專利名稱：含昆蟲病毒增效蛋白的化學農藥及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及化學農藥殺蟲劑及復合殺蟲劑，更具體涉及一種含昆蟲病毒增效蛋白的化學農藥，本發明還涉及昆蟲病毒增效蛋白在化學農藥殺蟲劑和復合殺蟲劑中的應用。
背景技術：
1956年，Tanada等首次從美洲一星粘蟲顆粒體病毒(Pseudaletia unipunctagranulosis virus，PuGV)分離出增效蛋白，并證實該蛋白對美洲粘蟲核型多角體病毒(Pseudaletia unipuncta nuclear polyhedrosis virus，PuNPV)具有增強感染的作用(Tanada Y et al.，J Invertebr Pathol，1959，1215-231)。Hashimoto(HashimotoY et al.，J Gen Virol，1991，722645-2651)和Roelvink(Roelvink P W et al.，J GenVirol，1995，762693-2705)分別對粉紋夜蛾顆粒體病毒(Trichoplusia ni granulosisvirus，TnGV)、PuGV、棉鈴蟲顆粒體病毒(Heliothis armigera granulosis virus，HaGV)增效蛋白基因進行了克隆和序列分析，比較了它們的同源性。目前，已在9種顆粒體病毒、舞毒蛾核型多角體病毒(Lymantria dispar nuclear polyhedrosisvirus，LdNPV)和4種痘病毒中發現了昆蟲病毒增效蛋白(Hayakawa T et al.，Gene，1996，177269-270)。
昆蟲病毒增效蛋白是病毒基因編碼的一種金屬蛋白酶，分子量為89-110kDa，具有一個典型的金屬蛋白酶鋅-結合域HEXXH，位置十分保守，且對中腸圍食膜的降解作用受到金屬螯合劑的抑制(Lepore L S et al.，Invertebr Pathol，1996，68131-140)。
昆蟲病毒增效蛋白能提高昆蟲的敏感性，加速核型多角體病毒的感染進程(Tanada Y et al.，Insect Pathol，1959，1215-231)，同時能提高蘇云金桿菌伴孢晶體對幼蟲的毒力(Corsaro B G et al.，A parasites and pathogens of insectsII.Pathogens.San DiegoAcademic Press，1993.127-145)。昆蟲病毒增效蛋白的作用機制有兩種一種是增效蛋白能與中腸細胞膜上的特異位點結合，介導病毒囊膜與細胞質膜之間的融合，促進病毒進入宿主細胞內，從而增加病毒感染的效果。但增效蛋白與中腸細胞膜上的特異位點結合并不是增進病毒感染所必需的。另一種機制是增效蛋白通過降解腸粘蛋白IIM而破壞昆蟲幼蟲中腸圍食膜，使病毒粒子更容易進入中腸細胞，同時提高了某些必須穿透圍食膜而發生作用的生物殺蟲劑的效能(Wang P et al.，Natl Acad Sci USA，1997，946977-6982)。
目前，獲得昆蟲病毒增效蛋白的方式有以下幾種(1)從顆粒體病毒、核型多角體和痘病毒中分離純化獲得增效蛋白。(2)將增效蛋白基因重組在AcMNPV等廣譜MNPV中，構建廣譜高效的重組病毒。含增效蛋白基因的重組AcMNPV比野生型AcMNPV的感染能力略低，但當與野生型AcMNPV適當比例混合時，則其感染能力高于野生型病毒。(3)構建含增效蛋白基因的轉基因植物，提高害蟲對昆蟲病毒的敏感。(4)在原核細胞和真核細胞中表達增效蛋白。
世界農業面臨每年增加7000萬人口的巨大壓力，而耕地是有限的。化學農藥在農業發展、有害生物綜合治理和農業可持續發展中發揮了巨大作用，是現代農業必需的生產資料。在提高現有耕地的質量和單位面積產量的情況下，用化學農藥來防治蟲害對農業生產的危害，避免損失，是非常重要的措施。化學農藥具有高效、速效、使用方便、適應性廣等優點。但是，目前使用的化學農藥大多是人工合成的有毒的化學物質。由于化學農藥長期大量地、廣泛地、連續地、不合理使用，導致了一系列嚴重后果。一方面導致害蟲抗藥性日趨嚴重，用藥量越來越大，形成惡性循環。另一方面，過量地使用化學農藥，造成大量天敵被殺傷，有益生物種類減少，次要害蟲暴發，破壞了生態平衡。特別是農藥污染了環境，大氣、土壤和水源被污染，農藥在農副產品中的殘留量增加，嚴重超標，愈來愈大地危害了人類身體健康，并且造成了很大的經濟損失。
目前，世界各國從法規上對化學農藥的使用、生產和開發提出了一系列規定，實行了農藥注冊登記制度。化學農藥的發展趨勢包括(1)降低化學農藥的用量，提高原藥固有的活性及其使用效率和使用效果。(2)減小化學農藥對非靶標生物和生態環境的負面影響。(3)改善化學農藥與環境的相容性。(4)提高化學農藥對人、畜和作物的安全性。其中，減少化學農藥的使用量，在世界各發達國家中的呼聲日趨高漲，世界各國均制定了嚴格限制生產和使用的管理法規。
