一次性鑒別綿羊、山羊、水貂、海貍鼠和鴨肉的方法
【技術領域】
[0001]本項發明技術將分子生物學技術應用于食品檢測領域，利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列設計種屬特異性引物，通過多重PCR反應和核酸電泳技術檢測綿羊、山羊、水貂、海貍鼠和家鴨的肉樣品。
【背景技術】
[0002]線粒體DNA(Mitochondrial DNA)是動物體內唯一存在的核外遺傳信息載體，為雙鏈的閉合環狀分子，為嚴格的母系遺傳，在高等動物中結構基本一致，大小為16 kb左右，有37個基因(細胞色素C氧化酶的三個亞基CO 1、⑶I1、C0 III的基因，細胞色素b的基因，兩個編碼ATP合成酶亞基ATPase6和ATPase8的基因，NADH脫氫酶的7個亞基的基因以及2個rRNA基因和22個tRNA基因)，另外還有一段和復制轉錄有關的控制區D-loop。
[0003]線粒體DNA進化速度較快，具有很強的種屬特異性，并且具有分子量小、結構簡單穩定、不與組蛋白結合、存在廣泛、拷貝數極多、易于操作和分析等優點。線粒體DNA最早用于動物檢材的種屬鑒定是在法醫和考古領域，近年來也被試圖用于動物源食品、飼料檢測，特別是當檢材為熟制品或成分復雜的混合物時，蛋白質分析技術和免疫方法顯得無能為力，線粒體DNA的PCR檢測則顯示出優越性，即使經過高壓、蒸煮等處理也會有少量線粒體DNA完整保存下來，經PCR反應擴增百萬倍后可經電泳顯帶，或用更靈敏的實時熒光PCR檢測出來。
[0004]目前用于種屬鑒定的分子生物學方法主要有:隨機擴增多態性DNA分析(RAPD)、限制性片段長度多態性分析(RFLP)、擴增片段長度多態性分析(AFLP)、種屬特異PCR技術等。
[0005]PCR-RFLP技術結果準確，操作簡單，同時對試驗設備要求較低，馮強等采用PCR-RFLP技術對Cyt B基因在人及動物間差異進行了研究，結果表明，在15種常見動物中，狗線粒體DNA有微弱的非特異性擴增產物；對雞、蛙、鴨、魚、馬線粒體DNA無擴增產物。根據擴增產物的有或無，可初步區分人與狗、雞、蛙、鴨、魚、馬。擴增產物經Alu I酶切后，除鱔魚及人的擴增產物不被酶切外，牛、豬、羊、貓、猴、兔、豚鼠和鼠均有不同變化。Zehner等采用相同的引物擴增不同動物線粒體DNA后，聯合應用內切酶Alu I和Nco I酶切擴增產物，人類cyt b基因的981bp片段被Alu I酶切，產生978bp和3bp片段，除雞和火雞外，其他動物cyt b基因酶切片段與人類cyt b基因酶切片段明顯不同。NcoI可以酶切雞和火雞cyt b基因而不酶切人類cyt b基因。
[0006]種屬特異PCR是根據擴增的目的基因設計高特異性引物，包括單一或多種屬特異性引物，相應的擴增產物就有單一和多種種屬目的片段。常規PCR技術一次只能擴增一個目的片段。在肉制品檢測中，混合肉的成分比較復雜，必須對成分的不同動物源性同時進行檢測。若是用單一 PCR分開檢測這幾個項目，就存在操作繁瑣，耗時費事和試劑消耗大等缺點。Matsunaga等建立多重PCR技術，通過7種按適當比例混合的引物，用一次PCR同時對食品中的6種肉——牛肉、豬肉、雞肉、山羊、綿羊和馬肉中限制性DNA片段進行檢測，其中7種引物包括一條用線粒體色素細胞b基因設計的正鏈弓I物和6條各物種的特異性的DNA引物，反應采用35個循環進行PCR擴增，從山羊、雞、牛、綿羊、豬和馬肉的擴增產物中分離出長度分別為157，227，274，331，398和439bp的DNA片段，從而根據DNA片段的長度來鑒別混合肉制品的動物源性。張娟等克隆出了鴨線粒體DNA CO III基因(Genbank access1n:DQ655706)，利用BLAST軟件、B1edit軟件分析線粒體DNA序列，根據鴨線粒體DNA CO III基因的特異性，設計引物(5-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3, )、(5' -TACCAACCCCCGAACTA GGC-3')，利用此引物 PCR擴增鴨DNA的特異性片段為226bp。王麗媛等根據線粒體細胞色素b基因設計一條共用的上游引物，根據種屬差異設計其下游引物，然后通過多種類引物的合理配比，可以同時對樣品中的多種動物源成分進行鑒定。
