灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種動物軟骨活性肽的制備方法，具體涉及一種灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]灰星鯊(Mustelus griseus)俗名沙條，又稱灰貂鯊，為軟骨魚綱真鯊目皺唇鯊科星鯊屬的一種。分布于西北太平洋區，包括中國南海、東海、黃海、臺灣等海域，以及韓國釜山和木浦和日本南部等海區。
[0003]灰星鯊膽和肝、肉、皮、魚鰭等均能入藥。灰星鯊皮具有解魚蝦毒和消食化積等功效。灰星鯊肉具有健脾益氣，祛瘀消腫，滋補強壯等功效，能夠治療體虛，傷口愈合緩慢，脾虛浮腫等疾病。灰星鯊翅具有滋補強壯，益氣，補虛等功效。灰星鯊皮具有消積，解諸魚毒等功效。灰星鯊膽具有清熱解毒，消腫，活血等功效。灰星鯊骨具有祛風除濕，健脾止瀉，活血止痛等功效。灰星鯊心具有健脾益胃，消痰化飲，益氣開膈等功效。能夠治療因脾胃虛弱引起的內停痰飲，飲食不化，胸腕脹滿，嘔吐泄瀉等癥。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠清除自由基和抑制脂質過氧化作用的灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，其包括以下步驟:
I)灰星鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取灰星鯊軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的灰星鯊軟骨浸于4?6倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7?8)，于4 °C下攪拌抽提36?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min離心15?25 min，棄殘渣收集上清液;上清液繼續在4°C、10000?12000 r/min離心15?25 1^11，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)緩沖液于4 °C下透析24?48 h，透析袋內溶液即為灰星鯊軟骨總蛋白粗提物。
[0006]2)灰星鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取灰星鯊軟骨總蛋白粗提物在冰浴下緩慢加入預冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速離心20 min，取上清液，加入預冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得灰星鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，即為60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0007]3)灰星鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取灰星鯊軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9\1041]/^)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液。
[0008]4)灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0009]作為優選，所述的步驟I)中的灰星藍為灰星藍(Mustelus griseus)。
[0010]作為優選，所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性得I個高活性抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)，ESI_MS測定分子量為905.00 Da0
[0011]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量10?15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX
4.6mm,5 μπι)；流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.6~1.0 mL/min;紫外檢測波長280 nm。
[0012]與現有技術相比，本發明所提供的灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明的DEAE-52離子交換樹脂層析圖。
[0014]圖2是本發明的葡聚糖凝膠SephadexG_15層析圖。
[0015]圖3葡聚糖凝膠SephadexG-15制備酶解物的RP-HPLC^H
[0016]圖4Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)的質譜圖。
[0017]圖5Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)的抗脂質氧化能力。
【具體實施方式】
[0018]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019]實施例:
一種灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:雙髻鯊軟骨"軟骨總蛋白"軟骨60%丙酮沉淀蛋白"胰蛋白酶酶解"酶解物"超濾"離子交換層析"凝膠過濾層析"高效液相色譜制備〃抗氧化肽。
[0020]I)灰星鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取灰星鯊(Mustelus griseus)軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的灰星鯊軟骨浸于4倍體積的 1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA’pH 7.0)，于4。。下攪拌抽提48 h。提取液在4 °C下以5000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液;上清液繼續在4 0C ,12000 r/min離心20 min，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCl(pH 7.6)緩沖液于4 °C下透析48 h，透析袋內溶液即為灰星鯊軟骨總蛋白粗提物。
[0021]2)灰星鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取灰星鯊軟骨總蛋白粗提物，在冰浴下緩慢加入預冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置5 h后，于4 0CaOOOO r/min高速離心20 min，取上清液，加入預冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得灰星鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，得60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0022]3)灰星鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取灰星鯊軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比Ig:4mL溶于Tris-鹽酸緩沖液(0.05mol/L，pH 8.0)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶(1.9\1041]/^)，于40 °C酶解4 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 0C ,12000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液。
[0023]4)灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的