固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及三磷酸腺苷的制備方法，特別涉及一種固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法。
【背景技術】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)是一種由一個腺嘌呤，一個核糖和三個磷酸基團組成的高能化合物，分子式CiqH16N5O13P3，分子量為507。它是生物體內的能量轉換器和貯存器，在人體能量代謝中起著重要的作用，作為代謝的中間體、輔酶參與生物體內脂肪、蛋白質、糖類和核酸等的代謝。在臨床應用上，ATP已作為治療試劑，對進行性肌肉萎縮、中風后遺癥、心肌梗塞、心肌炎、冠狀動脈硬化、肝炎等病癥具有良好的治療和輔助治療作用。近年來國外學者結合ATP和腺苷(Ado)、環化腺苷酸(cAMP)的構效關系，及其受體的生理作用，認為ATP在防治腫瘤，調節神經等方面具有明顯作用。因此，ATP的生物體外合成研究和臨床應用實驗，無論在生理醫學還是工業應用上都具有重要意義。
[0003]ATP的合成主要有化學合成法、酶催化合成、光合磷酸化和氧化磷酸化、微生物酶系催化合成等方法。利用酵母菌的糖酵解途徑，以腺苷Ado或腺苷酸(AMP)為底物，進行基質水平磷酸化合成ATP是最常用的方法，也是目前工業化生產ATP普遍采用的方法。然而，經酵母細胞酶系催化合成ATP的反應過程復雜，參與催化反應的酶系眾多，反應過程不易控制，產品批次間質量差異較大。同時酵母酶系質量常因供應的廠家不同、批次不同、甚至季節不同而有很大差異。酵母細酶系質量不穩定，酶活力下降快，使用壽命短，一般是一次性使用。反應過程需要加入大量的酵母細胞酶液，引入了大量的蛋白、色素等雜質給后期純化帶來了很大的困難。目前，我國ATP生產水平總體還比較低，產品的產量、成本控制、產品質量等方面還有所欠缺。面對以上的技術問題，急需開發新型穩定的反應工藝，簡化反應過程提高產品的質量。
[0004]研究表明，在某些細菌體內存在著依賴于多聚磷酸鹽的酶系，可利用ADP或AMP生成ATP。該酶系包含多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1，Ppk)、AMP激酶(EC 2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-AMP磷酸轉移酶(EC 2.7.4.-,Pap),本發明中統稱三種酶為“ATP生產酶”。其中，Ppk催化ADP與聚磷酸鹽類化合物反應生成ATP，Adk催化2分子ADP生成I分子ATP和I分子AMP，Pap則催化AMP與聚磷酸鹽類化合物反應生成ADP，三種酶的合理組合均可用于合成ATP(參見圖1)。為解決酵母酶系生產ATP存在的一系列問題，本發明利用ATP生產酶制備ATP，生產工藝更簡單。在實際應用中酶的成本昂貴，利用游離酶生產ATP，酶活下降迅速，無法有效的回收利用，勢必會導致生產成本過高，影響了實際應用價值。本發明將ATP生產酶固定化，可實現酶的重復和連續利用，大大降低了生產成本，同時固定化酶的使用，產物更容易純化產品質量更加穩定。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，從而克服現有技術的上述缺陷。
[0006]本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的:
[0007]一種固定化酶制備三磷酸腺苷的方法，包括以下步驟:
[0008](I)制備固定化ATP生產酶:
[0009]將ATP生產酶固定于固定化載體上，制得固定化ATP生產酶。
[0010](2)固定化ATP生產酶制備ATP:
[0011]利用固定化ATP生產酶，以AMP或ADP為底物，以聚磷酸類化合物為磷酸供體，催化制備獲得ATP反應液。
[0012](3)分離產物三磷酸腺苷(ATP):
[0013]ATP反應液經層析分離結晶干燥，得到ATP成品。
[0014]優選地，上述技術方案中，步驟(I)所述的AT P生產酶選自多聚磷酸激酶(E C2.7.4.1,Ppk),腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉移酶(EC 2.7.4.-，Pap)中的任意兩種酶或三種酶的組合。
[0015]其中，當選用Ppk與Pap兩種酶組合時，Ppk與Pap的質量比例為(20-0.05):1，優選的為(10_0.1):1。
[0016]其中，當選用Pap與Adk兩種酶組合時，Pap與Adk質量比例為(20-0.2): I，優選的為(20-0.5):lo
[0017]其中，當選用Ppk與Adk兩種酶組合時，Ppk與Adk質量比例為(20-0.2):1，優選的為(20-0.5):lo
