一種快速鑒定山羊絨周期發育的方法及其分子靶標和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子靶標技術領域，涉及一種快速鑒定山羊絨周期發育的方法及其分 子革巴標和應用.
【背景技術】
[0002] 內蒙古絨山羊和山羊絨在國際上占有重要地位，是寶貴的種質遺傳資源，是畜牧 業中最具國際競爭力的一項產業。內蒙古絨山羊以其山羊絨纖細、潔白、柔軟、光亮而享譽 世界。2008年絨山羊存欄1868萬只，生產羊絨7642噸，占全國山羊絨產量的48%、世界山 羊絨產量的30%，自治區羊絨企業年銷售收入160億元。絨山羊業已經成為內蒙古自治區 重要的民族和民生產業。在市場上，山羊絨的細度和長度決定了它的價值，細度小于14微 米，長度大于36毫米的羊絨是普通羊絨價格幾倍甚至是幾十倍。所以如何產出更細更長的 羊絨，一直是絨山羊遺傳育種研究的重要課題，具有巨大的科研價值和經濟價值。但內蒙古 絨山羊的山羊絨加工能力與原料供應不成比例，每年平均缺口 6000噸左右，如何提高山羊 絨產量和品質已成為確保中國山羊絨品牌的重大戰略問題和緊迫任務。
[0003] 毛囊是毛纖維的"發源地"，它的性狀和組織結構決定著毛的品質和產量。絨山羊 的皮膚中有兩種毛囊，一種是生長粗毛的初級毛囊（Primary follicles)，另一種是生長絨 的次級毛囊（secondary follicles)。毛囊的生長周期一般分為生長期（anagen)、退行期 (catagen)和休止期（telogen)三個階段。曲永年等研究表明遼寧山羊絨從6月開始生 長，至翌年3月份逐漸停止生長，絨全年生長期為9個月，7-11月份是遼寧山羊絨生長 旺盛期，9月份是遼寧山羊絨生長速度高峰月（曲永年，1995)。達文政等對阿白絨山羊生 長研究表明絨從8月份開始生長，絨全年生長期為7個月，到第2年2月結束生長，生長 最旺盛的時期是9-11月份（達文政，1992)。他兩人的研究說明遼寧絨山羊絨的生長期較 長，因此生長期長可能是遼寧絨山羊產絨量高的一大原因。為分析遼寧絨山羊較內蒙古絨 山羊絨長、產絨量高的可能原因，李長青等2005年對這兩個品種的絨周期進行了組織學研 究，發現遼寧絨山羊表皮生發層3月份開始活動，5月份便已形成毛乳頭，并開始生絨；內 蒙古絨山羊4月份才開始活動；遼寧和內蒙古絨山羊分別于7、8月份基本完成毛囊重建， 進入興盛期，11月份左右細胞開始死亡，12月份進入退行期，2-3月份進入休止期（李長 青，2005)。形態學的研究說明遼寧絨山羊表皮開始活動和毛囊重建均比內蒙古絨山羊提前 1個月，而絨停止生長的時間基本一致，出絨時間的差異是造成各品種產絨量差異的原因之 〇
[0004] 由以上論述可知，山羊的產絨能力直接與其皮膚中的次級毛囊有關，次級毛囊的 大小直接決定了絨的細度，次級毛囊的數量決定了絨的產量，次級毛囊的生長期長短影響 絨長和產絨量。因此山羊次級毛囊的周期發育對山羊絨產量和絨品質具有重要作用，研究 毛囊周期發育可能增加絨山羊產絨量并改良絨品質。另外，皮膚毛囊周期性發育變化不僅 對于生產有重要作用，同時也為皮膚毛囊疾病模型的研究提供了依據。
[0005] 目前皮膚和絨周期的研究，主要集中在人和小鼠上。山羊毛囊的研究較少，主要集 中在個別基因的鑒定上。隨著近年來一個新興的研究領域---microRNA(miRNAs)的開發， 使人們從功能的研究上發現了越來越多的作為分子靶標的miRNA，尤其在癌癥和疾病的研 究方面，因此miRNA的研究逐漸受到人們的重視。
[0006] 二十年前研究人員最初發現miRNA時，并沒有意識到它的重要性。然而，通過傳統 的克隆方法和生物信息學手段發現在線蟲、果蠅、哺乳動物中存在著數百個miRNA，這引起 了各領域科學家的重視。目前，在mirbase(http://microrna. sanger.ac.uk/)中，人類基 因組已經發現超過2000個成熟的miRNA，約占人類基因的1-4%，這使得其成為最大的一類 基因表達調控因子。越來越多的研究人員將注意力轉向miRNA的研究。MiRNA表達的時序 性和組織特異性提示人們miRNA的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了 復雜的基因調控，對組織的發育起重要作用。
[0007] 目前miRNA在人和小鼠等模式動物上的研究較多，家畜miRNA的研究還相對滯 后，主要集中在miRNA的鑒定，以擴大miRBase數據庫中現有miRNA的數量（Coutinho et al. 2007 ;Feng et al. 2008 ;Kim et al. 2008 ;Shao etal. 2008)，研究僅僅涉及少數動物種 類。隨著數據庫中miRNA序列的增加，已開始向不同生物學過程中miRNA功能研究的方向 發展（Clop et al.2006;Sweetmanet al.，2008)。目前，家畜miRNA的功能研究已經涉及多 種動物的肌肉、脂肪、奶、免疫、生殖、疾病等方面（Xi et al.2010;Poly et al.，2004;Kim et al. ,2008 ；ffenguang et al. , 2007)〇
