一種微藻混合培養制備油脂的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和生物能源領域，具體涉及一種能夠耐受高濃度C02并在堿 性環境下微藻混合培養制備油脂的方法。
【背景技術】
[0002] 由于化石能源的日趨減少和使用化石能源造成溫室效應的增加，越來越多的科研 工作者把目光集中到可再生能源的開發和利用上。生物質能作為地球上最重要的可再生能 源，它包括林業生物質、農作物、水生植物、農業廢棄物等。在諸多的生物質能源中，微藻是 重要的可再生資源。它們具有分布廣泛、生物量大、光合作用效率高、環境適應能力強、生長 周期短、生物量產量高等特點。其細胞中含獨特的初級或次級代謝產物，化學成分復雜。微 藻的太陽能轉化效率可達到3. 5%，是生產藥品、精細化工品和新型燃料的潛在資源，從微藻 中得到的脂肪酸可轉化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。
[0003] 隨著世界經濟的發展，大量的化石能源的使用和消耗，導致能源的短缺和環境的 日益惡化，特別是C02的急劇增加引起的溫室效應越來越嚴重，微藻的生長周期短、光合效 率高，C0 2固定效率高，一定條件下可達陸生植物的10倍以上，不僅可以減少C02排放，同時 也降低了培養成本；除〇) 2外，廢氣中的一些SOx、NOx等成分也隨著微藻的代謝被凈化處 理，有效減少有害氣體排放，因此利用微藻油脂作為原料生產的生物柴油是目前最有可能 滿足世界運輸所需燃料的可再生能源。
[0004] 目前對于小球藻、柵藻等產油微藻研究的較多。CN20110144545.6公開了一株 柵藻藻株，該藻株的生長可利用人工培養基或經適當處理的廢水生長，其特點是油脂產 率高于目前大多數分藻株，該藻株應用領域包括co2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質、 色素、淀粉、多糖、核酸的生產。CN20120154470.4公開了一株富油海洋微藻微擬球藻（ yVaiMocAJoro/wis )藻株及其應用，該藻株可在pH=4. 5的環境下正常生長，其油 脂含量可達35%。CN20111019480. X公開了一株微藻藻株耶.）及其用于生 產生物柴油的應用，利用該藻株可生產高附加值的多不飽和脂肪酸，包括亞麻酸C18:3和 神經酸C24:1，其在獲得生物柴油的同時，獲得高附加值的副產品。這些專利都未涉及藻種 對二氧化碳的耐受性。CN102703326A公開了一種高C0 2耐受性和固定率的微藻及其選育方 法，但該專利所提供的藻株并未涉及該藻株的油脂含量。上述專利要么不能高效利用〇) 2生 產油脂，要么獲得的生物質中油脂含量不夠高。特別是在實際應用中，當環境中C02體積分 數大于5v%時，大部分微藻的生長將受到抑制，固碳效率低；同時一般微藻在中性條件下適 宜生長，在偏酸性或者偏堿性的條件下不利于微藻的生長，而微藻利用〇) 2-般是以溶解在 水中的HC03離子形式存在的，二氧化碳在中性環境下溶解度低，不利于藻類吸收利用。
[0005] 劉平懷等(有機碳源對單針藻細胞生長、油脂積累和光合作用的影響，生物工程， 2012，33(18): 224-246)介紹了利用有機碳源培養單針藻的一種生產方式，培養結束雖然 生物量超過了 l〇g/L，但該種方式為單針藻異養培養方式，培養過程中利用葡萄糖等有機碳 源來實現細胞生長，這種培養方式沒有利用〇) 2等無機碳源經濟，而且有機碳源的加入，在 培養過程易產生染菌問題，影響藻細胞的生長。
【發明內容】
[0006] 針對現有藻種不能滿足耐受和吸收高濃度C02，固定C02效率低的問題，本發明提 供了一種能夠耐受高濃度C0 2并在堿性環境下微藻混合培養制備油脂的方法。本發明方法 提高了微藻培養體系對高濃度co2的耐受性和溶解性，提高了固碳效率，微藻油脂的收獲量 明顯提高，能夠進行生物柴油的生產。
[0007] 本發明微藻混合培養制備油脂的方法，包括如下內容：（1)將微藻培養基與斜生 柵藻FSH-Y2種子液加入到光生物反應器中，調節培養體系的pH值為10~12,通入氣體 中C0 2的含量控制在5v%以下，培養2~5天；（2)調節培養體系的pH值為8~10,接入 纖維藻SS-B7種子液進行混合培養，通入氣體中C0 2含量為5v%~45v%，；（3)培養至生長 穩定期結束，收獲微藻細胞；所述的斜生柵藻（FSH-Y2和纖維藻 耶.）SS-B7,分別于2012年9月11日和2013年4月15日保藏于"中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，保藏編號分別為CGMCC No. 6551和CGMCC No. 7478〇