[0007]針對市場上用鴨肉、海貍鼠肉和水貂肉經過加工冒充羊肉的現象，需要一個統一的檢測方法，以鑒別綿羊肉、山羊肉、鴨肉、水貂肉和海貍鼠肉，以及混合或加工過的肉制品中的這五種肉的成分。曾經提出或使用過的方法，如紅外線光譜檢測、蛋白質指紋方法、免疫學方法、隨機擴增多態性DNA分析(RAPD)、限制性片段長度多態性分析(RFLP)和擴增片段長度多態性分析(AFLP)等均存在某些缺點，如檢測結果不穩定、難以區分混合肉樣、難以鑒別熟肉制品等。本發明利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列設計種屬特異性引物，通過PCR反應得到長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產物電泳檢測，能夠一次性、準確、穩定、簡單快捷的鑒別綿羊肉、山羊肉、鴨肉、水貂肉和海貍鼠肉，以及混合或加工過的肉制品中的這五種肉的成分。
【發明內容】
[0008]本發明既提供一種由10 種引物(S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R 的濃度為 1.47,1.47,0.88,0.88,0.88,0.88,1.18,1.18,0.59,0.59 μ mol/L μ mol/L)、PCR 反應液、DNA Marker、五種目的片段組成的試劑盒，也提供一種用這種試劑盒對待測樣品DNA進行擴增并電泳檢測的方法。
[0009]為了鑒別綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉，利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列針對每種動物分別設計各自的種屬特異性引物，分別以綿羊、山羊、鴨、水貂和海貍鼠5種動物的全基因組DNA為模板，通過PCR反應得到5種長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，5種長度不同的條帶可以在電泳圖中分辨出來(見附圖1)。
[0010]用于鑒別綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉所用的5種動物引物序列為:
綿羊:
S-F: 5’-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3’
S-R: 5’-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3’ 擴增片段大小為 265bp 山羊:
G-F: 5’-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3’
G-R: 5’-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3’ 擴增片段大小為 578bp 水貂:
M-F: 5’- CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3’ M-R: 5’- TGCAGTAGGGGAATGATAG-3’ 擴增片段大小為 230bp
海貍鼠:
N-F: 5’- CGGCTCTTACACCTTCATA-3’
N-R: 5’- TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA-3’ 擴增片段大小為 812bp 鴨:
D-F: 5’- GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT-3’
D-R: 5’- GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3’ 擴增片段大小為 348bp本發明所針對的綿羊屬于哺乳綱-偶蹄目-反芻動物亞目-牛科-羊屬，線粒體DNA序列來自于Genbank，序列號為NC_001941.1 ;山羊屬于哺乳綱-偶蹄目-反芻動物亞目-牛科-羊屬，線粒體DNA序列來自于Genbank，序列號為NC_005044.2 ;水貂屬于哺乳綱-食肉目-鼬科-鼬屬，線粒體DNA序列來自于Genbank，序列號為NC_020641.1 ;海貍鼠屬于哺乳綱_嚙齒目_彖豬型亞目_海涯鼠科_海涯鼠屬，線粒體DNA序列來自于Genbank,序列號為AF422919.1 ;家鴨屬于鳥綱_雁形目_鴨