勻，獲得混勻后的發酵培養基;混勻后的發酵培養加入10公斤地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液，攪拌并混合均勾;接種后的發酵培養基分裝在已用75%的酒精表面消毒的發酵淺盤中，淺盤中裝料厚度為8厘米，淺盤中發酵培養基表面覆蓋滅菌處理的濕紗布，再將淺盤置于滅菌的固體發酵房內的擱架上發酵，控制環境溫度為55°C，發酵時間為45h;發酵結束后，將固態發酵產物與水按質量比為1:3的比例混合并攪拌均勻，加入到酶解罐中，控制酶解溫度為550C，酶解2h;將上面得到的液態酶解產物通過過濾去除沉淀得到酶解液，酶解液通過截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質而得到透過液;透過液然后通過截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經過冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0019]實施例2:將斜面保藏的能產耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(BaciI Iuslicheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養基中，于55°C、150r/min培養12h，制備成地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液備用。將新鮮的南美白對4下的4下頭絞碎后備用;將花生柏粉碎后過60目篩備用。將100公斤絞碎的蝦頭和100公斤粉碎并過60目篩的花生柏混合，并加入6公斤玉米粉、510克食品級氯化鈣、550克食品級氯化亞鐵、580克食品級磷酸氫二鉀和8公斤水一起混勻，獲得混勻后的發酵培養基;混勻后的發酵培養加入9公斤地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液，攪拌并混合均勾;接種后的發酵培養基分裝在已用75%的酒精表面消毒的發酵淺盤中，淺盤中裝料厚度為4厘米，淺盤中發酵培養基表面覆蓋滅菌處理的濕紗布，再將淺盤置于滅菌的固體發酵房內的擱架上發酵，控制環境溫度為60°C，發酵時間為48h;發酵結束后，將固態發酵產物與水按質量比為1:3的比例混合并攪拌均勻，加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h;將上面得到的液態酶解產物通過過濾去除沉淀得到酶解液，酶解液通過截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質而得到透過液;透過液然后通過截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經過冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0020]實施例3:將斜面保藏的能產耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養基中，于55°C、150r/min培養12h，制備成地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液備用。將新鮮的去殼后的牡■絞碎后備用;將豆柏粉碎后過60目篩備用。將100公斤絞碎的牡蠣和100公斤粉碎并過60目篩的豆柏混合，并加入4公斤玉米粉、560克食品級氯化鈣、550克食品級氯化亞鐵、650克食品級磷酸氫二鉀和8公斤水一起混勻，獲得混勻后的發酵培養基;混勻后的發酵培養加入9公斤地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液，攪拌并混合均勾;接種后的發酵培養基分裝在已用75%的酒精表面消毒的發酵淺盤中，淺盤中裝料厚度為6厘米，淺盤中發酵培養基表面覆蓋滅菌處理的濕紗布，再將淺盤置于滅菌的固體發酵房內的擱架上發酵，控制環境溫度為57°C，發酵時間為46h;發酵結束后，將固態發酵產物與水按質量比為1:3的比例混合并攪拌均勻，加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h;將上面得到的液態酶解產物通過過濾去除沉淀得到酶解液，酶解液通過截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質而得到透過液;透過液然后通過截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經過冷凍干燥而得到活性肽成品。
【主權項】
1.本發明公開了一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，其特征在于:該方法包括如下步驟: (1)將斜面保藏的能產耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(BaciIIuslicheniformis)HL_3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養基中，于55 °C、150r/min培養12h，制備成地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)HL-3種子液備用； (2)將新鮮的水產蛋白絞碎后備用，將植物蛋白粉碎后過60目篩備用； (3)將步驟(2)制得的絞碎水產蛋白和粉碎后的植物蛋白按質量比為0.5?1.5:1的比例混合，并加營養物和水混勻，獲得最終水分含量控制在40%?80%范圍內的發酵培養基； (4)往步驟然(3)制得的發酵培養基上接入步驟(I)所制備的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HL_3 種子液，并混勾； (5)固態發酵:將步驟(4)獲得的加入菌的發酵培養基按照下列方法進行發酵:發酵培養基分裝在已消毒的發酵淺盤中，裝料厚度為4cm?8cm，淺盤中發酵培養基表面覆蓋已滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發酵房內的擱架上發酵，控制環境溫度在55°060°C，發酵時間為38h?48h; (6)液態酶解:將步驟(5)得到固態發酵產物與水按質量比為1:3的比例混合，并攪拌均勻后加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h; (7)成品的加工:將步驟(6)得到的液態酶解產物通過過濾去除沉淀得到酶解液;酶解液通過截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質而得到透過液;透過液然后通過截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經過冷凍干燥而得到活性肽成品。2.根據權利要求1所述的一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(I)中所用的地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3在廣東省微生物菌種保藏中心的保藏編號為GDMCC No: 60003。3.根據權利要求1所述的一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的水產蛋白為羅非魚下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚下腳料、魷魚下腳料、牡蠣、青鱗魚下腳料、青魚下腳料、鰱魚下腳料、草魚下腳料和鰹魚下腳料中的一種。4.根據權利要求1所述的一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的植物蛋白為豆柏、花生柏、棉籽柏和菜柏中的一種或其中兩種以上的混合物。5.根據權利要求1所述的一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(3)中的營養物為玉米粉、食品級氯化鈣、食品級氯化亞鐵和食品級磷酸氫二鉀組成的混合物。6.根據權利要求1所述的一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(3)中的營養物的加入量以添加的營養物的質量占發酵培養基總質量百分比計，分別為:玉米粉0.01%?5%，食品級氯化鈣0.01%?5%，食品級氯化亞鐵0.01%?5%，食品級磷酸氫二鉀0.01%?5%。7.根據權利要求1所述的一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(4)中地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液的接種量以接入種子液的質量占發酵培養基總質量百分比計，為I %?15% ο
【專利摘要】本發明公開了一種固態發酵聯合液態酶解的制備水產蛋白活性肽的方法，包括以下主要步驟：將新鮮的水產蛋白絞碎后備用，將植物蛋白粉碎后過60目篩備用；絞碎后的水產蛋白和粉碎的植物飼料蛋白混合，并添加營養物和水混勻作為發酵培養基；往發酵培養基上接入能產耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌（<i>Bacillus？licheniformis</i>）HL-3；接入菌種的培養基于55℃～60℃進行固態好氧發酵38h～48h；然后固態發酵產物加水于55℃酶解2h；液態酶解產物先后經過濾、超濾和納濾后得到濃縮液，濃縮液經冷凍干燥后得到活性肽成品。本發明技術作用條件溫和，更多地保留了制備的功能肽和原料本身所含其它功能性成分的生物學活性，并且簡化了制備工序和降低了活性肽的生產成本，有著良好的應用前景。GDMCC No：6000320160118
【IPC分類】C12P21/00, C07K1/34, C12R1/10, C12P21/06
【公開號】CN105648012
【申請號】
【發明人】洪鵬志, 劉喚明, 周春霞, 楊萍
【申請人】廣東海洋大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月9日