科_河鴨屬_綠頭鴨，線粒體DNA序列來自于Genbank，序列號為NC_009684.1。所有引物均為自行設計。
[0011]5種動物肉樣單PCR反應共同的反應條件為:
預變性94°C 1min
循環 94°C 30s 59°C 30s
72 °C Imin共30個循環延伸 72°C 1min冷卻，電泳檢測。
[0012]將5種動物的肉樣的DNA與5對引物進行5 X 5交叉試驗，沒有非特異性擴增。將5對引物中的任何2對混合后進行PCR擴增，引物間沒有明顯的競爭或干擾。將5種肉樣的DNA中的任何2種混合后PCR擴增，模板間沒有明顯的相互干擾。將5種肉樣經100°C加熱1min或120°C高壓加熱20min后，PCR產物有所減少,但電泳條帶仍清晰可見。
[0013]為達到五重PCR反應的最佳擴增效果，將S-F、S-R、G_F、G_R、D_F、D_R、M_F、M-R、N-F、N-R共10種引物的原液(濃度各為10 μ mol/L)按照5:5:3:3:3:3:4:4:2:2的比例混合得到混合引物，即得到的混合引物中S-F、S-R、G-F、G-R、D_F、D-R、M_F、M-R、N_F、N-R的濃度分別為 1.47,1.47,0.88,0.88,0.88,0.88,1.18,1.18,0.59,0.59 μ mol/L。
[0014]五重PCR反應體系為:總體積20μ 1，Multiplex PCR MasterMix PCR反應液10 μ I (購自北京康為生物技術有限公司)，混合弓I物3.4 μ I，模板DNA 1.0 μ I，去離子水補
M 20 μ 1
[0015]為使電泳檢測更加方便，試劑盒中除了提供混合引物、PCR反應液外，還可以包括DNA Marker，可以直接由市售的現有產品充當，也可以用經過PCR擴增、電泳分離、膠回收純化得到的5種純化的目的片段的混合液作為一種Marker。
[0016]此方法通過實驗證實了正確可靠，是一種可以一次性、準確、穩定、簡單快捷的鑒別綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉，以及混合或加工過的肉制品中的這五種肉的成分的種屬特異性的多重PCR方法。
[0017]本發明的內容結合以下實施例作更進一步的說明，但本發明的內容不僅限于實施例中所涉及的內容。
[0018]本實施例中的試劑盒由10 種引物(S-F、S-R、G-F、G_R、D_F、D_R、M_F、M-R、N-F、N-R 的濃度分別為 1.47、1.47,0.88,0.88,0.88,0.88、1.18、1.18,0.59,0.59 μ mol/L)、PCR反應液、DNA Marker GM345 (購自生工生物工程(上海)有限公司)、5種純化的目的片段混合成的Marker組成。用量由待測樣品的量決定。待測樣品為經過冷凍的生肉，由綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉中的某幾種粉碎混合成。
[0019]實驗步驟:
1、DNA提取:按照常規的DNA提取方法或試劑盒進行DNA提取均可。為縮短檢測所耗時間，采用動物組織全基因組提取試劑盒提取(購自生工生物工程(上海)有限公司)。肉樣的選取要有代表性，先肉眼大致區分肌肉組織、脂肪組織以及不同色澤、紋理的肉樣，然后用干凈的鑷子或剪刀取6份肉樣，每份25mg左右，置于6個2ml離心管中。按照DNA提取試劑盒說明書進行操作。組織消化時間為1-3小時，消化時間越長，DNA提取效果越好，因此選擇消化3小時。純化的DNA經紫外分光光度儀測得0D2M/0D2S。均在1.8-2.0之間，濃度為20-50ng/ μ I，將6管DNA相互充分混合均勻。
[0020]2、PCR擴增:6管待測DNA每管做2個平行實驗,共12個管進行擴增,反應體系為:總體積20 μ I,Multiplex PCR MasterMix (含Taq DNA聚合酶、4種dNTP等,購自北京康為生物技術有限公司)10μ 1，混合引物(S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R 的濃度分別為 1.47,1.47,0.88,0.88,0.88,0.88,1.18,1.18,0.59,0.59 μ mol/L) 3.4 μ 1，待測模板DNA 1.0 μ 1，去離子水補至20 μ I。設空白對照一管，不加待測模板DNA，用水補齊體積。
[0021]反應條件為:
預變性940C 1min 循環 94°C 30s
59°C 30s
72 °C Imin共30個循環延伸 72 °C 1min冷卻
3、電泳檢測:產物用TBE做緩沖液的3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，取2-5 μ I上樣。與DNA Marker GM345及5種純化的目的片段的混合Marker對比，待測肉樣含有綿羊肉、鴨肉和海貍鼠肉，與事實相符，12個PCR結果完全一致，說明此方法正確可靠。
[0022]本方法用5對引物同時進行多重PCR反應，反應體系和條件一致，5對引物間以及和5種動物的模板DNA間沒有相互干擾，不影響結果，5種目的片段大小不同，在電泳圖上可以清晰分辨開，因此可一次性的鑒別出5種動物的肉樣，節省了時間、人力和試劑、耗材。
[0023]【附圖說明】:
附圖1五種肉類(綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉)PCR電泳圖。
【主權項】
1.用于鑒別綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉所用的5種動物引物序列為: 綿羊:S-F: 5’-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3’ S-R: 5’-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3’ 擴增片段大小為 265bp 山羊:G-F: 5’-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3’ G-R: 5’-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3’ 擴增片段大小為 578bp 水貂:M-F: 5’- CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3’ M-R: 5’- TGCAGTAGGGGAATGATAG-3’ 擴增片段大小為 230bp 海貍鼠:N-F: 5’- CGGCTCTTACACCTTCATA-3’ N-R: 5’- TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA-3’ 擴增片段大小為 812bp 鴨:D-F: 5’- GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT-3’ D-R: 5’- GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3’ 擴增片段大小為 348bp。2.5種動物肉樣單PCR反應共同的反應條件為: 預變性94°C 1min 循環 94°C 30s . 59°C 30s . 72 °C Imin共30個循環 延伸 72°C 1min冷卻，電泳檢測。3.五重PCR反應體系為:總體積20μ 1，Multiplex PCR MasterMix PCR反應液.10 μ l (購自北京康為生物技術有限公司)，混合弓I物3.4 μ l，模板DNA 1.0 μl，去離子水補M 20 μl
【專利摘要】針對市場上用水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉冒充羊肉的現象，本發明利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列設計5種動物(綿羊、山羊、水貂、海貍鼠和鴨)種屬特異性引物，通過PCR反應得到長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產物電泳檢測，能夠一次性、準確、穩定、簡單快捷的鑒別綿羊肉、山羊肉、水貂肉、海貍鼠肉和鴨肉，以及混合或加工過的肉制品中的這五種肉的成分。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105648046
【申請號】
【發明人】張英杰, 王思偉, 劉月琴
【申請人】河北農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月14日