驗組三采用常規STR熒光檢測試劑盒進行PCR擴增，PCR擴增體系為
10μ I PCR擴增體系；實驗組四采用常規STR熒光檢測試劑盒進行PCR擴增，PCR擴增體系為5μ I PCR擴增體系；實驗組五采用本實施方式提供的添加了瓊脂糖的PCR擴增試劑盒進行PCR擴增，PCR擴增體系為5 μ I PCR擴增體系。
[0048]實驗組三的PCR擴增體系配制為:按常規STR熒光檢測試劑盒中10 μ I反應體系的配比，量取 4μ1 PCR mix, 0.4 μ I Hot Start Taq 酶，2 μ I 復合引物，3.6 μ I SdH2O 混合均勻。
[0049]實驗組四的PCR擴增體系配制為:將常規STR熒光檢測試劑盒中10 μ I反應體系減至5μ1，量取 2μ1 PCR mix, 0.2 μ I Hot Start Taq 酶，I μ I 復合引物，1.8 μ I SdH2O 混合均勻。
[0050]實驗組五的PCR擴增體系配制為:按本實施方式提供的添加了瓊脂糖的PCR擴增試劑盒中5 μ I反應體系的配比，量取2 μ I PCR mix, 0.2 μ I Hot Start Taq酶，I μ I復合引物，1.8μ I瓊脂糖流體混合均勻。所述PCR mix、Hot Start Taq酶、復合引物與STR熒光檢測試劑盒的PCR mix> Hot Start Taq酶、復合引物相同。
[0051]向實驗組三的PCR擴增體系中加入I μ I DNA模板進行PCR擴增反應，向實驗組四、實驗組五的PCR擴增體系中加入0.5 μ I DNA模板進行PCR擴增反應，所述實驗組三、實驗組四、實驗組五反應條件相同。
[0052]所述反應條件為:一步反應，95°C2min ；94°C 45s，60°C lmin, 72°C lmin，10 個循環;二步反應，90°C 45s, 58°C lmin,72°C lmin，20 個循環。
[0053]將實驗組三、實驗組四、實驗組五擴增所得PCR產物分別進行STR分型檢測，實驗組三所得STR圖譜見附圖3，實驗組四所得STR圖譜見附圖4，實驗組五所得STR圖譜見附圖5。
[0054]實施例三
[0055]將瓊脂糖應用于微量DNA的PCR擴增中，長期使用。
[0056]稱取0.3g瓊脂糖加入10g水中混合均勻加熱使其溶解，完全溶解后得瓊脂糖流體待用。
[0057]—種PCR擴增試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，所述試劑包括:瓊脂糖，PCR mix, Hot Start Taq 酶,復合引物。
[0058]所述瓊脂糖為0.3g瓊脂糖溶解于10g水中得到的瓊脂糖流體。
[0059]將上述PCR擴增試劑盒用于微量DNA的PCR擴增，采用3 μ I PCR擴增體系，并在本公司科研中心進行大量實驗以驗證瓊脂糖在3 μ I PCR擴增體系中作用效果的穩定性及瓊脂糖對PCR擴增的提升效果。
[0060]所述3 μ I PCR 擴增體系配制如下:1.2μ I PCR mix，0.12 μ I Hot Start Taq 酶，
0.6 μ I復合引物，1.08 μ I瓊脂糖流體。所述PCR mix、Hot Start Taq酶、復合引物與常規STR熒光檢測試劑盒的PCR mix.Hot Start Taq酶、復合引物相同。
[0061]PCR 擴增反應條件為:一步反應，95°C 2min ；94°C 45s, 60°C lmin，72°C lmin, 10 個循環；二步反應，90°C 45s, 58°C lmin,72°C lmin, 20 個循環。
[0062]在上述PCR擴增體系及PCR擴增反應條件下擴增所得產物的STR圖譜示例1、示例2分別見附圖6、附圖7。
[0063]由實施例一、實施例二、實施例三的實驗結果可見，對于從志愿者一使用過的牙刷上提取的口腔脫落細胞DNA在10 μ I PCR擴增體系下進行PCR擴增的結果，對比附圖1、附圖2可見，附圖1中22個位點并沒有完全獲得STR分型，而且峰值很低導致該STR圖譜可信度低；而附圖2中22個位點全部獲得分型，且峰值很高故該STR圖譜可信度達100%。實驗組一實驗組二的區別在于實驗組二的PCR擴增反應體系中添加了瓊脂糖，對比結果可見，實驗組二比實驗組一具有更高的PCR擴增反應體系敏感度，從而大幅提升PCR擴增反應的成功率，最終獲得了完整的STR分型結果，實驗效果明顯。