[0008] 本發明所述FSH-Y2藻株在顯微鏡下藻細胞呈紡錘形，叢生，有細胞壁膜包裹，顏 色為深綠色；單個藻細胞直徑約為6~10 μ m。該藻株在高pH值下能夠更好的吸收利用二 氧化碳，快速生長繁殖。
[0009] 本發明所述纖維藻SS-B7藻株是一種淡水綠藻，在顯微鏡下藻細胞為綠色，鐮形 或弓形、叢生、彎曲，自中央向兩端漸尖細，末端尖，長大約5~6μπι，中央寬約2μπι。該藻 株能夠耐受高濃度的〇) 2和NOx，可以利用含C0 2和NOx的廢氣或煙氣進行光照自養生長獲 取富含油脂的生物質，固碳效率高。
[0010] 本發明中，微藻培養基采用本領域人員熟知的BG11、SE、BBM等培養微藻的液體培 養基。斜生柵藻FSH-Y2種子液的制備如下：將培養基的pH調節為10~12,在溫度為20~ 30°C，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,光照強度為2000~lOOOOLux，振蕩培養至對數 生長期。光生物反應器中加入的斜生柵藻FSH-Y2種子液與培養基的體積比1:10~1:5,通 入氣體為二氧化碳和氮氣，其中C0 2的含量控制在3v%~5v%。
[0011] 本發明中，纖維藻SS-B7種子液的制備如下：將培養基的pH調節為7~9,在溫度 為20~30°C，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,光照強度為2000~lOOOOLux，振蕩培 養至對數生長期；纖維藻SS-B7種子液與培養基的體積比為1:20~1:10。混合培養的培養 溫度為20~30°C，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,光照強度為2000~lOOOOLux。通 入氣體優選使用含C0 2的廢氣或煙氣，其中C0 2含量為10v%~45v%，NOx含量為100 X 10 6~ 500X 10 6 (v/v)。混合培養至生長穩定期結束，通過離心、沉降等方式收獲微藻細胞，測定 細胞干重和油脂含量，細胞干重可達到12g/L以上，油脂含量可達到細胞干重的45%以上。
[0012] 與現有技術相比，本發明可以帶來以下有益效果： 1、本發明采用兩步法接入不同的微藻種子液進行混合培養，反應初期接入耐受高pH 的斜生柵藻FSH-Y2藻株在堿性條件下生長，可以抑制微藻培養初期雜菌和病蟲害的生長， 使微藻處于生長優勢；同時高pH培養有利于通入高濃度二氧化碳的溶解，使二氧化碳更容 易被微藻吸收利用，有助于提高二氧化碳的固定效率； 2、 在利用二氧化碳和光照獲得生物質的培養過程中，微藻混合培養并非是微藻單獨培 養的簡單組合，這兩種藻種互相配合，比單一藻種具有更高的的固碳效率和獲取更多的生 物質和油脂含量； 3、 本發明的混合培養體系能夠耐受高濃度的0)2和NOx，可以利用廢氣中的C0 2進行自 養生長，固定C02，緩解目前工業社會帶來的溫室效應和廢氣污染問題。
【具體實施方式】
[0013] 下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明。本發明中，wt%為質量分數，V%為體 積分數。
[0014] 實施例1微藻種子液的制備 微藻培養米用BG11培養基，培養基配方如表1和表2所不。
[0015] 表1 BG11培養基
*表2表1中A5+Co solution的組成
首先按照表1和表2制備BG11液體培養基，將培養斜生柵藻FSH-Y2的培養基的pH調 節為10,將培養纖維藻SS-B7的培養基的pH調節為7. 5,然后將斜生柵藻FSH-Y2和纖維藻 SS-B7分別接種于上述培養基中。在恒溫光照搖床中培養，培養溫度為25°C，光照周期為 24h，光暗時間比為14:10,光照強度為5000Lu X，120rpm振蕩培養至對數生長期，獲得斜生 柵藻FSH-Y2種子液和纖維藻SS-B7種子液，將上述種子液在15°C弱光下保存備用。
[0016] 實施例2微藻油脂的制備 (1)在光生物反應器中，加入實施例1制備的FSH-Y2種子液和微藻培養基，FSH-Y2種 子液與培養基的體積比為1:5,培養基采用BG11培養基，培養基的pH值控制為10,培養的 光照強度為5000LUX，光照周期為24h，光暗時間比為14:10,通入氮氣和二氧化碳的混合氣 體，其中二氧化碳含量為5v%。
[0017] (2)培養2天后，接入實施例1制備的纖維藻SS-B7種子液，