸溶液進行HPLC分析，結果如圖2所示，對上述4種 2'，3'-環形核苷單磷酸溶液進行液相色譜和質譜分析，結果如圖3-6所示。
【主權項】
1. 一種提取2 '，3 環形核巧單憐酸的方法，包括如下步驟： (1) 提取大腸埃希氏菌化sche;richiacol；OK12菌株的基因組DNA，利用PCR擴增編碼 IF3蛋白的基因 if 3，制得基因 if 3; 所述PCR特異引物序列如下：(2) 將步驟（1)制得的基因 if3酶切后與同樣經酶切的表達質粒PET-22b連接，然后轉化 到E.COli BL2UDE3)菌株中，進行發酵培養，制得重組菌發酵液； (3) 分離步驟(2)制得的重組菌發酵液中的菌體，破碎細胞，儀柱親和層析提純重組蛋 白IF3，然后(TC靜置2.5~3.5d，固液分離，取上清液； (4) 將步驟(3)制得的上清液經超濾去除蛋白雜質，濾液經Cis反向色譜柱進行高效液相 分離，分別制得含四種2 '，3 環形核巧單憐酸溶液。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PCR擴增體系如下： 滅菌蒸溜水 32.2叫^ S^Tf-cmsSki" FustPfii 選)、\、彼 IOjiL dNTP混合物 5咕 50 JiM引物F 0.4 IiL 50 IiM引物民 化4iiL 基因組DNA 1 JiL 7>"".s'57"W F".s7戶Z" DNA 巧合晦 I PCR反應條件如下： 95°C 預變性 5min;95°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 個循環；72°C 終 延伸5min。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中酶切采用限制性內切酶NdeI 和化Ol進行雙酶切，酶切反應體系如下： 緩沖液 2:呼 表達質粒PET-22b或基因於 S jiL 限制性巧切酶NdeI 1 LiL 限制性內切酶XhoI 1陣 滅菌蒸溜水 8 IiL 反應條件:37°C溫浴30min。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中連接的反應體系如下： 酶切后的載體祀T-22b化L 酶切后的基因if 3 化L Solution I 姐L 反應條件：16 °C連接過夜。5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，發酵培養步驟如下： 先在35~38°C、150~2(K)rpm條件下擴大培養至菌液在波長為600皿吸光度為0.8;然后 在18~22°C、100~14化pm繼續培養30min;再加入終濃度為O.lmM的IPTG，繼續誘導培養22 ~25小時； 所述發酵培養基為淡水LB培養基，組分如下： IOg化Cl, IOg蛋白腺，5g酵母粉，pH 8.0,蒸饋水定容至IL。 根據本發明優選的，所述步驟(3)中，破碎細胞步驟如下： 將分離得到的菌體重懸于裂解緩沖液中，在壓力為950~IOSObar的條件下破碎細胞， 12000巧m離屯、50min，取上清液； 所述的裂解緩沖液組分為：50mM化is-肥l、150mM化Cl，pH8.0。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，儀柱親和層析提純重組蛋白 IF3步驟如下： 將破碎細胞后的上清液上樣儀柱，每根儀柱裝2mL儀膠，待上清液流過儀膠后，每根儀 柱用20mL裂解緩沖液平衡，用20mL沖洗緩沖液沖洗，最后用IOmL的洗脫緩沖液洗脫，制得重 組蛋白IF3溶液； 所述裂解緩沖液組分為:50mM ^is-HCLlSOmM化Cl,pH 8.0; 所述沖洗緩沖液組分為：50mM his-肥l、150mM化Cl、20mM咪挫，pH 8.0; 所述洗脫緩沖液組分為：50mM his-肥l、150mM化Cl、250mM咪挫，pH 8.0。7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，超濾為采用截留分子量為3K 的超濾管超濾。8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述Cis反向色譜柱進行高效 液相分離的分離程序為:Omin, B液0 %; 2.5min，B液0 %; 5min，B液30 %; IOmin，B液60 %; 14min，B液 100% ;21min，B液 100% ;22min，B液50% ;23min，B液0% ;30min，B液0% ;流速為 lOml/min，檢測波長為254nm; 流動相為:A液，IOmM醋酸錠溶液，pH 5.0; B液，將A液與甲醇按體積比3:1的比例混合。
【專利摘要】本發明涉及一種提取2′,3′-環形核苷單磷酸的方法，包括如下步驟：(1)提取基因組DNA，PCR擴增，制得基因if3；(2)將基因if3與表達質粒連接，轉化后，經發酵培養，制得重組菌發酵液；(3)分離重組菌發酵液中的菌體，破碎細胞，鎳柱親和層析提純，靜置，固液分離，取上清液；(4)將上清液經超濾去除蛋白雜質，經C18反向色譜柱進行高效液相分離，分別制得含四種2′,3′-環形核苷單磷酸溶液。本發明提供的方法首次實現了從大腸桿菌中同時直接提取四種2′,3′-環形核苷單磷酸。通過微生物生物發酵，從頭合成四種2′,3′-環形核苷單磷酸，不需要特定的前體物，無化學合成法的污染，簡單方便，每升培養液可提取5mg的四種純品2′,3′-環形核苷單磷酸。
【IPC分類】C12P19/30, C12R1/19, C07K14/245, C12P19/32
【公開號】CN105647995
【申請號】
【發明人】陳秀蘭, 張玉忠, 劉昂, 于洋, 解彬彬, 秦啟龍, 宋曉妍, 石梅
【申請人】山東大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月29日