本發明屬于細胞培養基
技術領域：
，具體涉及一種干細胞培養基及其制備方法。
背景技術：
：干細胞在單純的基礎培養基中不能存活，在細胞培養中必須提供某些痕量營養物質及生長因子才能使細胞得以生長并維持生長狀態。因此采用的基礎培養基常常要添加血清，如馬血清或胎牛血清；因為血清是由很多大小不同生物分子組成的極為復雜的混合物，它能提供細胞在體外培養時所需要的生長因子、激素、結合蛋白，并提供保護作用；而且本身血清中還富含有絲分裂因子，也利于細胞系和原代培養。但血清培養基存在一定的弊端，無法規避動物血清中的異源體，如果使用動物血清培養基培育出來的細胞，會存在人體異源體排斥和沖突。尤其是在干細胞培養的過程中，血清中大量成分復雜的蛋白質，給細胞培養的標準化帶來困難，其中復雜的蛋白和多重的細胞因子，會導致本身就容易分化的干細胞生出多種完全不同的細胞表型，而產生多種完全不同的細胞分化趨勢，也給細胞培養表達產品分離純化和結果的重復性帶來很大的困難。中國專利申請CN105087480A公開了一種無血清干細胞培養基，包括基礎培養基和添加在該基礎培養基中的補充因子，補充因子包括亞硒酸鈉、轉鐵蛋白、牛血清白蛋白、胰島素、纖粘連蛋白和氫化可的松。中國專利申請CN104357379A公開了一種干細胞培養基，包含以下組分：水溶性非聚電解質高分子、無機鹽類、維生素、氨基酸、葡萄糖、轉鐵蛋白、胰島素或類胰島素功能替代品如(IGF-1/2)、成纖維生長因子。目前，已經研發出不含血清的干細胞培養基，但是，現有的干細胞培養基存在細胞增殖的速度慢的問題。技術實現要素：針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種干細胞培養基及其制備方法。本發明提供的干細胞培養基能快速擴增干細胞，大大縮短了干細胞培養的時間。本發明的技術方案是：一種干細胞培養基，包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：人血白蛋白1-3mg/mL，轉鐵蛋白8-13μg/mL，胰高血糖素0.12-0.15μg/mL，活性炭2.5-3μg/mL，成纖維細胞生長因子13-18ng/mL，表皮生長因子7-11ng/mL，亞油酸3-6μM，槲皮素5-9μg/mL，桔梗皂苷D20-25μg/mL，昆布氨酸2-5mg/mL，腺苷脫氨酶3-7μg/mL，肉豆蔻酸1.2-1.6μM。進一步地，所述干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：人血白蛋白2mg/mL，轉鐵蛋白10μg/mL，胰高血糖素0.14μg/mL，活性炭2.8μg/mL，成纖維細胞生長因子15ng/mL，表皮生長因子9ng/mL，亞油酸5μM，槲皮素6μg/mL，桔梗皂苷D23μg/mL，昆布氨酸4mg/mL，腺苷脫氨酶5μg/mL，肉豆蔻酸1.4μM。進一步地，所述基礎培養基為DMEM或F12培養基。另外，本發明還提供了所述干細胞培養基的制備方法，包括以下步驟：S1向基礎培養基中加入人血白蛋白、轉鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌25-35分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續攪拌30-40分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置2-4小時，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為6-8％的碳酸鈉溶液，調節培養基的pH至7.2-7.4，滅菌溫度為118℃-123℃，滅菌時間為16-20分鐘，即得。優選地，所述步驟S1攪拌30分鐘。優選地，所述步驟S1繼續攪拌36分鐘。優選地，所述步驟S1靜置3小時。優選地，所述步驟S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為7％的碳酸鈉溶液。優選地，所述步驟S2調節培養基的pH至7.3。優選地，所述步驟S2滅菌溫度為121℃。優選地，所述步驟S2滅菌時間為18分鐘。本發明提供的干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，加入的添加劑包括人血白蛋白、轉鐵蛋白、胰高血糖素和活性炭等。在本發明的各種培養基的成分中，基礎培養基能夠提供干細胞的生存和最低的生理活動。在本發明中，轉鐵蛋白能夠調節體內鐵元素的代謝，通過細胞表面的轉鐵蛋白受體將鐵元素轉移到細胞內；同時，它還可以與其他微量元素結合，從而調節干細胞的生長增殖與功能表達。