一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，屬于水產品加工與利用領域。
【背景技術】
[0002]蛋白質酶解的后的產物小肽不但容易消化、吸收，而且還具有抗高血壓、抗膽固醇、抗血栓形成、改善脂質代謝、增強人體體能、幫助恢復疲勞、促進鈣磷和其它微量元素的吸收、促進大腦發育、提高記憶力、增強巨噬細胞和B細胞活力、增強免疫功能、保護表皮細胞、防止黑色素沉淀、消除體內自由基等功效。
[0003]關于水產蛋白活性肽的制備，國內進行了大量的研究。目前，水產蛋白活性肽的制備方法主要有自溶酶解、酶解法、液態發酵法和固態發酵與液態酶解相結合的方法這四種。專利申請200810195646.4“內源酶制備生物活性小肽的工藝”公開了一種利用海洋低值魚體內的內源酶自溶酶解的方法制備水產蛋白生物活性小肽的方法。專利申請201410145196.3“一種制備扇貝裙邊活性肽的方法”公開了一種酶解法制備水產蛋白活性肽的方法。專利申請CN102028091A “一種納豆菌發酵法制備低分子魚肽的方法”公開了一種液體發酵法制備魚蛋白肽的方法，專利申請201210539941.3“一種由魚蛋白肽和與大豆肽組成的蛋白肽的生產方法”公開了一種由固態發酵與液態酶解相結合制備水產蛋白活性肽的方法。
[0004]現有的水產蛋白活性肽制備技術中存在以下缺陷。首先，現有的水產蛋白活性肽制備技術中都有高溫處理的過程。以上制備技術中都有高溫滅酶這一工序;微生物發酵的方法原料需要滅菌。以上這些高溫處理，會在一定程度減弱制備的功能肽或水產蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學活性;另外高溫處理過程，會增強美拉德，使得酶解液顏色變深，為成品加工過程增加了負擔。其次，外加酶酶解的方法需要外加蛋白酶，增加了成本；自溶酶解由于內源酶的不足，導致酶解不徹底。另外，微生物發酵法雖然不用外加蛋白酶，但是原料需要滅菌導致內源酶失活，不能充分地有效利用內源酶。
【發明內容】
[0005]針對現有的水產蛋白活性肽制備技術存在的問題。本發明的主要目的是提供一種低溫的制備水產蛋白活性肽的方法，以便更好地保留制備的功能肽和水產蛋白本身所含功能性成分的生物學活性。本發明的另一目的是提供一種發酵法制備活性肽的方法，使得微生物發酵與內源酶酶解過程能有機結合在一起。本發明還有一目的是簡化活性肽的制備工序，降低其生產成本。
[0006]為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，包括如下步驟:
(I)將斜面保藏的能產耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養基中，于55 °C、150r/min培養12h，制備成地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)HL-3種子液備用；
(2)將新鮮的水產蛋白絞碎后備用，將植物蛋白粉碎后過60目篩備用；
(3)將步驟(2)制得的絞碎水產蛋白和粉碎后的植物蛋白按質量比為0.5?1.5:1的比例混合，并加營養物和水混勻，獲得最終水分含量控制在40%?80%范圍內的發酵培養基；
(4)往步驟然(3)制得的發酵培養基上接入步驟(I)所制備的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HL_3 種子液，并混勾；
(5)固態發酵:將步驟(4)獲得的加入菌的發酵培養基按照下列方法進行發酵:發酵培養基分裝在已消毒的發酵淺盤中，裝料厚度為4cm?8cm，淺盤中發酵培養基表面覆蓋已滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發酵房內的擱架上發酵，控制環境溫度在55°060°C，發酵時間為38h?48h;
(6)液態酶解:將步驟(5)得到固態發酵產物與水按質量比為1:3的比例混合，并攪拌均勻后加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h;
