一種對蝦用復方中草藥免疫增強劑的快速篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種復方中草藥免疫增強劑的快速篩選方法，具體涉及一種利用對蝦血細胞原代培養進行中草藥免疫增強劑組合的快速篩選方法，屬于水產養殖和生物篩選技術領域。
【背景技術】
[0002]近年來由于種質資源退化和養殖環境惡化，對蝦病害爆發頻繁，嚴重制約著對蝦養殖業的發展。預防和治理病害的傳統方法是使用抗生素，然而抗生素的廣泛使用會導致藥物殘留、菌株耐藥性的產生以及環境污染等問題，最終危及人類自身的健康。因此許多學者研究抗生素的替代物。中草藥作為綠色天然藥物，具有毒副作用小、多功效、不易誘發病原菌耐藥性、低污染、價格低廉、資源豐富等優勢，在水產無公害養殖病害防治中具有廣闊的應用前景。
[0003]目前有關中草藥免疫增強劑在生產上往往多種中草藥配伍使用。而復合中草藥的使用存在添加量大、有效成分含量使用不明、作用機理不清的問題。此外，復合中草藥的篩選傳統方法是采用養殖實驗，實驗周期長，易受外界因素影響，無法在短時間內篩選出合適的復方中草藥免疫增強劑。并且傳統重復篩選方法耗費大量的時間、人力、物力以及財力。
【發明內容】
[0004]鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種對蝦用復方中草藥免疫增強劑的快速篩選方法。該方法能夠快速和高效的篩選不同組合的中草藥免疫增強劑，以克服現有技術的不足。
[0005]為達到上述目的，本發明采取的具體技術方案如下:
一種對蝦用復方中草藥免疫增強劑的快速篩選方法，其特征在于，該方法包括首先制備對蝦肌肉提取液和血細胞培養基，然后分離對蝦血細胞并進行原代培養，同時提取中草藥活性成分，再將中草藥活性成分添加到對蝦血細胞培養基中對血細胞進一步培養，最后測定免疫相關指標。
[0006]所述對蝦肌肉提取液的制備方法為:幼蝦經暫養后，取腹部肌肉加入平衡鹽進行勻漿，勻漿后再加入平衡鹽溶液進行離心，取上清再次離心，上清液經微孔濾膜過濾后即為制備好的對蝦肌肉提取液。
[0007]所述對蝦血細胞培養基組成為:基礎培養基為2XLeibovitz’s L_15，添加質量分數為20%的胎牛血清和20%的所述對蝦肌肉提取液，以及添加青霉素鈉使其在培養基體系終濃度為100IU.mL—1、添加硫酸鏈霉素鈉使其在培養基體系終濃度為10yg.mL—1和添加兩性霉素B使其在培養基體系終濃度為10yg.mL—1。
[0008]所述提取對蝦血細胞并進行原代培養的具體操作為:首先以海水洗凈對蝦體表，之后用含有青霉素和鏈霉素且經過高溫消毒的無菌海水暫養l-2d;對對蝦體表進行消毒，然后利用吸入抗凝劑的無菌注射器按照抗凝劑:血淋巴體積比為I: I于對蝦頭胸甲后緣處心臟取血，得到抗凝血樣品后進行離心，棄上清得到對蝦血細胞，用上述制得的培養基調節血細胞密度并進行接種。
[0009]所述中草藥選取為黃芪、杜仲、黃連和大黃。
[0010]所述中草藥活性成分提取操作為:將中草藥均勻粉碎后，與無水乙醇按照質量體積比為1:10的比例混勻，70°C回流萃取1.5h，重復萃取兩次，合并濾液，旋轉蒸發除去乙醇即得中草藥活性成分。
[0011 ]所述的免疫相關指標為血細胞存活率、血細胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。
[0012]所述中草藥活性成分添加到對蝦血細胞培養基中的添加量為:每毫升培養基中添加黃苗多糖5_30mg、綠原酸3-30mg、小檗堿5-30mg、大黃蒽醌提取物5-30mg。
[0013]所述平衡鹽組成為:NaCl18.0 g.L—1JCl 0.7 g.L—1、NaHC03 0.5 g.L—\KH2PO4 0.54 g.L—1，調節pH為7.2。
