專利名稱：培育轉基因斑馬魚的方法及其專用質粒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培育轉基因魚的方法及其專用質粒，特別涉及一種培育轉基因斑馬魚的方法及其專用質粒，尤其涉及一種培育apoaequorin轉基因斑馬魚的方法及其專用質粒。
背景技術：
鈣離子被看作細胞中的第二信使，在細胞，組織器官間傳遞重要信號，介導機體內部和外部環境間的通訊，通過調控鈣敏轉錄因子基因的表達而協調生物個體的正常發育、行使功能。
Apoaequorin是水母中發現的一種發光蛋白(E14215.1 GI5708898 in Genbank)，它與一種輔助因子coelenterazine結合成aequorin，aequorin與鈣離子結合后能夠自動分解產生coelenteramide，apoaequorin，二氧化碳和一種藍色熒光。通過顯微成像設備可以把這種光信號放大并記錄下來。因此aequorin可以作為鈣離子受體來檢測鈣離子濃度及變化。現在比較成熟的方法是將apoaequorin和coelenterazine直接注射到待研究的活細胞或者受精卵中，通過光子顯像設備來檢測鈣離子信號。但是隨著細胞分離，子細胞中的apoaequorin和coelenterazine會越來越少，可檢測的鈣信號會越來越弱。
轉基因技術可以把一個外源基因轉入宿主基因組中，而且使轉入的外源基因在宿主細胞內可以像宿主的內源性基因一樣進行表達。斑馬魚是用于基因轉移的理想脊椎動物材料。一般來講，比較成熟的轉基因技術有線性化的重組質粒的顯微注射和帶有外源基因的反轉錄病毒的侵染。這兩種方法都勝任于獲得一定數量的轉基因斑馬魚種系，其中前者比較簡單易行。
基因的表達主要受到基因的上游或內含子的順式作用元件(如啟動子，增強子等)的調控，外源基因在轉基因動物中的表達同樣是這樣，其表達情況受到構建于表達載體中的啟動子的控制。
發明創造內容本發明的目的是提供一種培育可以穩定表達apoaequorin的轉基因斑馬魚的方法。
一種培育apoaequorin轉基因斑馬魚的方法，包括以下步驟(1)構建apoaequorin重組表達載體，所述apoaequorin重組表達載體包含apoaequorin編碼基因、斑馬魚的actin調控序列和由非洲爪蟾EF-1α基因調控序列引導的GFP表達框；(2)用步驟(1)中的重組表達載體轉化斑馬魚受精卵，得到F0代；(3)將F0代與野生型的斑馬魚交配，得到可表達apoaequorin的轉基因斑馬魚。其中，步驟(3)中得到的轉基因斑馬魚可通過傳統的育種方法得到轉基因斑馬魚的純合體。apoaequorin重組表達載體可通過將apoaequorin編碼基因、斑馬魚的actin調控序列(Shin-ichi H.，Hitoshi O.，Naoto U.，Yoshiki H.，Goro E..High-frequency generation of trasgenic zebrafish which reliably express GFPin whole muscles or the whloe body by using promoters of zebrafish origin.Developmental Biology.192，289-299.)、非洲爪蟾EF-1α基因(XEX)調控序列(Johnson A.D.，Krieg P.A..(1995).A Xenopus laevis gene encoding EF-1 alphaS，the somatic form of elongation factor l alphasequence，structure，andidentification of regulatory elements required for embryonic transcription.Dev Genet.17(3)，280-90.)和GFP表達框(Amsterdam A.，Lin S.，Hopkins N..(1995).The Aequorea victoria green fluorescent protein can be used as areporter in live zebrafish embryos.Dev Biol.171(1)，123-9.)插入載體pGEM-7Zf(-)(X65311.2 GI6687355 in the Genbank)中而得到。apoaequorin重組表達載體可通過多種方法導入斑馬魚受精卵，如顯微注射法、原生質體融合法、高壓電穿孔法等，優選為顯微注射法。
本發明針對隨著細胞分離子細胞中的apoaequorin和coelenterazine會越來越少的問題，通過基因重組的方法培育出apoaequorin轉基因斑馬魚，可以穩定表達apoaequorin。本發明的apoaequorin重組表達載體中包含actin啟動子，制備出的轉基因斑馬魚分別在肌肉和神經系統表達apoaequorin。為了便于鑒定apoaequorin轉基因斑馬魚，每個表達載體上都包含由XEX調控序列引導的GFP表達框，在成功的轉基因斑馬魚中可觀察到全身性表達的綠色熒光。
