一種建立早熟禾遺傳轉化體系的方法及應用的制作方法

專利名稱：一種建立早熟禾遺傳轉化體系的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種早熟禾遺傳轉化體系的方法及應用，屬于農業生物技術領域或植物基因工程領域。
背景技術：
草地早熟禾(Poa pratensis L.)屬冷季型草坪草，是溫帶地區重要的草種之一。由于它具有色美、抗寒能力強、耐蔭、耐修剪等優點，在我國北方地區多被用作建坪草種之一。草地早熟禾亦有自身的缺點，如易受病蟲危害，不耐炎熱，耐高低溫能力差，抗旱力不強等。這些性狀在一定程度上都可以通過基因轉化的手段得到改良。成功的基因轉化首先依賴于良好的植物受體系統的建立。1985年，Vasil在國際草原學大會上第一次提出利用遺傳轉化技術將其他來源的特定基因導入牧草的可行性，為應用基因工程技術改良牧草，包括提高產量和利用率、增加牧草的抗逆性等奠定了理論基礎。通過基因工程技術培育出各種優質高產的牧草和草坪草新品種，對促進無污染綠色養殖業和綠色畜產品的發展以及我國西部地區生態環境建設都會產生深遠的影響。
早熟禾遺傳轉化體系建立的難度較大，主要是由于已有的早熟禾組織培養和植株再生體系不能滿足轉基因的需要。草地早熟禾的組織培養，國內外主要集中于愈傷組織誘導及其分化方面。早在1984年，McDonnel等以早熟禾(Kentucky bluegrass)成熟胚為外植體，誘導出愈傷組織并再生植株。1986年，Boyd等也報道了以早熟禾成熟胚為材料誘導愈傷組織和植株再生的工作。1988年，Van der Valk等報道了以早熟禾花序為外植體誘導植株再生和以成熟胚為材料誘導愈傷組織的工作。同年，Van der Valk等還報道了建立草地早熟禾的原生質體懸浮培養體系并獲得白化苗工作。1989年，Van der Valk等報道了以花序和成熟種子為外植體建立草地早熟禾再生體系，發現花序比成熟種子更易于形成胚性愈傷組織。1991年，Van Ark等也報道了早熟禾成熟胚培養及愈傷組織誘導等工作。1993年，Nielsen等從早熟禾的胚性懸浮細胞再生出綠色植株。1994年，朱根發等以草地早熟禾胚軸及幼穗為外植體，研究了其培養條件和分化能力，發現草地早熟禾成熟胚愈傷組織的胚胎發生能力很差，胚軸也很難誘導出具較高分化能力的愈傷組織，二者均不是理想的外植體；而從幼穗中可以誘導出胚性愈傷組織。1995年，Van derValk等以成熟種子為外植體誘導愈傷組織，發現含有6-BA(6-芐基嘌呤) 的培養基的誘導頻率要高于不含6-BA的，不同品種間的誘導率相差很大，通過混合使用2，4-D(2，4--二氯苯氧乙酸)和6-BA可大幅度提高體細胞胚和植株的再生率。同年，Griffia等報道了從早熟禾種子產生的愈傷組織可高頻率再生植株，但愈傷組織經過繼代培養后植株再生頻率迅速下降。1996年，Ke等報道了早熟禾盾片培養再生植株的工作。2003年，佘建明等報道了在繼代培養中，早代選擇外表呈干燥、緊密、顆粒狀的愈傷組織能有效地克服隨著繼代培養時間的延長愈傷組織再生植株的能力顯著下降這一障礙。朱根發等人工作中以幼穗為外植體雖誘導率能達到100％(朱根發等，1994)，但由于取材受季節限制，所以很多人仍采用種子胚為外植體誘導愈傷組織。由于草地早熟禾成熟胚的愈傷組織分化頻率偏低和胚性愈傷組織難于繼代培養等原因，從而影響了草地早熟禾轉基因工作的開展。直到1999年，馬忠華等以早熟禾成熟種子為外植體，初步建立了早熟禾的基因轉化體系，獲得了轉抗生素抗性基因的植株。相對于其它植物的遺傳轉化研究，早熟禾轉基因工作仍處在探索階段。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明以草地早熟禾的種子苗莖尖為試驗材料，誘導其基部愈傷化膨大，切取膨大組織，放在繼代及成叢培養基上誘導發生叢生芽，叢生芽在繼代及成叢培養基上持續增生，提供轉基因的受體材料。采用基因槍轟擊法或農桿菌介導法將外源基因導入受體細胞，經選擇獲得轉化細胞及植株。在此基礎上，確立了在農桿菌介導的遺傳轉化中，采用表面活性劑Silwet L-77處理和減壓處理有效提高了轉化頻率，從而建立起一個高效的基因型制約小的早熟禾轉基因技術體系。
