一種lak細胞的誘導培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體的說是設及一種LAK細胞的誘導培養方法。
【背景技術】
[0002] LAK細胞即淋己因子激活的殺傷細胞，其是將外周血淋己細胞在體外經淋己因子 白介素-2 (比-2)激活3~5天而擴增為具有廣譜抗瘤作用的一種殺傷細胞。 陽003]細胞治療是繼手術、放療和化療之后的有一種腫瘤治療方法，它一般作為手術、放 化療的輔助手段，延長患者的壽命，清除體內手術后殘余的癌細胞。細胞治療主要包括LAK 細胞治療、CTL細胞治療、CIK細胞治療W及NK細胞治療等。LAK細胞培養成本相對較低， 且細胞容易誘導和擴增，已成為臨床免疫細胞治療的主要細胞。
[0004] 然而，臨床上采用LAK細胞治療腫瘤時，需LAK細胞的數量應達到1〇1°數量級左 右，而普通的LAK細胞誘導培養方法擴增的數量有限，很難達到臨床回輸的要求；同時所誘 導培養的LAK細胞中的效應細胞亞群數量有限，殺傷祀細胞的能力較差。因此，必需尋找用 另一種能增強LAK細胞的增殖活性，最好同時能增強LAK細胞的殺傷能力的免疫細胞培養 方法。
【發明內容】
陽0化]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種LAK細胞的誘導培養方法，使得所述方法 能夠顯著提高LAK細胞的數量。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種LAK細胞的誘導培養方法，使得所述方法能夠 顯著增加LAK細胞中效應細胞亞群的數量，增強LAK細胞的殺傷能力。
[0007] 為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0008] 一種LAK細胞的誘導培養方法，包括：
[0009] 步驟1、從外周血分離出單個核細胞，同時制備膠原支備用；
[0010] 步驟2、將步驟1膠原支架平鋪到細胞培養容器中，然后用免疫細胞培養基重懸單 個核細胞并接種到平鋪有膠原支架的細胞培養容器中，同時補加IL-2、比-15W及0KT-3細 胞因子進行培養，定期補充疫細胞培養基和各細胞因子。
[0011] 本發明主要引入了細胞=維培養的技術思維來解決現有免疫細胞LAK細胞的技 術問題，=維培養是指將具有=維結構的載體與各種不同的種類的細胞在體外共同培養， 使細胞能夠在載體的=維立體空間結構中遷移、生長，構成=維的細胞載體復合物。
[0012] 單層細胞培養由于細胞在體外改變的環境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往 和體內情況不相符；動物實驗雖在體內進行，但體內多種因素制約W及體內和外界環境相 互影響而不能觀察到研究者最為關屯、的中間過程。因此，現有技術提出了=維細胞培養技 術模擬體內的微環境，填補了單層細胞培養和動物實驗的鴻溝，主要用于醫學領域的理論 研究。而本發明針對現有LAK細胞培養方式的缺點，將膠原支架引入LAK細胞的培養中， 利用膠原支架進行LAK細胞的=維培養，同時配合適宜的細胞因子，由此促進LAK細胞的增 殖，W及增加了其中效應細胞亞群的數量，增加了殺傷活性。
[0013] 在本發明中，所述外周血分離出單個核細胞可參照本領域已有的分離方法，本發 明優選為：
[0014] 外周血離屯、收集下層血細胞加生理鹽水稀釋，加入淋己分離液后離屯、，棄上層液 體，加水生理鹽水洗涂，再次離屯、后去上清，獲得單個核細胞。
[0015] 更進一步優選為：
[0016] 將外周血在400-500g離屯、力下離屯、5-lOmin，離屯、結束后將下層血細胞轉移到 50血離屯、管中，加入兩倍體積的生理鹽水進行稀釋。
[0017] 另取一支新的sepmate離屯、管（購自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己細胞分 離液（購自STEMCE化公司）12ml，將稀釋后的血細胞轉移到sepmate離屯、管，600-800g離 屯、15-20minD
[001引離屯、后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進行洗嫌1次，離屯、，得到PBMCd陽019] 作為優選，制備膠原支架具體為： 陽020] 將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，消毒后，用免疫細胞培養 基浸泡，置于4°C冰箱待用。
[002U更優選為，將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，利用紫外線照 射膠原支架材料，同時用75 %的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進行消毒，用免疫細胞培養 基浸泡2-4小時，置于4°C冰箱待用。
[0022] 進一步優選地，所述免疫細胞培養基為X-VIVO15培養液。
[0023] 作為優選，步驟2所述進行培養為在37°C、5%二氧化碳的環境中培養14天。
[0024] 作為優選，步驟2所述IL-2因子濃度為100-500U/ml，具體可W選擇100、200、 250、300、350、400、450 或 500U/ml。
[0025] 作為優選，步驟2所述比-15因子濃度為10-100yg/ml，具體可W選擇10、20、30、 40、50、60、70、80、90 或 100yg/ml。
[0026] 作為優選，步驟2所述0KT-3因子濃度為10-100yg/ml，具體可W選擇10、20、30、 40、50、60、70、80、90 或 100yg/ml。
