06，105，104，103等不同濃度標準品進行擴增獲得的擴增曲線。
[0026]圖2是本發明的實施例中的采用107、106，105，104，103等不同濃度標準品獲得的標準曲線。
[0027]圖3是本發明的實施例中的熒光定量PCR溶解曲線分析結果。
[0028]圖4是本發明的實施例中的不同煙葉炭疽病菌定量PCR檢測結果。
【具體實施方式】
[0029]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
實施例
[0030]一、感病煙株DNA的提取
1.將煙株葉部組織用剪刀剪至3mm以下角形狀，重量在10?100 mg范圍內，裝入1.5ml Microtube中，于_20°C凍結。
2.取出凍結的植物組織于室溫放置5分鐘左右，使其融解。
3.輕微離心，將植物組織收集在Microtube底部。
[0031]4.使用Pipet Tip尖端將植物組織按壓Microtube底部10次左右，進行物理破碎。
[0032]5.加入400 μ?的Extract1n Solut1n I，劇烈振蕩5秒鐘。如果植物組織仍滯留于Microtube底部，需用手指輕彈Microtube使其懸浮。
[0033]6.輕微離心，加入80 μ?的Extract1n Solut1n 2，劇烈振蕩5秒鐘。添加Extract1n Solut1n 2后產生白色沉淀，劇烈振蕩后溶液呈白池狀態。如果植物組織仍滯留于Microtube底部，需用手指輕彈Microtube使其懸浮。
[0034]7.輕微離心，加入150 μ?的Extract1n Solut1n 3，劇烈振蕩5秒鐘。如果植物組織仍滯留于Microtube底部，需用手指輕彈Microtube使其懸浮。
[0035]8.輕微離心2秒鐘以內，于50°C溫浴15分鐘。
[0036]9.12,000 rpm 4°C離心 15分鐘。
10.取上層水相移至新的1.5 ml Microtube中，上層水相約400 μ?。注意盡量不要混入水相以外的物質。
[0037]11.添加等量的異丙醇，輕柔混勻。
12.12,000 rpm 4°C離心 10分鐘。
[0038]13.棄上清，注意不要吸取沉淀。
14.加入I ml 70%乙醇，清洗沉淀。
[0039]15.12,000 rpm 4°C離心3分鐘。
[0040]16.棄上清，注意不要吸取沉淀。
17.沉淀干燥，加入適量TE Buffer(約20 μ?)溶解沉淀二、建立熒光定量PCR反應體系并進行感病煙株中煙草炭疽病菌數量檢測
1、標準曲線的繪制
取Iul煙草葉部組織中提取的DNA溶液做為模板進行定量PCR反應，分別以煙草炭疽病菌的特異引物:CGTTTCTTCTGAGTGGCACA和TTGAAATGACGCTCGAACAG進行模板片段擴增，擴增體系如下:反應體系(25 yL)含PCR mastermix 12.5 yL；上下引物各I yL;模板2 yL；ddH20 8.5 yL。反應程序為95 °C預變性5 min；95 °C變性15 s，58 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，40個循環。
[0041]采用瓊脂糖膠回收試劑盒割膠純化回收PCR產物。按試劑盒方法用PMD18-T載體連接PCR純化產物，以大腸桿菌DH5a制備的感受態細胞轉化連接產物，在氨芐青霉素平板上進行藍白斑實驗篩選陽性克隆。1.2.2.3相應標準曲線構建按質粒DNA提取試劑盒純化陽性克隆重組質粒DNA，然后用核酸濃度儀測定重組質粒DNA的OD值并換算成拷貝數將得到的己知拷貝濃度的陽性模板用雙蒸水以10倍梯度稀釋，直至每微升溶液的拷貝數小于1(100?10-10)。將每個濃度梯度的陽性模板在優化后的定量PCR條件下進行測定，獲得相應的Ct值，以各濃度梯度起始模板數的對數值為X軸，相應的Ct值
10倍系列稀釋，檢測Ct值，建立標準曲線。
[0042]2、待測煙葉樣品的定量PCR檢測。
[0043 ]取I u I煙草葉部組織中提取的DNA溶液做為模板進行定量PCR反應。
[0044]熒光定量PCR核酸擴增:將所述步驟(I)得到的混合溶液置于熒光定量Lightcycler 480II檢測儀上進行反應;反應條件:95°C5分鐘預變性;95°(:10秒，58°C 10秒，72 0C 20秒，做45個循環，溶解曲線分析:從65 °C開始至95 °C結束，以0.2 °C /秒讀取熒光值。測定Ct值后，并與標準曲線比較得出定量結果。每輪熒光定量PCR反應均同時做陰性對照和空白對照。
[0045]根據如下公式計算出煙草炭疽病菌在煙株中的定殖數量。
[0046]N=NPCRXVDNAX(I/WSAMPLE)
Q為PCR反應得到的炭疽病菌濃度，VDNA為對煙株提取的DNA的最終稀釋量，WSAMPLE為提取DNA所用的煙株的組織重量。
[0047]通過對采取的煙葉樣品進行DNA提取后進行定量PCR檢測，，結果表明煙草炭疽病菌在Ig煙葉組織中的數量大約在1.1X106-1.5 X 108個。
[0048]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種檢測煙草炭疽病定殖量的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)熒光定量核酸擴增反應體系的配制:在反應管中加入正向LNA引物、反向LNA引物、模板DNA、和2 X熒光定量PCR反應混合液，增加ddH20至反應體系為25μ1，混合均勻； (2)熒光定量核酸擴增:將所述步驟(I)得到的混合溶液置于熒光定量檢測儀上進行反應； (3)反應結束后，將模板DNA的循環閾值C(t)與標準曲線對照，得到模板DNA中的18S核糖體RNA片段拷貝的濃度。2.根據權利要求1所述的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述的正向引物和反向引物的序列如下: 上游引物序列為:CGTTTCTTCTGAGTGGCACA，下游引物 TTGAAATGACGCTCGAACAG。3.根據權利要求1所述的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述的正向引物和反向引物的終濃度均為25μΜ。4.根據權利要求1所述的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述的步驟(2)的反應條件為95°C熱啟動8分鐘預變性后;進入擴增循環:95°C 30秒，58°C 10秒，72°C 20秒;循環45次。
【專利摘要】本發明涉及一種檢測煙草炭疽病定殖量的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：（1）熒光定量核酸擴增反應體系的配制：在反應管中加入正向LNA引物、反向LNA引物、模板DNA、和2×熒光定量PCR反應混合液，增加ddH2O至反應體系為25μl,混合均勻；（2）熒光定量核酸擴增：將所述步驟（1）得到的混合溶液置于熒光定量檢測儀上進行反應；（3）反應結束后，將模板DNA的循環閾值C（t）與標準曲線對照，得到模板DNA中的18S核糖體RNA片段拷貝的濃度。本發明檢測時間短，靈敏度高，操作作過程簡單，標準化操作，檢測通量大。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105648053
【申請號】
【發明人】韋鳳杰, 蘇新宏, 葉紅朝, 趙世民, 王惠, 董昆樂, 孔德輝, 李豪豪, 奚家勤, 胡利偉, 李芳芳, 趙浩賓, 何雷, 李磊, 王根發
【申請人】河南省煙草公司洛陽市公司, 中國煙草總公司河南省公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月30日