本發明中，莖尖是指十到幾十微米的莖尖分生組織(shoot meristem)和大到幾十毫米的莖端(shoot tip)；而莖尖分生組織是指頂端生長錐及其鄰近的葉原基。叢生小芽是指離體培養莖尖基部膨大組織在繼代培養基上產生的叢生小芽及其繼代培養物。叢生芽塊是指離體培養的叢生小芽和未組織化的分裂細胞構成的組織塊及其繼代培養物。
本發明中，轉基因受體是指莖尖離體培養產生的叢生芽塊及其擴增和繼代培養物。
本發明中，農桿菌(Agrobacterium，包括A.tumefaciens和A.rhizogenes)介導的遺傳轉化程序基本上同石田(Ishida，1996)等報道的。在轉染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚類化合物、表面活性劑Silwet L-77(濃度為0-0.3％)和中性單糖(葡萄糖、木糖)，叢生芽塊放在懸浮農桿菌的轉染液中，在0.95-0.10個大氣壓(0.95×105Pa-1×104pa)下浸染3-18分鐘，然后在培養基上共培養2-15天。轉化體在含有適宜抗生素的培養基上抑菌，在加有合適濃度選擇劑的培養基上篩選，然后在繼代及成叢培養基上分化小苗。
本發明中，基因槍轟擊法(particle bomrdment；microprojectile；biolistics；particle gun)是籍高速度的金屬微粒將核酸分子引入活細胞中的一種遺傳轉化技術。最初是美國康乃爾大學薩伏特(Sanford)等研制成功的火藥基因槍及轉化技術，此后有不同學者研制出的多種基因槍及不斷改進的轉化技術。本發明研究中所用的基因槍為美國Bio-RAD公司產品，型號為Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System，按使用說明書操作。轟擊參數為可裂圓片與載體的距離為2.5厘米，載體與阻擋網的距離為0.8厘米，氦氣壓力為1100psi，真空度28inchHg，微彈飛行距離在3-9厘米間取值。
本發明中，基本培養基及植物生長調節物質熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅菌，在培養基滅菌后加入。本發明中所用培養基有基本培養基為改良MS培養基(KNO31900mgL-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，FeSO4·7H2O27.8mgL-1，ZnSO4·7H2O 10mgL-1，MnSO4·4H2O 22.3mgL-1，H3BO310mgL-1，KI0.83mgL-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mgL-1，CuSO4·5H2O 0.025mgL-1，CoCl2·6H2O 0.025mgL-1，鹽酸硫胺素10.0mgL-1，鹽酸吡哆醇1.0mgL-1，煙酸1.0mgL-1，甘氨酸2.0mgL-1，肌醇100.0mgL-1，生物素0.05mgL-1，酪蛋白水解物500mgL-1)，蔗糖30gL-1，瓊脂粉6.5gL-1，pH5.8-6.0。該培養基用于種子萌發。液體培養基則去掉瓊脂粉。
誘導培養基附加不同植物生長調節物質(激素)組合的基本培養基。對于多數早熟禾基因型而言，2，4-D濃度為0.01-1.0mg.L-1，6-芐基嘌呤(6-BA)或激動素或玉米素濃度0-5mg.L-1。采用固體培養基。最適的激素濃度因培養材料的基因型不同而在此范圍內變動。
繼代及成叢培養基固體培養基，基本培養基中加入不同組合的植物生長調節物質，2，4-D濃度一般為0-0.2mgL-1，6-BA或激動素或玉米素濃度為0-3mgL-1，因早熟禾基因型而變動。
