專利名稱：從白樺的葉片誘導不定芽的培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術，具體的講，本發明屬植物生物技術的白樺生物技術。
目前，白樺作為林木細胞工程模式種，其組織培養技術一直為國內外學者所關注。從七十年代末起，國外就開始對白樺的組織培養進行研究。Huhtiren等人于1974年，Mc crown等人于1979年分別對歐洲白樺(Betula pendula)和美洲樺(B.papyrifera)組織培養獲得成功。我國的樺樹離體培養工作開始于九十年代。有關白樺(B.platyphylla)的組織培養報道僅發表在1999年東北林業大學學報上，其中陶靜、詹亞光等人發表了白樺組織培養的研究，詳細報道了有關白樺的組織培養技術。他們利用腋芽完成了白樺的快繁成功，但并沒有利用葉盤外植體建立起再生體系。
本發明的目的在于提供一種適合于白樺的葉盤組織培養的培養基。
為了達到上述目的，本發明采用的技術方案是在由硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB5培養基的基礎上還增加6－BA、NAA及IBA。
MSB5培養基配方為
本發明的優點是該培養基誘導率高，增殖率高，可以在較短的時間內得到大量的再生苗，建立優良的再生體系，并為根癌農桿菌的轉化提供了保障。
下面對本發明的實施例作詳細的描述。
該培養基的組成成分是硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB5培養基的基礎上還增加6－BA、NAA及IBA，本發明的特征是在原來MSB5培養基基礎上增加了6－BA、NAA及IBA，在世界上首次建立起白樺的葉盤再生體系。
MSB5培養基配方為
所述的誘導培養基MSB5＋6－BA1.0mg/l＋NAA0.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；所述的伸長培養基MSB5＋6－BA0.4mg/l＋GA30.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；
所述的生根培養基1/2MSB5＋IBA0.5mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂。
各種培養基配置時除添加以上成分外，PH值要調整為5.8，分裝后在121℃，1.1kg/cm2的壓力下滅菌20分鐘；所述的生根苗移栽的條件的環境濕度應保持在90—100％或過飽合狀態，光照溫度保持在500—800Lux。
MSB5培養基配方為
應用以上培養基，用白樺葉盤接鐘在該培養基上，一個月可以產生不定芽。轉移到伸長培養基里培養，并繼代一次，然后轉入生根培養基即可誘導生根。待生根苗生長健壯后，即可進行移栽，經溫室培養兩周，逐漸移至苗圃培養。
本發明用白樺(Betula platyphylla)的葉盤進行培養，取得成功，葉盤來源于腋芽再生苗、下胚軸再生苗和莖段再生苗，這些再生苗的基本培養基為改良的WPB5，具體操作如下WPB5培養基配方為
1、腋芽再生苗葉盤的獲得于12月至次年3月從生長健壯、無病蟲害的優樹上采集枝條，保存于4℃冰箱。接種前將枝段在室溫下水培7—10天，待芽萌動后即可用于接種。將萌動芽取下后，在表面活性劑的作用下用自來水沖洗，除去表面灰塵，然后用70％乙醇消毒1min。在超凈工作臺中用5％次氯酸鈉處理10min后可進行接種。
腋芽可以通過腋芽生枝和愈傷兩種途徑進行增殖。腋芽生枝途徑的培養基成分如下起始培養基WPB5(WP大量＋WP微量＋B5有機物)＋0.8mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂增殖培養基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷途徑的培養成分如下起始培養基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂繼代培養基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂分化培養基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂離體培養三代以上的再生苗葉盤可用于再生培養。
2、下胚軸再生苗葉盤的獲得9日齡下胚軸接入誘導培養基后，7天端部開始膨大，20天后形成各種愈傷組織。將愈傷組織從外植體上切下，在繼代培養基中培養30天后，轉入分化培養基，20天后愈傷組織開始分化出再生苗。再生苗離體培養三代后的葉盤可以用于再生培養。
獲得下胚軸再生苗的培養基如下愈傷誘導培養基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷繼代培養基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷分化培養基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂壯苗培養基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂3、莖段再生苗葉盤的獲得莖段接入誘導培養基7天后兩端開始膨大，逐漸形成綠色致密愈傷，30天后將愈傷從莖段兩段切下，經過30天繼代培養后，將愈傷轉入分化培養基。20天后愈傷分化出再生苗，再生苗離體培養三代后，葉盤可用于再生培養。
愈傷誘導培養基WPB5＋1.0mg/lBA＋0.1mg/lNAA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷繼代培養基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷分化培養基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂壯苗培養基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂將通過上述途徑獲得的葉片邊緣剪去，沿與主脈垂直的方向將其剪成直徑約為0.5cm的葉盤，將葉盤向軸面朝下接種于誘導培養基，一個月后將誘導出的不定芽從邊緣切下轉入伸長培養基，在伸長培養中繼代一次后，當再生苗長到1.5—2cm直徑為1mm時，將再生苗轉入生根培養基，經過3—4周培養小苗已具有了發達、健壯的根系，苗莖已木質化，此時即可進行移栽。
將生長健壯的生根試管苗除去棉塞在溫室進行3天左右的煉苗，使試管苗適應環境的濕度。移栽前將再生苗從三角瓶中取出，洗去根上粘有的培養基，栽入溫室進行培養，澆透水。試管苗移栽初期對環境要求嚴格，環境濕度應控制在90％，光照強度為5000Lux左右，才能保證移栽的成活率。
葉盤再生培養基如下誘導培養基MSB5＋6－BA1.0mg/l＋NAA0.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂伸長培養基MSB5＋6－BA0.4mg/l＋GA30.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂生根培養基1/2MSB5＋IBA0.5mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂
權利要求
1.一種從白樺的葉片誘導不定芽的培養基，其特征在于在由硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB5培養基的基礎上還增加6—BA、NAA及IBA。MSB5培養基配方為
2.按照權利要求1所述的從白樺的葉片誘導不定芽的培養基，其特征在于所述的培養基配方還包括a、誘導培養基MSB5＋6－BA1.0mg/l＋NAA0.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；b、伸長培養基MSB5＋6－BA0.4mg/l＋GA30.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；c、生根培養基1/2MSB5＋IBA0.5mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂。
3.按照權利要求1所述從白樺的葉片誘導不定芽的培養基，其特征在于生根苗移栽的條件的環境濕度應保持在90—100％或過飽和狀態，光照強度保持在500—8000Lux。
全文摘要
一種從白樺的葉片誘導不定芽的培養基,由硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB
文檔編號A01H4/00GK1334003SQ0013431
公開日2002年2月6日 申請日期2000年12月13日 優先權日2000年12月13日
發明者祖元剛, 孔瑾, 王慧梅, 聶明珠, 石福臣, 谷會巖, 楊逢建, 張寶友 申請人:東北林業大學