[0018]其中，當選用Ppk、Pap與Adk三種酶組合時，Ppk、Pap與Adk質量比例為(20:0.2):(20-0.2):1，優選的為(20-0.5):(20-0.5):1。
[0019]上述的Ppk、Adk、Pap可以來源于任何生物、或者是經過人工改造具有同樣催化功能的酶。其中，Ppk酶包括Ppkl酶與Ppk2酶。
[0020]優選地，上述技術方案中，步驟(I)所述固定化載體選自高分子載體、無機載體、磁性高分子微球載體中的一種或多種。其中高分子載體選自纖維素、葡萄糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸鈉、殼聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明膠、卡拉膠、尼龍、合成高聚物等;無機載體選自多孔玻璃、氧化娃、娃膠、活性炭、娃藻土等。
[0021]優選地，上述技術方案中，所述高分子載體中含有酯基或芳香氨基、羥基、羧基、羧甲基、醛基、環氧基和氨基功能基團中的至少一個基團。所述的固定化ATP生產酶通過下列方式固定于固定化載體:吸附、包埋、共價、結合、交聯或其組合。Pap、Adk、Ppk三種酶可分別固定或按比例混合后一起固定。
[0022]優選地，上述技術方案中，步驟(2)催化制備三磷酸腺苷反應液的反應條件為:反應溫度為25-60°C ;反應pH為5-10的條件下;反應體系包括:聚磷酸類化合物和鎂離子;在反應體系中添加AMP或ADP，利用固定化ATP生產酶催化反應生成ATP反應液。另外，反應體系中還可包含銨離子、錳離子、鉀離子、鈉離子和Tris或磷酸根離子。本發明添加的底物、酶及各類鹽可一次性加入反應體系，也可按照工業生產工藝流程分批次流加補入。
[0023]優選地，上述技術方案中，聚磷酸類化合物選自多聚偏磷酸或其鹽及多聚磷酸或其鹽中的一種或多種。
[0024]優選地，上述技術方案中，所述催化反應為在反應罐中添加固定化ATP生產酶進行攪拌反應;或是將固定化ATP生產酶裝入酶反應柱(簡稱:酶柱)中，將AMP或ADP底物溶液通過酶反應柱進行間歇或連續反應。
[0025]優選地，上述技術方案中，所述反應體系中AMP或ADP的濃度為2mM-80mM、聚磷酸類化合物(以磷酸根計)濃度為4mM-lM、鎂離子濃度為2mM-l 50mM。
[0026]優選地，上述技術方案中，所述的固定化載體與ATP生產酶的質量比例為1:1-150:1，優選的為2:1-100:1。
[0027]優選地，上述技術方案中，所述攪拌反應中固定化ATP生產酶的添加量為5_200g/L，優選的為10-100g/L。
[0028]優選地，上述技術方案中，所述攪拌反應中固定化ATP生產酶采用過濾、離心方式回收。
[0029]優選地，上述技術方案中，所述底物溶液通過所述酶反應柱的流量為酶柱體積的0.01 -50倍體積/小時，優選為酶柱體積的0.2-5倍體積/小時。根據酶柱穿出液的底物轉化率情況，決定是否繼續通過酶柱循環反應還是后續處理。反應過程通過高效液相色譜檢測底物濃度及轉化率。
[0030]本發明利用固定化ATP生產酶制備ATP的技術方案還可用于ATP的再生，可用于其他任何需要ATP提供能量的酶催化反應體系中，將AMP、ADP再生為ATP。
[0031]本發明上述技術方案，具有如下有益效果:
[0032](I)采用新型Ppk、Adk、Pap三種ATP生產酶，只需兩步酶促反應即可合成ATP，與傳統啤酒酵母生產ATP繁瑣的工藝過程相比，反應過程更簡單，反應更容易控制，產品質量更加穩定。
[0033](2)采用固定化酶催化的方法制備ATP，固定化酶可連續、反復多次使用，大幅的降低了生產成本。同時避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等雜質，更加易于純化。
[0034](3)建立了適用于大規模生產ATP的間歇攪拌反應及酶反應柱連續反應體系。
【附圖說明】
[0035]圖1為本發明Pap、Adk、Ppk生成ATP的催化原理圖。
[0036]圖2為本發明所表達的Pap、Adk、Ppk酶的SDS-PAGE圖。
[0037]圖3A為本發明固定化ATP生產酶生成ATP的攪拌反應工藝流程圖。
[0038]圖3B為本發明固定化ATP生產酶生成ATP的酶反應柱工藝流程圖。
[0039]圖4為本發明實施例2經酶反應后反應液的HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0040]下面對本發明的具體實施例進行詳細描述，以便于進一步理解本發明。
[0041 ] 實施例1 Ppk、Adk和Pap酶的制備
[0042]本發明方法中的Ppk、Adk和Pap酶可以商購獲得，或者是經過人工改造具有同樣催化功能的酶。
[0043]Ppk、Adk和Pap酶的制備過程如下:
[0044]根