赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種動物軟骨膠原肽的制備方法，具體涉及一種赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]膠原肽是膠原蛋白被蛋白酶降解后的產物，分子量大約在180-3000Da，被認為比較普通膠原蛋白更利人體消化吸收。同時，現有研究證明膠原肽具有多種生物活性，例如抑制血管緊張素轉化酶活性、抗氧化活性，減少膝關節或髖關節等骨關節炎患者的疼痛，增強骨密度，維持骨代謝平衡等。
[0003]赤魟(Dasyatis akajei)，屬軟骨魚綱，下孔總目，鲼形目，魟科，魟屬。赤魟為常見軟骨魚類，分布于我國沿海。研究表明赤魟軟骨含有大量膠原蛋白，可以作為膠原肽的原料進行開發利用。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠清除自由基和抑制脂質過氧化作用的赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備方法。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:一種赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備方法，其包括以下步驟:
I)赤魟軟骨膠原蛋白的制備:將赤魟軟骨曬干、粉碎，按照料液比I g: 15?20 mL加入到NaOH溶液(0.1 mol/L)于I?4°C下浸泡2?4 h，脫除非膠原蛋白；處理后赤魟軟骨用蒸饋水反復洗滌至中性、瀝干，按照料液比I g: 5?8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液(0.5 mol/L)，于I?4 °C下浸泡2?3天(每天更換I次EDTA溶液)，蒸餾水洗滌2?3次，干燥、粉碎，得脫鈣赤魟軟骨粉。將脫鈣赤魟軟骨粉按照料液比I g:5?8 mL加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在I?4°C下動態浸泡3 d,10 OOOg離心20?25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液終濃度為1.0mol/L，靜置60?90 min，12 OOOg離心25?30 min得沉淀物，冷凍干燥即為赤魟軟骨膠原蛋白。
[0006]2)赤魟軟骨膠原蛋白的酶解:將赤魟軟骨膠原蛋白按照料液比I g: 15?20 mL加入到磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.5,0.2 mol/L)，按照膠原蛋白質量的1.0?1.5%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9 X 14 U/g)，于溫度45?50°C酶解3?4 h后，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持8?10 min后，冷卻至45?50°C ；按照膠原蛋白質量的1.5?1.8%向溶液中加入中性蛋白酶(1.0 X 15 U/g),于溫度45?50 0C下酶解6?8 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持15?20 min后，10 OOOg離心20?25 min，取上清液，即為酶解產物；
3)赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備:將上述酶解產物采用3.5 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3.5 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化膠原肽。
[0007]作為優選，所述的步驟I)中的赤魟為赤魟(Dasyatis akajei)。
[0008]作為優選，所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為25?30 mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.9?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于225 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的羥自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為25?30 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G_25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.8?1.0 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于225 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的輕自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成40?50 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對羥自由基的清除活性得I個高活性抗氧化膠原肽Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp (GIEGEEGW)，ESI_MS測定分子量為875.85 Da。
[0009]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量15?20 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX
4.6mm,5 μπι);流動相:40%乙腈;洗脫速度0.8?1.0 mL/min;紫外檢測波長225 nm。
[0010]與現有技術相比，本發明所提供的赤魟軟骨抗氧化膠原肽對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp(GIEGEEGW)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；Gly-1 Ie-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp(GIEGEEGW)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑。
【附圖說明】
[0011 ]圖1是本發明的DEAE-52離子交換樹脂層析圖。
[0012]圖2是本發明的葡聚糖凝膠SephadexG_25層析圖。
[0013]圖3葡聚糖凝膠SephadexG-25制備酶解物的RP-HPLC^H
[0014]圖4Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp (GIEGEEGW)的質譜圖。
[0015]圖5Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp (GIEGEEGW)的抗脂質氧化能力。
【具體實施方式】
[0016]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0017]實施例:
一種赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備方法，制備工藝流程如下:赤魟軟骨—軟骨膠原蛋白—胰蛋白酶和中性蛋白酶雙酶酶解—酶解物—超濾—離子交換層析—凝膠過濾層析—高效液相色譜制備—抗氧化膠原肽。
[00?8] I)赤魟軟骨膠原蛋白的制備:將赤魟(Dasyatis aka jei)軟骨曬干、粉碎，按照料液比I g:18 mL加入到NaOH溶液(0.1 mol/L)于3°C下浸泡3 h，脫除非膠原蛋白；處理后赤魟軟骨用蒸餾水反復洗滌至中性、瀝干，按照料液比I g: 6 mL加入pH 7.4的EDTA溶液(0.5mo I /L)，于4 °C下浸泡3天(每天更換I次EDTA溶液)，蒸餾水洗滌3次，干燥、粉碎，得脫鈣赤魟軟骨粉。將脫鈣赤魟軟骨粉按照料液比I g:6 11^加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在3°C下動態浸泡3 d，10 OOOg離心20 min，取上清液，并加入NaCl至溶液終濃度為1.0 mol/L，靜置90min,12 OOOg離心25 min得沉淀物，冷凍干燥即為赤魟軟骨膠原蛋白。
[0019]2)赤魟軟骨膠原蛋白的酶解:將赤魟軟骨膠原蛋白按照料液比I g:15 mL加入到磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.5,0.2 mol/L)，按照膠原蛋白質量的1.3%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9 X 14 U/g)，于溫度48°C酶解3.5 h后，將溶液升溫至90 V，并于此溫度保持10 min后，冷卻至45°C ；按照膠原蛋白質量的1.6%向溶液中加入中性蛋白酶(1.0 X 15U/g)，于溫度45°C下酶解6 h，將溶液升溫至90°C，并于此溫度保持15 min后，10 OOOg離心20 min，取上清液，即為酶解產物；
3)赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備:將上述酶解產物采用3.5 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3.5 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