在本發明中，人血白蛋白主要用作滲透壓調節劑、生長因子的運載體、穩定劑和自由基清除劑以及營養劑等。在本發明中，胰高血糖素參與干細胞的糖代謝、脂類代謝等，能調節干細胞的增殖與功能表達。在本發明培養基中使用的活性炭，能夠吸附干細胞生長中代謝的有毒物質，但是，活性炭在吸附培養基中的有害物質的同時，也能吸附生長調節物質和其它培養基中的成分，發明人在使用活性炭時，考慮到活性炭的兩面性，經大量實驗，得到合適的活性炭與培養基中生長調節物質的配比，使其都能更好的發揮作用。在本發明中，成纖維細胞生長因子和表皮生長因子主要作為維持干細胞體外培養生存、增殖和分化所需的補充因子。在本發明中，亞油酸能夠提供細胞膜合成所需的脂質。在本發明中，昆布氨酸能夠促進干細胞的粘附，及其貼壁生長。在本發明中，腺苷脫氨酶能夠加速細胞代謝。在本發明中，肉豆蔻酸能夠促進干細胞的生長。研究發現，在干細胞培養基中加入桔梗皂苷D和槲皮素，這兩種成分能與其他成分間相互作用，使干細胞的擴增速度得到進一步的提高。本發明干細胞培養基搭配合理，各成分間相互協調，共同作用，提高了干細胞擴增速度，大大縮短了干細胞培養的時間。與現有技術相比，本發明提供的干細胞培養基具有以下優勢：(1)本發明提供的干細胞培養基能快速擴增干細胞，大大縮短了干細胞培養的時間。(2)本發明提供的干細胞培養基不含血清，排除了動物來源的病原體污染。(3)本發明提供的是一種無動物源性成分、成分確定的干細胞培養基，可以有效保證產品批次的質量穩定性，有利于產品標準化。具體實施方式以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。本發明中DMEM培養基可購自Sigma公司，F12培養基可購自Sigma公司，槲皮素可購自上海譜振生物有限公司，。實施例1、一種干細胞培養基所述干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，如表1所示。表1：添加在基礎培養基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白1mg/mL轉鐵蛋白8μg/mL胰高血糖素0.12μg/mL活性炭2.5μg/mL成纖維細胞生長因子13ng/mL表皮生長因子7ng/mL亞油酸3μM槲皮素5μg/mL桔梗皂苷D20μg/mL昆布氨酸2mg/mL腺苷脫氨酶3μg/mL肉豆蔻酸1.2μM所述基礎培養基為DMEM培養基。制備方法：S1向基礎培養基中加入人血白蛋白、轉鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌25分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續攪拌30分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置2小時，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為6％的碳酸鈉溶液，調節培養基的pH至7.2，滅菌溫度為118℃，滅菌時間為16分鐘，即得。實施例2、一種干細胞培養基所述干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，如表2所示。表2：添加在基礎培養基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白3mg/mL轉鐵蛋白13μg/mL胰高血糖素0.15μg/mL活性炭3μg/mL成纖維細胞生長因子18ng/mL表皮生長因子11ng/mL亞油酸6μM槲皮素9μg/mL桔梗皂苷D25μg/mL昆布氨酸5mg/mL腺苷脫氨酶7μg/mL肉豆蔻酸1.6μM所述基礎培養基為F12培養基。制備方法：S1向基礎培養基中加入人血白蛋白、轉鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌35分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續攪拌40分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置4小時，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為8％的碳酸鈉溶液，調節培養基的pH至7.4，滅菌溫度為123℃，滅菌時間為20分鐘，即得。實施例3、一種干細胞培養基所述干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，如表3所示。