DS，蛋白酶 K20mg/mL，徹底懸浮沉淀并 充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離心管數次；得到的混合液中，加入濃度為 lOmg/mLRNA酶的水溶液10 μ L，37°C下靜置10min ;得到的上清液中，加入等體積苯酚-氯 仿混合溶液，苯酚和氯仿體積比為1 : 1，充分混勻，混合液4°C，12000Xg離心5分鐘，上清 液移入干凈離心管內；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離心5分鐘，上清液移入干 凈離心管內；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鈉溶液，-20°C靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離心10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5mL 70 %乙醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離心5分鐘，棄上清液，此步驟重復一次；得到的沉淀物自然風 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-20°C保存。
[0015] (2)PCR 擴增。
[0016] 本實施例同時檢測RS12203592、RS12896399和RS1393350,每個SNP的檢測需要 一對上下游引物、兩條多態引物共4條PCR引物，共需要12條引物。每個SNP的檢測需要 做兩管PCR擴增，為防止出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功，加設一管陰性對照組， 共做17管PCR，所述陰性對照組基因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。
[0017] 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系： 2·5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5y 1引物組，熱啟動Taq酶0· 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0018] 將裝有反應溶液的Eppendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設置反應條件如下： 預變性95°0 31^11;熱循環941：3〇8,6〇1：3〇8,721：3〇8,35個循環；延伸721：31^11。反應 結束后，取出試管。
[0019] 由于7管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高 效性、特異性，要求12條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析 來設計PCR引物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各 基因 SNP多態性的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[0020] (3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下：3g瓊脂糖，加入100mL去離子水，微 波爐加熱lmin，冷卻到60°C時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產 物10 μ L與6 X TBE緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0021] 檢測得到3個基因分型分析結果如下
根據分析結果，該測試者的皮膚在日照下較易變黑，對紫外線較為敏感，但患皮膚癌可 能性較低。因此，該測試者可以進行戶外活動，但注意時間不應過長，且在日光強烈情況下， 應適當以防曬霜涂抹保護皮膚。
[0022] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 日照反應基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在于： 存放的試劑包括： (1) 針對3個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組： 針對SNP RS12203592的引物組在： 5, -GGTGGGTAAAAGAAGGC-3， 5' -CCACAGGGGAATTTA-3' 5' -GATTTTAAGTTGGGGA-3' 5, -TAAGAAGCACTGGCAT-3， 針對SNP RS12896399的引物組： 5' -GTCAGTATATTTTGGGG-3' 5, -GCTGTGACAAAGAGAA-3' 5' -GAATGAATTCAAATATTGC-3' 5' -ATCCAGTTAAGAGAAC-3' 針對SNP RS1393350的引物組： 5' -AGTCCCTTCTCTGCAACA-3' 5' -AAAAGACCACACAGATTTC-3' 5, -TACCTGGCCCCTCAG-3' 5, -TCAAGGAGCAAATAGCTC-3， (2) PCR擴增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據權利要求1所述的日照反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量均為 0· 5_1· 0 μ 1 〇3. 根據權利要求1所述的日照反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試劑 包括：10XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據權利要求3所述的日照反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包 含：100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據權利要求3所述的日照反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試 劑用量為：10 XPCR緩沖液2. 5 μ 1，dNTPs2 μ 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2 μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據權利要求1所述的日照反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電 泳分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、DNA無毒染料和DNA上樣緩沖 液。7. 根據權利要求6所述的日照反應基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒染料 優選Biotium Gelred無毒染料。8. 根據權利要求1所述的日照反應基因檢測試劑盒，其特征在于：根據所選基因分型 分析結果，來檢測判定受測者對日照的反應，包括對紫外線的敏感程度，皮膚變黑敏感程度 和患皮膚癌的風險。
【專利摘要】本發明提供了人體日照反應基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，試劑包括：（1）針對3個基因SNP多態位點的PCR反應引物組（2）PCR擴增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應可在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到其對日光照射的反應，皮膚癌風險評估，從而為受測者提供一個保護皮膚健康，降低皮膚癌風險和合理戶外活動的有效方案。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105648047
【申請號】
【發明人】李則軒, 別茜, 張靜靜, 張舒, 邱嘉銘, 朱軼凡
【申請人】武漢白原科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月17日