制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分(MP60-1)，得到超濾酶解液，將超濾酶解液依次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0024]①離子交換樹脂層析:將MP60-1溶于雙蒸水配成濃度為50mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥自由基清除能力，選擇抗氧化能力最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物MP60-3(圖1);
②凝膠柱層析:將MP60-3溶于雙蒸水配成濃度為50mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥自由基清除能力，選擇抗氧化能力最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物MP60-3-1 (圖2);
③RP-HPLC純化:將MP60-3-1用雙蒸水配成80?100yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化(RP-HPLC條件為:進樣量 15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.8 mL/min;紫外檢測波長280 nm)，根據對DPPH自由基和羥自由基的清除活性得I個高活性抗氧化肽DCPE-B(圖3)。
[0025]④結構檢測:收集DPPH自由基和羥自由基清除活性最高的抗氧化肽DCPE-B，經RP-HPLC檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)，ES1-MS測定分子量為905.00 Da([M+H]+ 906.68 Da)(圖4)。
[0026]將制得的灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met(GEREANVM)進行自由基清除實驗和脂質過氧化抑制實驗，實驗結果表明:Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVMW^PPH 自由基(EC50 2.76 mg/mL)、羥基自由基(EC50
0.22 mg/mL)、ABTS自由基(EC50 0.08 mg/mL)和超氧陰離子自由基(ECso 0.13 mg/mL)有良好的清除作用；同時，GI y-G I u-Ar g-G I u-A I a-Asn-Va 1-Me t (GEREANVM)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用(圖5)。
[0027]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)灰星鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取灰星鯊軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的灰星鯊軟骨浸于4?6倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，于4 °C下攬摔抽提36?48 h;提取液在4 °C下以4000?6000 r/min離心15?25min，棄殘渣收集上清液;上清液繼續在4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，取上清液用0.22 Mi微孔濾膜過濾除去不溶性雜質;將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用pH值為7.6的Tris-HCl緩沖液于4 °C下透析24?48 h，透析袋內溶液即為灰星鯊軟骨總蛋白粗提物； 2)灰星鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取灰星鯊軟骨總蛋白粗提物在冰浴下緩慢加入預冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速離心20 min，取上清液，加入預冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得灰星鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，即為60%丙酮分級沉淀蛋白； 3)灰星鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取灰星鯊軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9X104 U/g)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90 °C、10min滅酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液； 4)灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得抗氧化肽； 其中，所述步驟I)中的鹽酸胍溶液含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH值為7?8 ；所述步驟3)中的Tris-HCl緩沖液為0.05mol/L，pH值為7.5?8.5;胰蛋白酶為1.9 X 14 U/g O2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)中的灰星鯊為灰星鯊即Mustelus griseus 03.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: 離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物； 凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物； 反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜純化進行純化，根據對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性得I個高活性抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met，ES1-MS測定分子量為905.00 Da。4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述反相高效液相色譜條件為:進樣量10?15 yL;色譜柱是規格為250 mmX4.6 mm,5 μπι的Zorbax SB- C18;流動相為水-乙腈梯度洗脫，O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%;洗脫速度0.6-1.0 mL/min;紫外檢測波長280nmD5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所制備的抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met為八肽化合物，ES1-MS測定分子量為905.00 Da。
【專利摘要】本發明公開了一種灰星鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，本發明以灰星鯊軟骨為原料，通過總蛋白提取、丙酮分級沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met，ESI-MS測定分子量為905.00？Da；制備的高活性抗氧化肽具有較強的自由基清除活性和良好的脂質過氧化抑制作用，可以作為藥品、保健食品或食品添加劑等進行開發。
【IPC分類】C07K1/20, C07K7/06, C07K1/18, C07K1/30, C12P21/06, C07K1/36, C07K1/34, A61P39/06, C07K1/16
【公開號】CN105648007
【申請號】
【發明人】王斌, 王曉麗, 趙玉勤, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月31日