本發明的apoaequorin轉基因斑馬魚將在生物發育研究、斑馬魚活體鈣像研究中起到重要的作用，具有重要的理論意義和實際意義。本發明的apoaequorin轉基因斑馬魚能夠在特定的組織器官和特定的發育時期大量合成apoaequorin，能夠用于在活體細胞、器官、甚至個體整體水平上對鈣信號(鈣像)的研究，以闡明鈣信號在發育、生長等過程中的作用。本發明的apoaequorin轉基因斑馬魚與既有的突變體斑馬魚通過遺傳育種，可以得到有關特定基因突變和鈣信號異常的關系，在遺傳疾病的機理闡述和治療上有重要的意義。
圖1為可表達apoaequorin的重組表達載體圖2為含actin啟動子的apoaequorin轉基因斑馬魚的原位雜交結果圖3為含actin啟動子的apoaequorin轉基因斑馬魚GFP的表達照片具體實施方式
實施例1、培育表達apoaequorin轉基因斑馬魚培育表達apoaequorin轉基因斑馬魚的方法，包括以下步驟(1)構建可表達apoaequorin的重組載體將克隆得到的polyA(pA)和apoaequorin編碼區片段插入到載體pGEM-7Zf(-)中，得到質粒pGEM-Aeq-pA。用XhoI和BamHI消化質粒pBKS-Act，得到約actin啟動子片段；用XhoI和SacI消化質粒pBKS-GM2，得到約1.6kb的XEX-GM2-pA片段；用BamHI和SacI消化質粒pGEM-Aeq-pA，得到約3.9kb的片段；連接這三個片段，得到重組載體pAct-Aeq-xGM2。
所構建可表達apoaequorin的重組表達載體pAct-Aeq-xGM2如圖1所示，包含斑馬魚的actin調控序列，還包含一個由非洲爪蟾EF-1α基因(XEX)調控序列引導的GFP表達框，用于篩選轉基因斑馬魚。
(2)重組表達載體pAct-Aeq-xGM2轉化斑馬魚受精卵顯微注射線性化的重組質粒pAct-Aeq-xGM2到斑馬魚受精卵中，喂養至性成熟，得到F0代。
(3)轉基因斑馬魚的獲得將F0代與野生型的斑馬魚交配，通過觀察其子代胚胎F1代是否有GFP表達來鑒定出GFP陽性的F1代，結果如圖3所示，得到全身性表達GFP的陽性F1代，。再用地高辛標記的apoaequorin反義RNA探針(以apoaequorin為模板，按3’->5’方向體外轉錄得到的RNA序列)按常規方法做整胚原位雜交，檢查F1代胚胎的apoaequorin表達情況，結果如圖2所示，最終鑒定出表達apoaequorin的轉基因斑馬魚，圖中，黑色染色部位為體節。再通過傳統的育種方法得到轉基因斑馬魚的純合體。
權利要求
1.一種培育apoaequorin轉基因斑馬魚的方法，包括以下步驟(1)構建apoaequorin重組表達載體，所述apoaequorin重組表達載體包含apoaequorin編碼基因、斑馬魚的actin調控序列和由非洲爪蟾EF-1α基因調控序列引導的GFP表達框；(2)用步驟(1)中的重組表達載體轉化斑馬魚受精卵，得到F0代；(3)將F0代與野生型的斑馬魚交配，得到可表達apoaequorin的轉基因斑馬魚。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，將apoaequorin編碼基因、斑馬魚的actin調控序列和非洲爪蟾EF-1α基因調控序列插入到載體pGEM-7Zf(-)中，得到所述apoaequorin重組表達載體。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述apoaequorin重組表達載體通過顯微注射法、原生質體融合法或高壓電穿孔法導入斑馬魚受精卵，得到F0代。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述apoaequorin重組表達載體通過顯微注射法導入斑馬魚受精卵，得到F0代。
5.一種培育apoaequorin轉基因斑馬魚的質粒，它包含apoaequorin編碼基因、斑馬魚的actin調控序列和由非洲爪蟾EF-1α基因調控序列引導的GFP表達框。
6.根據權利要求5所述的質粒，其特征在于所述質粒為pAct-Aeq-xGM2。
全文摘要
本發明公開了一種培育轉基因斑馬魚的方法及其專用質粒，本發明培育轉基因斑馬魚的方法，包括以下步驟(1)構建apoaequorin重組表達載體，所述apoaequorin重組表達載體包含apoaequorin編碼基因、斑馬魚的actin調控序列和由非洲爪蟾EF－1α基因調控序列引導的GFP表達框；(2)用步驟(1)中的重組表達載體轉化斑馬魚受精卵，得到F0代；(3)將F0代與野生型的斑馬魚交配，得到可表達apoaequorin的轉基因斑馬魚。本發明的apoaequorin轉基因斑馬魚將在生物發育研究、斑馬魚活體鈣像研究等方面中起到重要的作用，具有重要的理論意義和實際意義。
文檔編號A01K67/027GK1607251SQ200310100450
公開日2005年4月20日 申請日期2003年10月16日 優先權日2003年10月16日
發明者孟安明, 蘇穎, 趙知行, 黃慧哲 申請人:清華大學