表3：添加在基礎培養基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白2mg/mL轉鐵蛋白10μg/mL胰高血糖素0.14μg/mL活性炭2.8μg/mL成纖維細胞生長因子15ng/mL表皮生長因子9ng/mL亞油酸5μM槲皮素6μg/mL桔梗皂苷D23μg/mL昆布氨酸4mg/mL腺苷脫氨酶5μg/mL肉豆蔻酸1.4μM所述基礎培養基為F12培養基。制備方法：S1向基礎培養基中加入人血白蛋白、轉鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌30分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續攪拌36分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置3小時，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質量分數為7％的碳酸鈉溶液，調節培養基的pH至7.3，滅菌溫度為121℃，滅菌時間為18分鐘，即得。對比例1、一種干細胞培養基所述干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，如表4所示。表4：添加在基礎培養基中的添加劑的終濃度所述基礎培養基為F12培養基。制備方法與實施例3類似。與實施例3的區別在于，將桔梗皂苷D替換為人參皂苷。對比例2、一種干細胞培養基所述干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，如表5所示。表5：添加在基礎培養基中的添加劑的終濃度所述基礎培養基為F12培養基。制備方法與實施例3類似。與實施例3的區別在于，將槲皮素替換為黃芩素。對比例3、一種干細胞培養基所述干細胞培養基包括基礎培養基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，如表6所示。表6：添加在基礎培養基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白2mg/mL轉鐵蛋白10μg/mL胰高血糖素1.47μg/mL活性炭1.47μg/mL成纖維細胞生長因子15ng/mL表皮生長因子9ng/mL亞油酸5μM槲皮素6μg/mL桔梗皂苷D23μg/mL昆布氨酸4mg/mL腺苷脫氨酶5μg/mL肉豆蔻酸1.4μM所述基礎培養基為F12培養基。制備方法與實施例3類似。與實施例3的區別在于，將胰高血糖素和活性炭的終濃度均調整為1.47μg/mL。試驗例一、本發明干細胞培養基對干細胞生長的影響1、試驗對象：本發明實施例1-3所得干細胞培養基，以及對比例1-3所得干細胞培養基。2、試驗方法：用無菌針管從臀上方吸取深層脂肪組織20mL，在1h內將其移至離心管內，加入等量PBS緩沖液，充分振蕩后800r/min離心10分鐘，反復沖洗3次后加入等量15g/LⅠ型膠原酶，37℃水浴中充分振蕩30分鐘。800r/min離心10分鐘后棄去上清。將下層細胞用PBS懸浮后加入16mmol/LNH4Cl37℃水浴中10min以裂解紅細胞。800r/min離心10分鐘后，再用PBS沖洗3次。最后，將細胞分別用本發明本發明實施例1-3所得干細胞培養基，以及對比例1-3所得干細胞培養基懸浮后移入培養瓶中，37℃，50mL/LCO2培養箱中孵育。在培養開始，及第7天、14天、21天和28天時，分別計算細胞總數。結果如表7所示。表7：干細胞在不同培養基中擴增倍數培養基7天14天21天28天實施例1156.3±24.51371.6±48.56567.2±42.411236.1±77.3實施例2157.8±25.61370.6±42.86464.7±55.411238.5±81.3實施例3161.9±25.31374.5±41.76472.6±58.311244.2±83.3對比例151.2±14.7742.3±26.83825.6±45.16132.8±52.5對比例252.7±15.2752.1±25.73886.2±43.56242.9±50.6對比例352.5±14.5756.4±23.23873.5±44.86253.4±51.2由表7可以看出，在相同的培養時間內，生長在本發明實施例1-3所得干細胞培養基中細胞的擴增倍數，明顯大于生長在對比例1-3所得干細胞培養基中細胞的擴增倍數。這說明，本發明干細胞培養基的擴增效果好。當前第1頁1 2 3