各3h，無水乙醇1、無水乙醇Π脫水各2h，二甲苯1、二甲苯Π透明各20min，石蠟I，石蠟Π浸蠟各40min)，包埋和切片，切片厚度為4μπι，切片用烤箱50°C烘干，進行HE染色，封片使用中性樹膠封固，并進行病理學觀察。
[0036]實施例3免疫組化觀察本發明的藥物組合物對急性日本血吸蟲感染小鼠肝組織P65蛋白表達的影響。
[0037]石蠟切片脫蠟至水；3 ^H2O2室溫孵育5-10min，蒸餾水沖洗;PBS浸泡5min ；5-10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育1min;滴加ant1-p65的抗體，過夜;PBS沖洗，5minX 3次;滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗(I % BSA-PBS稀釋)，37 °C孵育10_30min ； I3BS沖洗，5min X 3次;滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素;37 °C孵育10_30min ； PBS沖洗，5minX3次;顯色劑顯色(DAB);自來水充分沖洗，復染，封片。
[0038]實驗方法:前期處理同實施例1。
[0039]實施例4Western Blot檢測本發明的藥物組合物對急性日本血吸蟲感染小鼠肝組織P65蛋白表達的影響。
[0040]取適量肝組織，在RIPA裂解液中裂解，測定蛋白濃度，取40yg蛋白上樣，采用10%SDS-PAGE蛋白膠進行電泳，電泳后，將蛋白轉移至PVDF膜上，采用anti_p65的抗體進行抗原抗體反應，最后進行ECL顯色。
[0041 ] 實驗方法:前期處理同實施例1。取一部分肝組織經Western Blot檢測P65蛋白在肝組織中的表達。
[0042]實驗結果
[0043]1、本發明的藥物組合物對急性日本血吸蟲感染小鼠肝臟形態影響。
[0044]實驗結果表明:正常對照組小鼠的肝臟表面光滑，呈粉紅色，邊緣較鈍，質軟;感染血吸蟲后的急性模型組小鼠的肝臟明顯腫大，表面散在大量粟粒狀灰白結節，肝臟呈黑褐色，邊緣銳利，質硬;低劑量給藥組、高劑量給藥組和吡喹酮對照組的小鼠中，吡喹酮對照組的小鼠的肝臟仍呈暗紅色，表面的灰白結節減少，并且腫大未完全消退，而低劑量給藥組、高劑量給藥組的小鼠的肝臟都沒有褐色，也未發現腫大，特別是高劑量給藥組的小鼠的肝臟呈粉紅色，表面光滑，質軟，邊緣較鈍，與正常對照組小鼠的肝臟一樣(如圖1所示)。
[0045]2、本發明的藥物組合物對急性日本血吸蟲感染導致的肉芽腫形成的影響。
[0046]實驗結果表明:正常組小鼠的肝小葉結構清晰，肝細胞呈放射狀排列，肝細胞形態正常;感染后模型組小鼠肝細胞蟲卵肉芽腫面積達到峰值，圍繞蟲卵有大量紅色膠原，其周圍有大量炎性細胞浸潤，附近肝細胞出現嗜酸性壞死。給藥各組后炎性細胞減少，蟲卵肉芽腫面積縮小;在給藥各組中，吡喹酮對照組所殘存的炎性細胞較多，并且仍有肉芽腫;本發明的藥物組合物給藥組中，隨著給藥劑量的增加，高劑量給藥表現最好，組肉芽腫消失，炎性細胞也極大減少幾乎為零(如圖2所示)。
[0047]用ImagePro Plus分析比較肉芽腫的面積，吡喹酮對照組處理抑制肉芽腫面積效率達到11.6%;低劑量給藥組處理抑制肉芽腫面積效率達到65.6%；高劑量給藥組處理能100%完全抑制肉芽腫形成(如圖3所示)。
[0048]3、免疫組化觀察本發明的藥物組合物對急性日本血吸蟲感染小鼠肝組織P65蛋白表達的影響。
[0049]本發明的藥物組合物可抑制急性日本血吸蟲感染小鼠中的NF-KB途徑。用S-P超敏試劑盒檢測小鼠肝組織中P65的表達發現在正常組中P65的表達很低，感染模型組棕黃色面積顯著增加，吡喹酮對照組相對于感染組棕黃色面積明顯減少，但是在中心仍存在一塊棕黃色區域。而本發明的給藥組中不存在棕黃色面積區，并且隨著給藥量增大，陽性區域的面積變小顏色進一步減淡(如圖4所示)。
[0050]用Image Pro Plus分析免疫組化中各組P65的表達，吡喹酮對照組處理抑制P65的表達達到59.8%，低劑量給藥組處理抑制P65的表達達到76.7% ;高劑量給藥組處理抑制P65的表達達到94.3% (如圖5所示)。
[0051 ] 4、Western Blot檢測本發明的藥物組合物對急性日本血吸蟲感染小鼠肝組織P65蛋白表達的影響。
[0052]提取肝組織中的蛋白后用WesternBlot檢測小鼠肝組織中P65的表達，其趨勢與免疫組化的結果一致(如圖6所示)；
[0053]用ImageJ對P65的各個蛋白條帶平均灰度值進行分析，卩比喹酮對照組處理抑制P65的表達達到43.2%，低劑量給藥組處理抑制P65的表達達到64%;高劑量給藥組處理抑制P65的表達達到83.1% (如圖7所示)。
[0054]盡管已經示出和描述了本發明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。
【主權項】
1.一種防治急性血吸蟲感染的藥物組合物，其特征在于:所述的藥物組合物是由染料木素和吡喹酮組成。2.如權利要求1所述的防治急性血吸蟲感染的藥物組合物，其特征在于:所述的藥物組合物中染料木素和吡喹酮的重量比為25-75:500。3.如權利要求1所述的防治急性血吸蟲感染的藥物組合物，其特征在于:所述的藥物組合物的劑型為乳劑、微乳劑、懸浮劑、油劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、緩釋控釋劑、注射劑或納米制劑。4.如權利要求1所述的防治急性血吸蟲感染的藥物組合物，其特征在于:所述的藥物組合物還包括藥用上可接受的輔料。5.如權利要求1所述的藥物組合物用于制備防治急性血吸蟲感染的藥物的用途。6.如權利要求5所述的用途，其特征在于:所述的血吸蟲為日本血吸蟲。7.如權利要求5所述的用途，其特征在于:防治急性血吸蟲感染時，組合物中染料木素的用量為25-75mg/Kg，吡喹酮為500mg/Kg。
【專利摘要】本發明公開了一種防治急性血吸蟲感染的藥物組合物，屬于醫藥技術領域。本發明的藥物組合物是由染料木素和吡喹酮組成。藥物組合物中染料木素和吡喹酮的重量比為25-75:500。本發明的藥物與吡喹酮相比具有更好的療效，經過使用本發明的藥物治療能使得肝組織形態正常，肉芽腫消失，炎性細胞也極大減少，P65蛋白表達正常。本發明的藥物對日本血吸蟲有很好的殺蟲功效，可用于防治急性日本血吸蟲經皮感染。
【IPC分類】A61K31/4985, A61P33/12, A61K31/352
【公開號】CN105663134
【申請號】
【發明人】萬春鵬, 姚亮亮, 黃衛鋒, 陳金印
【申請人】江西農業大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年11月27日