Y-染色體str標記的分析的制作方法
【專利說明】γ-染色體STR標記的分析
[00011 本申請為分案申請，原申請的申請日為2010年9月10日，申請號為201080051273.9 (PCT/US2010/048542)，發明名稱為"Y-染色體STR標記的分析"。
[0002] 本申請要求2009年9月11日提交的美國臨時申請號61/241，778、2010年7月23日提 交的美國臨時申請號61 /367，346以及2010年9月1日提交的美國臨時申請號61 /379，340的 優先權。申請號、序列號61/241，778、61/367，346以及61/379，340通過引用以其整體為任何 目的結合到本文中。
[0003] 領域 本主題發明的實施方案為DNA的法醫分析領域。
[0004] 背景 在分析犯罪現場發現的DNA中，使用STR標記已成為標準工具。在多數情況下，利用常染 色體STR標記的用途，這部分地因為其在大多數群體中的高水平多態性。例如，在美國，用于 建立疑犯DNA數據庫的標準的13個⑶DIS基因座為常染色體STR標記。在許多混有男性和女 性貢獻者血跡的案例中，特別在強奸案中，法醫調查人員必須分析Y染色體上存在的遺傳標 記以鑒別通常屬于犯罪者的男性組分。這是因為在這種案件中，常染色體STR標記由于例如 女性受害者DNA與男性犯罪者DNA之間的譜重疊而不能提供信息。盡管存在優先獲取男性 DNA的技術可能（即差異裂解），但此類技術往往不成功。因為女性DNA缺少Y染色體，Y染色體 標記的分析可用于相對樣品中的男性DNA含有高水平女性DNA的樣品。因此，分析Y染色體 DNA排除了由過量女性來源DNA導致的復雜假象。
[0005] 非重組性質使得能夠將Y染色體標記用于男性譜系鑒定，即父性相關并因此共有 相同Y-STR單元型的男性組，即基于法醫中目前使用的Y-STR標記。男性譜系鑒定已成為法 醫遺傳學中排除男性的極有用的工具。然而，在非-排除（即匹配Y-STR譜）的案例中，基于現 有Y-STR標記不能做出基于個人的報告書，因為男性疑犯及其所有男性親屬對犯罪現場樣 品的貢獻具有相同的概率。這顯然是其中期望基于個人的結論的法醫應用中的局限性。然 而，突變事件可出現在Y-STR標記。原則上，Y-STR標記中的這些突變可使調查人員能區分近 親男性親屬，以及還能區分更遠親男性，前提是此類突變在給定男性親屬對中以使其可被 觀察到的足夠高頻出現。現有Y-STR標記中的突變為相當罕見事件，以約0.1至0.4% (每一 Y-STR基因座每一千世代事件(generational event)有1-4個變化）出現。因此，甚至當使用 相對大量的Y-STR標記（即現今用于法醫應用的那17種標記)時，區分男性親屬的概率仍極 低。然而，若可得到足夠的比現今已知Y-STR突變更快的Y-STR標記，則可預期的是，可基于 Y-STR突變區分近親男性以及遠親男性以實現法醫應用中期望的男性個體鑒定。
[0006] 發明人已發現13種Y-STR標記的亞組，其比大多數Y-STR標記(包括被廣泛使用的 那些)具有顯著更高的突變率。該發現預期將徹底改變Y染色體在法醫生物學中的應用，這 與先前的男性譜系區分方法不同。該發現還為男性個體鑒定指引了方向。因此，通過使用一 種或多種，通過使用兩種或更多種此類快速突變￥-31財示記(>3口1(117-1]111丨31:;[叫￥-5丁1? marker，RM Y-STR)，區分近親和遠親男性親屬的能力顯著增加。
[0007] 概述 本發明的某些實施方案包括通過確定至少2種選自以下快速突變Y-STR標記的Y-STR標 記的等位基因來鑒定個體的方法 DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、 0丫5518、0￥5526、0￥5547、0￥5570、0￥5576、0￥5612、0￥5626和0￥5627。在本方法的一些實施方 案中，等位基因可通過PCR來鑒定。在本方法的一些實施方案中，等位基因可通過質譜來鑒 定。PCR可為多重PCR以便共擴增所述至少2種快速突變Y-STR標記。本發明的某些實施方案 包括擴增引物對組，其包括用于擴增至少2種選自以下的Y-STR標記的引物：DYF387S1、 DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、 DYS626和DYS627。引物組可共擴增至少2-13種快速突變Y-STR標記。在某些實施方案中，除 快速突變Y-STR標記外，引物組還可共擴增常染色體STR標記。