雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗氧化活性肽的制備方法，具體涉及一種雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]鯊魚全身是寶，有的種類肉質鮮美，是餐桌上常見的菜肴。魚皮具有良好的韌性，是皮革加工業的原料。現代醫學證明鯊魚軟骨具有很大的藥用價值，1992年美國首先將鯊魚軟骨粉直接用于臨床治療腫瘤。雙髻鯊(Sphyrna lewini)為軟骨魚綱，真鯊目，雙髻鯊科，在我國主要分布于黃海、東海和南海。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀提供一種能夠清除自由基和抑制脂質過氧化作用的雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法。
[0004]本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，其包括以下步驟:
I)雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取雙髻鯊軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的雙髻鯊軟骨浸于4?6倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7?8)，于4 °C下攪拌抽提36?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min離心15?25 min，棄殘渣收集上清液;上清液繼續在4°C、10000?12000 r/min離心15?25 1^11，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)緩沖液于4 °C下透析24?48 h，透析袋內溶液即為雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物。
[0005]2)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物在冰浴下緩慢加入預冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速離心20 min，取上清液，加入預冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得雙髻鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，即為60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0006]3)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取雙髻鯊軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9\1041]/^)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液。
[0007]4)雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0008]作為優選，所述的步驟I)中的雙髻藍為雙髻藍(Sphyrna Iewini)。
[0009]作為優選，所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性得I個高活性抗氧化肽Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)，ESI_MS測定分子量為950.03 Da0
[0010]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量10?15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX
4.6mm,5 μπι)；流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.6~1.0 mL/min;紫外檢測波長280 nm。
[0011]與現有技術相比，本發明所提供的雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時,Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
[0012]
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明的DEAE-52離子交換樹脂層析圖。
[0014]圖2是本發明的葡聚糖凝膠SephadexG_15層析圖。
[0015]圖3葡聚糖凝膠SephadexG-15制備酶解物的RP-HPLC^H
[0016]圖4Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)的質譜圖。
[0017]圖5Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)的抗脂質氧化能力。
【具體實施方式】
[0018]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019]實施例:
雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:雙髻鯊軟骨—軟骨總蛋白—軟骨60%丙酮沉淀蛋白—胰蛋白酶酶解—酶解物—超濾—離子交換層析—凝膠過濾層析—高效液相色譜制備—抗氧化肽。
[0020]I)雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取雙髻鯊(Sphyrna lewini)軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的雙髻鯊軟骨浸于4倍體積的 1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA’pH 7.0)，于4 °C下攪拌抽提48 h。提取液在4 °C下以5000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液;上清液繼續在
40C ,12000 r/min離心20 min，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)緩沖液于4 °C下透析48 h，透析袋內溶液即為雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物。
[0021]2)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物，在冰浴下緩慢加入預冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置5 h后，于4 0CaOOOO r/min高速離心20 min，取上清液，加入預冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得雙髻鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，得60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0022]3)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取雙髻鯊軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比Ig:4mL溶于Tris-鹽酸緩沖液(0.05mol/L，pH 8.0)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶(1.9\1041]/^)，于40 °C酶解4 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 0C ,12000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液。
[0023]4)雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分(SP60-1)，得到超濾酶解液，將超濾酶解液依