[0064]對于從志愿者二使用過的牙刷上提取的口腔脫落細胞DNA進行PCR擴增的結果，對比附圖3、附圖4可見，對于采用常規STR熒光檢測試劑盒的實驗組三、實驗組四，當PCR擴增體系降至5μ I后，STR圖譜峰值明顯降低，可見由于常規PCR擴增反應體系的敏感度較低使得5μ I PCR擴增體系下擴增的結果不能獲得完整的STR分型；對比附圖4、附圖5可見，當同為5μ I PCR擴增體系時，采用本實施方式提供的添加了瓊脂糖的PCR擴增試劑盒的實驗組五的STR圖譜相比于采用常規STR熒光檢測試劑盒的實驗組四的STR圖譜，峰值有明顯增高，STR分型測試結果良好，可見實驗組五的添加了瓊脂糖的PCR擴增反應體系具備更高的PCR反應敏感度，從而成功完成志愿者二使用過的牙刷上提取的口腔脫落細胞DNA的PCR的擴增，獲得完整的STR分型結果；對比附圖3、附圖5可見，雖實驗組五的5μ IPCR擴增體系僅為實驗組三的一半，但采用本實施方式提供的添加了瓊脂糖的PCR擴增試劑盒使實驗組五的STR圖譜具有更好的峰值，比常規10 μ I PCR擴增體系的實驗組四具有更好的擴增效果。
[0065]實驗組三、實驗組四、實驗組五的STR圖譜對比可見，采用本實施方式提供的添加了瓊脂糖的PCR擴增試劑盒不僅可以明顯提高PCR擴增反應的敏感度進而提高PCR擴增反應成功率，并且可以在保證實驗成功率的前提下降低PCR擴增體系，從而大程度降低實驗成本，實驗效果明顯。
[0066]對于進一步降低PCR擴增反應體系至3μ I的結果，如附圖6、附圖7所示。大量實驗證明，采用本實施方式提供的添加了瓊脂糖的PCR擴增試劑盒在3μ I PCR擴增體系下，仍然具有較高的PCR擴增反應敏感度并能夠獲得完整STR分型，且STR圖譜峰值較高。由于目前常規的PCR擴增反應只能采用10 μ I及10 μ I以上的PCR擴增體系，3 μ I的反應體系可大大降低實驗成本。
[0067]綜上所述，瓊脂糖在PCR擴增反應中具有提高PCR敏感度的效果，從而提高了 PCR成功率并能夠獲得完整的STR分型，同時大幅降低PCR擴增過程中試劑的使用量，降低實驗成本，經過大量的實驗證明瓊脂糖提高PCR擴增反應敏感度的效果明顯、穩定。
[0068]以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種瓊脂糖在PCR擴增中的應用，其特征在于:在配置PCR擴增體系過程中加入瓊脂糖。2.如權利要求1所述的瓊脂糖在PCR擴增中的應用，其特征在于:所述瓊脂糖溶解于一溶劑后配置為瓊脂糖流體使用。3.如權利要求2所述的瓊脂糖在PCR擴增中的應用，其特征在于:所述溶劑為水或緩沖液。4.如權利要求2所述的瓊脂糖在PCR擴增中的應用，其特征在于:所述瓊脂糖流體中，瓊脂糖的質量百分比為0.01%?0.5%。5.—種PCR擴增試劑盒，包括盒體及盒體中單獨存放的試劑，其特征在于:所述試劑包括瓊脂糖。6.如權利要求5所述的PCR擴增試劑盒，其特征在于:所述瓊脂糖為質量濃度為0.01%~ 0.5%的流體。7.如權利要求5所述的PCR擴增試劑盒，其特征在于:所述試劑還包括PCRmix、Taq酶、引物。8.—種PCR擴增方法，其特征在于:所述方法包括在配置PCR擴增體系過程中加入瓊脂糖的步驟。9.如權利要求8所述的PCR擴增方法，其特征在于:所述方法還包括瓊脂糖溶解于一溶劑后配置為瓊脂糖流體。10.如權利要求9所述的PCR擴增方法，其特征在于:所述溶劑為水或緩沖液。11.如權利要求9所述的PCR擴增方法，其特征在于:所述瓊脂糖流體中，瓊脂糖的質量百分比為0.01%?0.5%0
【專利摘要】本發明提供了瓊脂糖在PCR擴增中的應用，在配置PCR擴增體系過程中加入瓊脂糖。進一步的，本發明還提供了相應的PCR擴增試劑盒及PCR擴增方法，PCR擴增試劑盒包括盒體及盒體中單獨存放的試劑，所述試劑包括瓊脂糖。所述PCR擴增方法，包括在配置PCR擴增體系過程中加入瓊脂糖的步驟。本發明通過實驗證明了在配置PCR擴增體系過程中加入瓊脂糖，可以提高PCR擴增反應敏感度，使反應更加充分，提高微量DNA的PCR擴增效果，最終獲得完整STR分型結果。并且，由于PCR擴增反應敏感度的提高，PCR擴增過程中試劑的使用量可明顯降低，從而降低實驗成本。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105648049
【申請號】
【發明人】羅冰科, 佟浩
【申請人】武漢瑞博祥生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年12月3日