一種利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明具體涉及一種利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，屬 于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 天然蝦青素(3,37 -二羥基-4,(-二酮基-β,Κ-胡蘿卜素)是類胡蘿卜素的最高級衍 生物，結構的特殊性決定了其抗氧化活性明顯高于其他類胡蘿卜素。蝦青素作為強抗氧化劑 在醫藥、化妝品和保健品等領域有很大的應用，也作為添加劑廣泛用于食品、水產等行業。
[0003] 天然蝦青素主要來源于發夫酵母、鮭魚、蝦殼及雨生紅球藻，其中雨生紅球藻在脅 迫條件下，比如高溫、強光照、氮饑餓等，能大量的積累蝦青素，其含量可達到藻細胞干重的 5-6%，被稱為天然蝦青素的濃縮品。外源誘導子促進雨生紅球藻積累蝦青素是提高蝦青素 產量的有效手段。丁基羥基茴香醚是一種常見脂溶性抗氧化劑，可作為一種外源誘導子對 雨生紅球藻進行脅迫培養，激發植物防御基因的表達，誘導植物的化學防御，與機械損傷和 昆蟲取食有相似的效果。因此丁基羥基茴香醚對雨生紅球藻積累蝦青素會有一定的促進作 用。
[0004] 目前國內已有多家公司可以大規模化生產蝦青素，也已有了一些相關的技術和專 利，比如"一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法"（CN104529852A)公開了一種高效提取蝦 青素的方法，主要利用冰醋酸冰浴、勻漿機勻漿和液氮低溫處理相結合的方法，大大提高了 細胞破壁率及蝦青素提取率。寧波大學的"大規模培養雨生紅球藻和轉化蝦青素的裝置及 其方法"（CN1966660)，公開了一種雨生紅球藻大規模培養及奸青素轉化的裝置，包括光生 物反應器、充氣裝置、培養液灌輸裝置和靜細胞收集裝置，通過浮沉控制裝置實現全天候高 密度養殖，并將藻的養殖和蝦青素積累結合在同一反應器中完成。天津大學的"用酵母發酵 殘液培養藻類生產蝦青素的方法"（CN1480524A)，公開了一種利用酵母發酵殘液生產蝦青 素的方法，是向酵母發酵殘液中加入無機鹽配成培養基，在特定的容器內培養雨生紅球藻 或綠球藻，經過分離提取蝦青素。上述相關專利技術雖然先進，但是工藝較為復雜，設備要 求高，操作較為繁瑣，這就增加了生產的成本和技術推廣的難度。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題克服現有的缺陷，提供一種利用丁基羥基茴香醚促進雨 生紅球藻生產蝦青素的方法，可以有效解決【背景技術】中的問題。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：
[0007] 本發明提供一種利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，包括以 下步驟：
[0008] 步驟1、藻液的制備:培養雨生紅球藻到對數生長期后期，用缺氮的BBM培養基稀釋 藻液并獲得誘導的藻液；
[0009] 步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素：用DMS0配成128g Γ1的丁基羥基茴香醚母液， 將丁基羥基茴香醚母液添加到已經稀釋好的誘導的藻液中使丁基羥基茴香醚濃度達到2-8mg Γ1;然后將上述藻液進行培養，待藻體細胞完全變紅后，收集藻細胞；
[0010]步驟3、利用有機溶劑提取藻細胞的蝦青素。
[0011] 2、根據權利要求1所述的利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方 法，其特征在于，所述雨生紅球藻為雨生紅球藻菌株。
[0012] 3、根據權利要求1所述的利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方 法，其特征在于，所述步驟1中藻液的制備具體為:在25°C、光強30001x，持續光照條件下培 養，培養雨生紅球藻到達對數生長期后期，此時細胞濃度達到l〇 6cells ml/1，利用缺氮的 BBM培養基稀釋到2X 105cells mL-1作為誘導藻液。
[0013] 4、根據權利要求1所述的利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方 法，其特征在于，所述步驟2中誘導雨生紅球藻積累蝦青素中的培養條件為：28°C、光強 ΙΟΟΟΟΙχ、冷光燈連續光照及氮饑餓的復合脅迫。
[0014] 5、根據權利要求1所述的利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方 法，其特征在于，所述步驟3中利用有機溶劑提取藻細胞的蝦青素具體為:取5ml上述藻液， 4000r/min離心5min，棄上清得藻細胞沉淀；分別向藻細胞沉淀中加入2mL 30 %甲醇和5 % Κ0Η混合液，60 °C水浴15min，4000r/min離心10min，除上清，沉淀加入純水洗滌2次，除堿液 殘留；然后加入5mL DMS0,200w超聲破壁15min，其中，超聲lmin，10s間歇，于45°C水浴 20min，抽提至藻體發白，離心收集上清測0D490;并按照公式= (4,SA XVa) /Vb計 算得出蝦青素的含量，其中C為蝦青素含量，A為490nm下0D值，Va為DMS0體積，Vb為藻液體 積。
[0015] 本發明所達到的有益效果是:一方面本發明操作簡單易行、成本低，原材料為自己 篩選的雨生紅球藻菌株可按常規方法培養，另一方面本發明大幅提高了蝦青素的產率，實 驗證明，添加2-8mg I/1的丁基羥基茴香醚的誘導組比對照組積累蝦青素的周期縮短了6-13%，蝦青素的產量比對照組提高了56.14-71.72%，達到19.99-21.654mg L一、
【具體實施方式】
[0016] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0017] 本發明提供一種利用丁基羥基茴香醚促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，包括以 下步驟：
[0018] 步驟1、藻液的制備:雨生紅球藻采用雨生紅球藻菌株，利用BBM培養基，在25°C、光 強30001x，持續光照條件下培養，培養雨生紅球藻到達對數生長期后期，此時藻細胞濃度達 到10 6cells ml/1，無菌條件下離心，利用缺氮的BBM培養基稀釋到2 X 105cells ml/1作為誘 導藻液；
[0019] 步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素：用DMS0配成128g Γ1的丁基羥基茴香醚母液， 將丁基羥基茴香醚母液添加到已經稀釋好的誘導藻液中使丁基羥基茴香醚濃度達到2_8mg Γ 1;然后將上述藻液在28°C、光強ΙΟΟΟΟΙχ、冷光燈連續光照及氮饑餓的復合脅迫下進行培 養，待藻體細胞完全變紅后，收集藻細胞；
[0020] 步驟3、利用有機溶劑提取藻細胞的蝦青素，蝦青素的提取方法：
[0021 ] 每隔一天取5ml上述藻液，4000r/min離心5min，棄上清得藻細胞沉淀;分別向藻細 胞沉淀中加入2mL 30 %甲醇和5 %KOH混合液，60°C水浴15min，4000r/min離心10min，除上 清，沉淀加入純水洗滌2次，除堿液殘留；然后加入5mL DMS0,200w超聲破壁15min(超聲 lmin，10s間歇），于45°C水浴20min，抽提至藻體發白，離心收集上清測0D490;并按照公式 (4、SAxVd /V'fc計