生根培養基基本培養基加0.002-2.0mgL-1萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)或吲哚乙酸(IAA)，采用固體培養基，用于無根小苗生根或壯苗培養。最適的激素濃度因培養材料的基因型不同而在此范圍內變動。
本發明中，基部膨大誘導培養和叢生芽塊培養在20-27℃、500-1000Lx光照(14h/d)下進行。
本發明中，成叢率為繼代及成叢培養基上產生叢生芽的組織塊數與轉入的膨大基部組織塊數的比值，再乘以100。
本發明中，植物材料為早熟禾(Poa)，主要為經濟價值較大的草地早熟禾(Poapratensis L.)的不同品種，如獎品、新歌來得、橄欖球-A、午夜等。
本發明中，選擇劑包括除草劑(綠黃隆、草丁膦、草干膦等)、抗生素(潮霉素、卡那霉素等)。選擇劑抗性基因有除草劑抗性基因如als(突變的乙酰乳酸合成酶基因)、bar(基因)等，抗生素抗性基因如hpt(潮酶素磷酸轉移酶基因)、nptII(卡那霉素抗性基因)等。
本發明建立的早熟禾轉基因受體體系的方法及應用包括如下步驟①種子滅菌和萌發程序及技術，②莖尖培養及其基部愈傷化誘導和培養基(基本培養基、附加成分和激素組合)，③叢生芽發生、繼代培養和培養基(基本培養基、附加成分和激素組合)，④以叢生芽塊為受體進行遺傳轉化，包括轉化、恢復培養、(抑菌)和篩選程序及技術，⑤小苗生根和移栽技術，⑥轉基因植株分子檢測技術。
種子滅菌和萌發程序及技術是指種子用70％酒精滅菌1-5分鐘，0.2％升汞10-15分鐘，無菌水沖洗3-5次。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子播種在濕潤的無菌濾紙上，培養皿封口后放在黑暗或弱光條件下于20-28℃萌發。
莖尖培養及其基部愈傷化誘導技術是指種子萌發8-15天后，切取莖尖接種于誘導培養基上培養，誘導基部膨大。誘導培養在弱光下進行，一般需培養20天左右。
雖然莖尖基部出現膨大的頻率與誘導培養基中激素變化有關，但在一定范圍內，激素濃度對莖尖基部膨大率影響較小，一般為80-100％，但對轉入繼代及成叢培養基的膨大組織產生叢生芽影響較大。若誘導培養基中2，4-D為0.2mg.L-1、6-BA 2mg.L-1，多數基因型的膨大組織成叢率最高，獎品等品種可達75％，每叢芽數也最多，可達15-25個。
誘導基部膨大對光較敏感。在低2，4-D濃度(＜0.1mg.L-1)、光照強度＞1000Lx時易分化生根，不易分化成叢，光照弱時(500Lx)膨大較易，不易生根。在較合適的2，4-D濃度時，光強約1000Lx時生長良好(膨大組織為淡黃綠色)，比在500Lx(膨大組織偏向白色)時更易成叢，并且每叢芽數也較多。在高濃度2，4-D時，光照強弱對其影響不是很大，膨大均較大，不易生根，但成叢率低。此階段應在合適2，4-D濃度、光照較強下培養以利于以后成叢。
叢生芽發生及繼代培養技術是指待莖尖基部膨大后切下直徑1-3mm的膨大組織轉入繼代及成叢培養基上誘導叢生芽發生，一般需培養15-20天。形成叢生芽塊后轉入繼代及成叢培養基上進行增殖培養。在繼代培養中，可根據叢生芽塊愈傷化程度調整培養基濃度。若未組織化細胞增生旺盛，小芽發育差，適當降低培養基中的2，4-D濃度或提高6-BA等濃度；若未組織化細胞增生慢，小芽迅速發育成苗，適當升高培養基中的2，4-D濃度。
莖尖誘導培養20-25天時取基部膨大組織產生叢生芽的頻率最高，每叢芽數也最多，若誘導培養時間延長，成叢率下降，這可能是由于時間太長，部分組織不能吸收培養基中的營養，以致色澤暗淡，有些組織發褐，分化能力也降低。若誘導培養時間偏短，膨大組織產生叢生芽的頻率也較低，每叢芽數少，如正在誘導培養基上培養10天，每叢芽數只有1-3個，可能是由于生長點處組織愈傷化低，去分化的細胞太少所致。