(7)成品的加工:將步驟(6)得到的液態酶解產物通過過濾去除沉淀得到酶解液;酶解液通過截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質而得到透過液;透過液然后通過截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經過冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0007]所述步驟(I)中所用的能產耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3已于2016年I月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60003，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所。
[0008]所述步驟(2)中的水產蛋白為羅非魚下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚下腳料、魷魚下腳料、牡蠣、青鱗魚下腳料、青魚下腳料、鰱魚下腳料、草魚下腳料和鰹魚下腳料中的一種。所述步驟(2)中的植物蛋白為豆柏、花生柏、棉籽柏和菜柏中的一種或其中兩種以上的混合物。
[0009]所述步驟(3)中的營養物為玉米粉、食品級氯化鈣、食品級氯化亞鐵和食品級磷酸氫二鉀組成的混合物。所述步驟(3 )中的營養物的加入量以添加的營養物的質量占發酵培養基總質量百分比計，分別為:玉米粉0.0I %?5%，食品級氯化|丐0.01 %?5%，食品級氯化亞鐵0.01%?5%，食品級磷酸氫二鉀0.01%?5%。
[0010]所述步驟(4)中地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液的接種量以接入種子液的質量占發酵培養基總質量百分比計，為I %?15%。
[0011 ]與現有技術相比，本發明具有以下優點。
[0012](I)整個制備過程沒有高溫處理，更好地保留了制備的功能肽和水產蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學活性。本發明申請采用耐高溫地衣芽孢桿菌發酵，在高溫條件下可以抑制致病菌和腐敗菌的生長，因此本技術中培養基無需滅菌。另外，本技術采用超濾膜去除酶解液中的蛋白酶，無需高溫滅酶。
[0013](2)簡化了工序，降低了成本。由于本發明申請沒有高溫滅酶的過程，這不但降低了能耗，而且還會大大降低酶解液的美拉德反應，所以酶解液的顏色比較淺。而后續的膜分離又有一定的脫色效果，因此本技術中可以無需脫色這個程序，簡化了工序，降低了成本。
[0014](3)內源酶酶解與微生物發酵的完美結合。現有的發酵技術中，原料都需滅菌，這不但增加了能耗，而且又使得水產蛋白的內源酶失活。本技術中原料無需滅菌，保留了水產蛋白中內源酶的活性。并且，微生物發酵的溫度與內源酶的最適酶解溫度一致，使得內源酶酶解與微生物發酵能完美結合在一起。正是由于本發明中充分利用內源酶的酶解作用，使得本發明無需另加蛋白酶。
[0015](4)制備成本不但要低于現有固態發酵聯合液態酶解技術，而且發酵效果也要優于現有的固態發酵聯合液態酶解技術。與現有的采用發酵法制備活性肽的技術相比，本發明申請原料無需滅絕，可降低能耗和成本；由于本發明申請提供的技術方案無需高溫滅絕，保留了水產蛋白內源蛋白酶的酶活，這是現有的采用常溫發酵菌種制備活性肽無法做到的，在水產蛋白內源蛋白酶的協助下，本發明申請可以不用外加蛋白酶。在高溫下蛋白酶酶的活性更強，因此，本技術采用耐高溫菌種進行發酵，水產蛋白的水解度要高于現有的常溫菌種發酵技術。
[0016]本發明提供了一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法。本發明技術作用條件溫和，更多地保留了制備的功能肽和水產蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學活性，并且簡化了制備工序和降低了活性肽的生產成本，有著良好的應用前景。
【具體實施方式】
[0017]為了更好地理解本發明，下面就水產蛋白的種類、植物蛋白的種類、發酵參數和發酵方式的選擇結合實施例對本發明作進一步描述，但本發明的保護范圍不限于此。
[0018]實施例1:將斜面保藏的能產耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養基中，于55°C、150r/min培養12h，制備成地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液備用。將新鮮的南極磷4下絞碎后備用；將豆柏粉碎后過60目篩備用。將100公斤絞碎的南極磷蝦和100公斤粉碎并過60目篩的豆柏混合，并加入5公斤玉米粉、500克食品級氯化鈣、500克食品級氯化亞鐵、650克食品級磷酸氫二鉀和10公斤水一起混