發明內容
本發明的目的在于提供一種含昆蟲病毒增效蛋白的化學農藥，利用昆蟲病毒增效蛋白和化學農藥或化學農藥復合劑復配，降低了化學農藥的有效含量，提高化學農藥殺蟲活性，增加了藥效，提高了化學農藥的生防效率。
本發明還涉及昆蟲病毒增效蛋白在化學農藥殺蟲劑中的應用。
本發明還涉及昆蟲病毒增效蛋白在復合殺蟲劑中的應用。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施通過凝膠過濾和離子交換等生化技術，利用純化的昆蟲病毒多角體分離純化獲得昆蟲病毒增效蛋白，或者利用基因工程構建工程菌株，表達，純化獲得昆蟲病毒增效蛋白。以昆蟲病毒增效蛋白作為增效中間體，按一定比例與化學農藥混配。其特征是昆蟲病毒增效蛋白終濃度為1-3×1020μg/L與化學農藥混配。用昆蟲病毒增效蛋白和化學農藥或化學農藥復合劑復配，用于化學農藥或化學農藥復合劑的制備，應用于生物防治。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果①大幅度降低了化學農藥的有效成分用量，增加了藥效，提高了化學農藥的生防效率；②大幅度降低了化學農藥的殘留，增效蛋白對人畜安全，對作物安全，不污染環境，并可使化學農藥的殘留相對大幅度降低；③降低或消除害蟲對化學農藥的抗藥性。
具體實施例方式
1、昆蟲病毒基因工程增效蛋白的制備挑取含有昆蟲桿狀病毒增效蛋白基因的工程菌株，如E.coliM15(pQE-TnGVEn Cp96)、E.coli M15(pQE-TnGVNp85)、E.coliM15(pQE-TnGVCp80)、E.coli M15(pQE-TnGV-Enp108)等單菌落于含100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的25ml LB培養基中，37℃，200rpm過夜培養。活化菌液以1∶20接種含100μg氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的500ml LB培養液中，繼續培養，當其濃度OD600＝0.3時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度1mmol/L，37℃誘導5h，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀。
在細菌沉淀中加入2-5倍體積的超聲波處理液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0-0.1mol/L NaCl-2mg/ml溶菌酶)，反復凍融3次，37℃，保溫1h，然后置于冰中用超聲波破碎細菌。置于光學顯微鏡高倍物鏡觀察，有大量晶體。處理液上30-60％蔗糖梯度，4000rpm離心40min，取出包涵體帶，用滅菌雙蒸水洗3次，收獲純化的增效蛋白晶體，4℃保存。
2、增效蛋白的鑒定采用SDS-PAGE電泳分析。
(1)上樣和電泳參照Sambrook“分子克隆手冊”，制備10％分離膠和濃縮膠。在樣品中加等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃加熱3-5min變性。樣品上樣。以100V電泳至溴酚蘭進入分離膠，提高電壓至150V，當溴酚蘭到達底部前約1cm處結束電泳。
(2)固定、染色和脫色剝膠后以5倍體積染色液固定、染色過夜，收凝膠浸泡于脫色液中平緩搖動4h以上，其間更換脫色液4-5次。
(3)結果分析脫色完全后即可觀察照像，并用激光掃描確定增效蛋白的純度和含量。
3、粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108對卡死克的增效作用卡死克(Cascade)的有效成分是fulfenoxuron，是一種昆蟲生長調節劑，通過阻止幼蟲蛻皮而殺螨殺蟲，同時可影響成蟲產卵率及卵孵化率。卡死克具有觸殺及滯留性殺蟲作用，對多種害蟲，如菜青蟲、小菜蛾、甜菜夜蛾、紅蜘蛛、棉鈴蟲等均有防治作用。
在5％卡死克可分散劑中，按200μg/L加入粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108，配成混劑。用倍比稀釋法將上述混劑和5％卡死克單劑配成若干濃度梯度，即稀釋倍數為1,000-64,000倍。取3齡初甜菜夜蛾幼蟲室溫下單頭飼養于24孔Costar細胞培養皿中。分別用各稀釋度感染液制成感染飼料，每個稀釋度樣品感染供試甜菜夜蛾三齡幼蟲96頭，并設單蒸水對照。每孔加適量人工飼料，并加30μl上述各種處理液于人工飼料表面，使其充分吸收。48h統計死亡和存活蟲數，采用DPS進行數據處理。結果表明粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108提高了卡死克對甜菜夜蛾的毒力，增效系數為178。