[0008] 雖然miRNA對皮膚毛囊的作用目前研究較少。但越來越多的證據支持miRNA在皮 膚毛囊的發育具有不可忽視的作用。2006年Andl首次報道了 miRNA在皮膚中的研究，表 明Dicer蛋白是RNA干擾機制的關鍵組分，負責miRNA的產生，他們在表皮Dicer缺失小鼠 中觀察到毛囊外翻至表皮，同時發現，毛囊增殖過程中重要的信號分子Shh和Notchl在出 生后7d缺失，毛囊發育不良、再生障礙和錯位發育等，表皮過度增殖（Andl et al.，2006)。 毛囊發育的這些表型變化證實了 miRNA在維持動物皮毛的形態發生方面具有作用。同年， 美國哈佛醫學中心的研究人員通過制備E17. 5胎鼠表皮與毛囊的小RNA文庫，通過克隆測 序獲得了皮膚上100多個miRNA，發現91 %的皮膚小RNA和63 %的毛囊小RNA為miRNA。 這一研究發表在Nature genetic上（Yi et al·，2006)。2007年zhang等構建了皮膚毛囊 的表達譜芯片，比較了綿羊和山羊的miRNA，獲得了 159個miRNA，發現了 105個山羊和綿 羊共表達的miRNA.其中，let-7、miR-17、miR-30、miR-15和miR-8基因的家族高頻率表達 (Wenguang et al.，2007)。在小鼠和山羊皮膚中發現的大量miRNA，可能預示著miRNA在皮 膚毛囊中發揮重要的作用。
[0009] 2008年Nature上報導改變體內的miR-203的時空表達可以誘導皮膚的分層和分 化，miR-203控制表皮細胞的增殖和誘導細胞周期進而促進表皮分化（Yi et al.，2008)。 2010年英國和美國科學家在小鼠毛發周期不同階段使用基因芯片探索了 miRNA的表達， 比較了小鼠毛發的生長期、休止期和退行期miRNA的表達差異，發現在毛囊和皮膚其他 組織大量的miRNA顯著變化，其中miR-31在生長期和退行期以及休止期變化非常顯著 (Mardaryev et al.，2010)。這進一步說明miRNA在皮膚毛囊細胞發育和表皮分化以及絨 周期的發育中具有重要作用。
[0010] miRNA在分子調控和靶標作用的領域成為新的研究熱點，尤其在人類的疾病和發 育中作為分子靶標的報道已很多。目前還沒有miRNA在山羊絨周期發育的靶標的報道。
[0011] 參考文獻：
[0012] 1曲永年，王薇，高文波等.遼寧絨山羊生長規律研究[J].中國養羊，1995,4: 37-38
[0013] 2達文政，李穎康，趙輝等.阿爾巴斯白絨山羊引種觀測[J].寧夏農林科 技，1992，
[0014] 1:45-48
[0015] 3李長青，尹俊，張燕軍等。內蒙古絨山羊與遼寧絨山羊皮膚毛囊周期性變化的 比較研究[J]·畜牧獸醫學報，2005, 36 (7) :674-679
[0016] 4Coutinho LL，Matukumal 1 i LK，Sonstegard TS，et al. Discovery and profiling of bovine microRNAs from immune-related and embryonic tissues[J]. Physiol Genomics，2007, 29(1) :35-43
[0017] 5Feng Y，Huang TH，Fan B, Zhao SH. Mapping of six miRNAs expressed in porcine skeletal muscle[J].Anim Genet，2008,39(1):91-92
[0018] 6Kim JI，SCho,J S Hong，et al. Identification and characterization of new microRNAs from pig[J]. Mammalian Genome, 2008, 19(8):570-580.
[0019] 7Shao P，Zhou H，Xiao Z D，et al· Identification of novel chicken microRNAs And analysis of their genomic organization[J] · Gene，2008,418 :34-40
[0020] 8Clop A，Marcq F，Takeda H，et al. A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep [J]· Nat Genet，2006, 38(7) :813 - 818
[0021] 9Sweetman D,Goljanek K，Rathjen T，et al. Specific requirements of MRFs for the expression of muscle specific microRNAs, miR-1, miR-206and miR-133 [J]. Dev Biol. 2008,321(2):491-499
[0022] lOXiong