[0027] 作為優選，步驟2所述接種的接種密度為1X106-2XIO6個細胞/ml。
[0028] W本發明所述方法進行LAK細胞的誘導培養，相對于現有的誘導培養方法，本發 明能夠將LAK細胞數量擴增到400XIO6左右，較現有技術中的LAK細胞量60X10 6左右極 顯著提高了LAK細胞數量，而且同時可W提高LAK細胞中效應細胞亞群的數量，增強LAK細 胞的殺傷能力。
[0029] 由W上技術方案可知，本發明在LAK細胞的誘導培養引入了膠原支架進行=維培 養，同時配合細胞因子的加入，由此解決了傳統培養方法擴增的數量有限、效應細胞亞群數 量低、細胞殺傷活性不高的問題，滿足臨床上對于LAK細胞的需求。
【附圖說明】
[0030] 圖1所示為本發明方法誘導培養的LAK細胞和現有方法誘導培養的LAK細胞的增 殖曲線圖；
[0031] 圖2所示為本發明方法誘導培養的LAK細胞亞群流式檢測結果，Al表示CD3+亞 群細胞的流式檢測圖，A2表示CD3+CD4+亞群的流式檢測圖，A3表示CD3+CD8+亞群的流式 檢測圖，A4表示CD3+CD56+亞群的流式檢測圖；
[0032] 圖3所示為現有技術方法誘導培養的LAK細胞亞群流式檢測結果，Al表示CD3+亞 群細胞的流式檢測圖，A2表示CD3+CD4+亞群的流式檢測圖，A3表示CD3+CD8+亞群的流式 檢測圖，A4表示CD3+CD56+亞群的流式檢測圖。
【具體實施方式】
[0033] 本發明實施例公開了一種LAK細胞的誘導培養方法。本領域技術人員可W借鑒本 文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例 進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的產品及方 法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0034] 為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的一種LAK細胞的誘導培 養方法進行詳細說明。
[0035] 實施例1:本發明所述誘導培養方法
[0036] 1、膠原支架材料的制備
[0037] 將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，利用紫外線照射膠原支架 材料，同時用75%的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進行消毒，用X-VIVO15培養液浸泡3小 時，置于4°C冰箱待用。
[0038]2、外周血來源的PBMC的制備
[0039] 將抗凝管中的外周血轉移到離屯、管中，400-500g離屯、5-lOmin，離屯、結束后將下 層血細胞轉移到50血離屯、管中，加入兩倍體積的生理鹽水進行稀釋。
[0040] 另取一支新的sepmate離屯、管（購自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己細胞分 離液（購自STEMCE化公司）12ml，將稀釋后的血細胞轉移到sepmate離屯、管，600-800g離 屯、15-20min。
[0041] 離屯、后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進行洗涂1次，離屯、，得到PBMC。 陽0創 3、PBMC在膠原支架上誘導成LAK細胞
[0043] 將膠原支架平鋪在細胞培養瓶底；用X-VIVO15培養基重懸細胞，按照1. 5XIO6/ ml的密度接種在鋪有膠原支架的細胞培養瓶中，同時補加300U/ml的a-2,50iig/ml的 比-15和60yg/ml的0KT-3,在37°C、5%二氧化碳的培養箱中培養。定期在倒置顯微鏡下 觀察細胞的狀態，每隔1-2天對細胞進行補液狂-VIVO15培養基和各細胞因子），培養14 天后，收集LAK細胞。 W44] 現有技術：同實施例1，區別在于未平鋪膠原支架。
[0045] 實施例2:本發明所述誘導培養方法
[0046] 1、膠原支架材料的制備
[0047] 將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，利用紫外線照射膠原支架 材料，同時用75%的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進行消毒，用X-VIVO15培養液浸泡2小 時，置于4°C冰箱待用。 W4引 2、外周血來源的PBMC的制備 W例將抗凝管中的外周血轉移到離屯、管中，400-500g離屯、5-lOmin，離屯、結束后將下 層血細胞轉移到50血離屯、管中，加入兩倍體積的生理鹽水進行稀釋。
[(K)加]另取一支新的sepmate離屯、管（購自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己細胞分離液（購自STEMCE化公司）12ml，將稀釋后的血細胞轉移到sepmate離屯、管，600-800g離 屯、15-20min。
[0051] 離屯、后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進行洗涂1次，離屯、，得到PBMC。 陽05引 3、PBMC在膠原支架上誘導成LAK細胞
[0053] 將膠原支架平鋪在細胞培養瓶底；用X-VIVO15培養基重懸細胞，按照1Xl〇6/ml /ml的密度接種在鋪有膠原支架的細胞培養瓶中，同時補加50