4、昆蟲病毒增效蛋白P108對“來福靈”合成除蟲菊酯類殺蟲劑的增效作用“來福靈”合成除蟲菊酯類殺蟲劑(5％乳油)是日本住友化學工業株式會社研究開發的具有高度殺蟲效力的合成除蟲菊酯類殺蟲劑。對多種作物上的害蟲，如棉鈴蟲、菜青蟲、桃小食心蟲、蚜蟲等具有強烈的殺蟲效果而且殘效時間長。
在5％“來福靈”合成除蟲菊酯類乳油中，按180μg/L加入粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108，配成混劑。用倍比稀釋法將上述混劑和5％卡死克單劑配成若干濃度梯度，即稀釋倍數為2500-64000倍。取3齡初甜菜夜蛾幼蟲室溫下單頭飼養于24孔Costar細胞培養皿中。分別用各稀釋度感染液制成感染飼料，每個稀釋度樣品感染供試甜菜夜蛾三齡幼蟲96頭，并設單蒸水對照。每孔加適量人工飼料，并加30μl上述各種處理液于人工飼料表面，使其充分吸收。48h統計死亡和存活蟲數，采用DPS進行數據處理。結果表明粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108提高了5％“來福靈”合成除蟲菊酯類乳油對甜菜夜蛾的毒力，增效系數為250。
5、昆蟲病毒增效蛋白P108對抑太保殺蟲劑的增效作用在5％抑太保可分散劑中，按160μg/L加入粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108，配成混劑。用倍比稀釋法將上述混劑和5％卡死克單劑配成若干濃度梯度，即稀釋倍數為1,000-64,000倍。取3齡初甜菜夜蛾幼蟲室溫下單頭飼養于24孔Costar細胞培養皿中。分別用各稀釋度感染液制成感染飼料，每個稀釋度樣品感染供試甜菜夜蛾三齡幼蟲96頭，并設單蒸水對照。每孔加適量人工飼料，并加30μl上述各種處理液于人工飼料表面，使其充分吸收。48h統計死亡和存活蟲數，采用DPS進行數據處理。結果表明粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108提高了抑太保對甜菜夜蛾的毒力，增效系數為671。
6、昆蟲病毒增效蛋白P108對米滿殺蟲劑的增效作用在20％米滿可分散劑中，240μg/L加入粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108，配成混劑。用倍比稀釋法將上述混劑和20％米滿單劑配成若干濃度梯度，即稀釋倍數為2,000-64,000倍。取3齡初甜菜夜蛾幼蟲室溫下單頭飼養于24孔Costar細胞培養皿中。分別用各稀釋度感染液制成感染飼料，每個稀釋度樣品感染供試甜菜夜蛾三齡幼蟲96頭，并設單蒸水對照。每孔加適量人工飼料，并加30μl上述各種處理液于人工飼料表面，使其充分吸收。48h統計死亡和存活蟲數，采用DPS進行數據處理。結果表明粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白P108提高了米滿對甜菜夜蛾的毒力，增效系數為472。
權利要求
1.一種含昆蟲病毒增效蛋白的化學農藥，其特征在于昆蟲病毒增效蛋白終濃度1-3×1020μg/L與化學農藥混配。
2.根據權利要求1所述的一種含昆蟲病毒增效蛋白的化學農藥，其特征在于化學農藥包括有機磷、菊酯類、氨基甲酸酯、有機氮和昆蟲生長發育激素類。
3.根據權利要求1所述的昆蟲病毒增效蛋白在化學農藥殺蟲劑中的應用。
4.根據權利要求1所述的昆蟲病毒增效蛋白在復合殺蟲劑中的應用。
5.根據權利要求1所述的昆蟲病毒增效蛋白，其特征在于利用純化的昆蟲病毒多角體，分離純化獲得昆蟲病毒增效蛋白或利用基因工程構建工程菌株，表達、純化獲得昆蟲病毒增效蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種含昆蟲病毒增效蛋白的化學農藥及應用，其特征在于昆蟲病毒增效蛋白與化學農藥混配，昆蟲病毒增效蛋白在化學農藥殺蟲劑和復合殺蟲劑中的應用。利用純化的昆蟲病毒多角體，分離純化獲得昆蟲病毒增效蛋白；或者采用基因工程方法，表達和純化昆蟲病毒增效蛋白。本發明提高了化學農藥的生防效率，降低了化學農藥的有效含量，增加了藥效，提高了防治效果，降低或消除蟲對化學農藥的抗藥性。昆蟲病毒增效蛋白對人畜安全，對作物安全，不污染環境。
文檔編號A01N63/00GK1401246SQ0213903
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月12日 優先權日2002年9月12日
發明者孟小林, 徐進平, 王健, 魯偉 申請人:武漢大學