在一些實施方案中，所述常染 色體 STR 可選自 D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21Sll、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、 D16S539、TH01、TP0X和CSF1P0。在一些實施方案中，引物可用熒光染料標記。提供的其它實 施方案為用于從至少2種選自以下的Y-STR標記中調取STR的一個或多個等位基因的等位基 因梯大小標準品（allelic ladder size stnadard):DYF387Sl、DYF399Sl、DYF403Sl、 0￥卩40451、0￥5449、0￥5518、0￥5526、0￥5547、0￥5570、0￥5576、0￥5612、0￥5626和0丫5627。提供 的其它實施方案為用于鑒定至少2種Y染色體STRS標記的等位基因的試劑盒，其中所述標記 選白 DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、 DYS576、DYS612、DYS626和DYS627,所述試劑盒包括用于擴增至少2種快速突變Y-STR標記的 引物，以及代表所選標記的等位基因梯(allelic ladder)。
[0008] 附圖和附表簡述 圖1.根據父子對分析建立的186種Y-STR標記的突變率。通過分析每一標記多達1966 個經DNA確認的父子對，依據其基于貝葉斯的突變率(Bayesian-based mutation rate) (具有置信區間）來估計186種Y-STR標記的分布。確定用于進一步家族/系譜分析的13種快 速-突變(RM) Y-STR標記用紅色突出顯示，且常用的17種Yfiler Y-STR用綠色表示。多拷貝 Y-STR用黑色插入菱形標出。
[0009] 圖2.最長同源陣列(homogeneous array)的長度或基因座內重復總數與來自267 個Y-STR基因座的等位基因-特異性突變率之間的相關性。盡管基因座內存在的重復數"最 長同源陣列可用于預測可突變性，所有存在于基因座內的重復總數具有更高的預測值。
[0010] 圖3.來自267個Y-STR基因座的重復總數與突變方向以及突變率之間的關系。重 復喪失突變(repeat loss mutation)(收縮)展示與在具有更高數目重復的基因座的重復 總數、喪失率增加率的指數關系。重復獲得突變(repeat gain mutation)(擴展）顯示弱的 二次函數，獲得率在20個總重復具有峰值。
[0011] 圖4.用13種新鑒定的RM γ-STR以及17種常用的Yfiler γ-STR來區分男性親屬。 基于13種RM Y-STR(用紅色表示)和17種Yfiler Y-STR(用藍色表示），通過分析來自80個男 性系譜的103對來區分男性親屬的結果(依據分隔系譜成員的世代數來分類）。誤差條代表 95%的二項式置信區間。注意到這些樣品獨立于最初用于建立Y-STR突變率的父子對。
[0012] 表1.通過分析多達1966個經DNA確認的父子對，根據186種γ-STR標記的后驗分布 (posterior distribution)(中值和95%置信區間）的突變率估計。具有超過10-2中值突變 率的標記(RM Y-STR組)突出顯示。此外還包括的是所觀察到的標記重復結構、獲得/喪失的 數目、總突變以及父子傳遞總數。包括PCR引物、PCR退火溫度和用于基因型分型的基因座分 配至54重(multiplex)以及3個RM Y-STR多重。
[0013] 表2.根據在186個Y-STR標記篩查總數為352,999個減數分裂轉移，在120個Y-STR 標記中觀察到的924個突變的詳情。在可能的情況下，給出在突變Y-STR的父與子兩者的等 位基因的重復結構。在擴增子內具有多個可變區段(variable segment)的多拷貝標記的情 況下，在無序列信息的情況下，給出總重復數或擴增子大小。給出了兒子出生時父親的年 齡，這作為個體對參考。
[0014] 表3.根據分開同一系譜成員的世代數，通過分析來自80個男性系譜的103對，對 13種快速突變RM Y-STR與17種Yfiler Y-STR通過1個或多個突變來區分男性親屬而進行比 較。
[0015] 定義 Y-STR標記中的〃突變〃是STR標記的重復區域的長度變化或散布有重復單元的堿基的 長度(即數目）變化。例如，添加一個或多個重復單元是導致出現新等位基因的突變。在另一 實例中，在單個重復單元內添加單個堿基亦是導致出現新等位基因的突變。此類變化可以 是添加或缺失一個或多個重