[0014]所述的抗凝劑組成為:NaCl26.325g.L-1、KCl 0.745g.L—1、EDTA_2Na3.7224g.L—\HEPES 2.383，調節pH為 7.0，滲透壓為750m0sm kg—1。
[0015]本發明的優點和有益效果:本發明利用對蝦血細胞原代培養，在培養基中添加多種組合的中草藥提取物，培養24h即可以通過測定免疫相關指標，快速篩選出增強免疫效果較好的組合。本方法具有快速，高效，準確，穩定等優點，并且采用血細胞原代培養，相較于傳統的養殖模式，檢測成本更低。本發明能夠快速、精確的篩選出具有免疫增強作用較好的中草藥組合。
【附圖說明】
[0016]圖1實施例中對照組和試驗組關于血細胞存活率的結果圖。
[0017]圖2實施例中對照組和試驗組關于血細胞吞噬活性的結果圖。
[0018]圖3實施例中對照組和試驗組關于抗菌活性的結果圖。
[0019]圖4實施例中對照組和試驗組關于溶菌活性的結果圖。
【具體實施方式】
[0020]以下是本發明涉及的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步說明。但是本發明的保護范圍并不限于該實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。
[0021 ] 實施例:
本實施例選用凡納濱對蝦作為試驗對象，凡納濱對蝦是目前國內對蝦養殖的主要品種。并選取了黃芪、黃連、杜仲和大黃四種中草藥進行組合，作為快速篩選的免疫增強劑。
[0022]實驗所用凡納濱對蝦購自青島市嶗山對蝦養殖場，蝦生物體長為8.0± 0.5cm，體色正常，健康活潑。暫養于40cmX50 cmX60 cm水槽中7天，海水鹽度為32，溫度為19±0.5°C，pH為8.1，連續充氣，日換水兩次，每次換水量為1/3-1/2，并投喂對蝦配合飼料。
[0023]—種對蝦用中草藥免疫增強劑的快速篩選方法，包括以下步驟:
(I)制備對蝦肌肉提取液
幼蝦經暫養后，取腹部肌肉5g，加入5mL平衡鹽，1500r勻漿2min。再加入15mL平衡鹽溶液，1000g離心30min。取上清，16000g離心30min，上清液經0.22μηι微孔濾膜過濾，-20°c保存。
[0024](2)制備血細胞培養基
基礎培養基為2 X Leibovitz’s L_15，添加質量分數為20%的胎牛血清和20%的凡納濱對蝦肌肉提取液，以及添加青霉素鈉使其在培養基體系終濃度為100IU.mL—1、添加硫酸鏈霉素鈉使其在培養基體系終濃度為10yg.mL—1和添加兩性霉素B使其在培養基體系終濃度為10yg.mL—S并用質量分數為2.5%的HCl和7.5%的NaHCO3調節pH到7.0。
[0025](3)凡納濱對蝦血細胞分離及其原代培養
選取活力好的凡納濱對蝦，以潔凈海水洗凈對蝦體表，用含有1000 yg.mL—1青霉素、1000 yg.mL—1鏈霉素且經過高溫消毒的無菌海水暫養l-2d。取20尾凡納濱對蝦，實驗前先用75%的酒精棉球消毒對蝦體表，然后在超凈工作臺內用預先吸入已消毒的預冷抗凝劑的無菌注射器，按抗凝劑:血淋巴為1:1的體積比于頭胸甲后緣處心臟取血，混合于離心管中，取抗凝血樣品，4°C、300g離心1min，棄上清，用培養基調節血細胞密度106cel 1/mL，并接種于5mL圓底離心管，每管200yL。
[0026](4)中草藥活性成分的提取
將黃芪、黃連、杜仲和大黃四種中草藥分別均勻粉碎后，與無水乙醇按照I: 10的質量體積比例混勻，70°C回流萃取1.5h，重復萃取兩次，合并濾液，旋轉蒸發除去乙醇制備成有效成分提取物。采用該方法黃芪制得的主要提取物為黃芪多糖，杜仲為綠原酸，黃連為小檗堿，大黃為大