不同基因型材料對激素的敏感程度不同，其中對2，4-D的反應差別較大，對獎品和新歌來得來說，當6-BA濃度為2mg.L-1時，0.2mg.L-12，4D濃度成叢率最高，每叢芽數最多。而橄欖球在2，4-D濃度為0.5mg.L-1時效果最好。對于大多數基因型而言，繼代及成叢培養基中的激素組合以0.05-0.10mg.L-12，4-D和2.0-3.0mg.L-16-BA為宜。當2，4-D濃度較高時，基部容易產生愈傷化組織，叢生芽發生能力低；當2，4-D濃度較低時，小苗易老化，產生新芽少。即使在最適激素濃度下繼代培養5次以上，小苗也變老、變粗，分化能力降低。若要保持早熟禾叢生芽旺盛增殖的狀態，可將這些叢生芽塊分成單芽或者2-3個小芽/塊接種于誘導培養基上誘導基部膨大，然后再轉入繼代及成叢培養基上誘導叢生芽發生。
在叢生芽塊繼代培養的的前5-8天，若光照強度＞1000Lx時，組織容易生根，不利于芽的分化，而一旦形成叢生芽后，光照強時促進分化。所以在繼代培養后的前5-8天，叢生芽塊在弱光(約500Lx)下培養，當長出幾個小芽后放于光照強度＞1000Lx下培養，每叢芽數可達15-25個。
小苗生根和移栽技術是指小苗在適宜激素組合的生根培養基上誘導生根。當根長2-3cm時，將小苗放在自然光下培養1-2天，然后去掉封口膜煉苗1-2天，于清晨或傍晚移栽入花盆(花盆下為壤土，上部為蛭石)中，每5天澆一次1/2基本培養基無機鹽溶液，隔天澆水一次。移栽苗生長溫度為15-25℃。
利用本發明建立的轉基因受體體系進行遺傳轉化的程序和方法(一)篩選劑濃度的確定將早熟禾叢生芽切成單芽接種于加有不同濃度篩選劑的繼代培養基(若篩選劑為抑制植物細胞某些氨基酸合成的除草劑，則培養基中去掉水解酪蛋白)上，每15天繼代培養一次，共繼代三代。在每種篩選培養基上接種小苗100-300株，通常取6-10個選擇劑濃度。濃度及濃度梯度因選擇劑種類和受體材料基因型不同而變化。連續篩選3代后統計小苗存活率。以未轉基因小苗接近全部死亡的選擇劑濃度為轉化細胞的篩選濃度。
(二)遺傳轉化可選用農桿菌中介法或基因槍轟擊法。
A、以農桿菌為中介進行遺傳轉化將帶有雙元載體(Mini-Ti質粒帶有植物選擇標記基因)的根瘤農桿菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培養基(每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0，熱壓滅菌)中28℃下震蕩培養，震蕩速率為170-180rpm(轉/分)，使細菌處于對數生長期(OD600＝0.4-0.6)。然后在3000rpm下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體基本培養基洗滌，再離心收集。再將菌體用1/2濃度的液體基本培養基懸浮，稀釋5-20倍，添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmolL-1和表面活性劑Silwet L-77(濃度為0-0.3％)后用于轉化。
將早熟禾叢生芽切至暴露出芽尖生長點，放入上述菌液中浸染并附以0.95-0.10個大氣壓(0.95×105Pa-1×104Pa)處理，浸染3-18分鐘。然后用無菌濾紙吸去菌液，將叢生芽塊轉入繼代及成叢培養基上共培養2-3天，再轉到加有抗生素頭孢霉素(Cefotaxime)250mgL-1或羧芐青霉素(Carb)500mgL-1的培養基上于黑暗中培養，抑制細菌生長。在抑菌培養基上叢生芽塊逐漸恢復生長，10-15天后再轉入含有選擇劑的篩選培養基上篩選，連續篩選3代，每代15-20天。
若用不同農桿菌菌株，適宜的轉化參數有明顯差異。選用LBA4404時，當菌液濃度OD600＝0.4-0.6，感染時間為4-6分鐘時，叢生芽塊在恢復培養中的存活率高，轉基因植株比例較高。
B、采用基因槍轟擊法轉化叢生芽塊1、DNA包裹微彈和基因槍轟擊1)、從宿主菌中提取帶有目標基因的質粒并進行純化，提取和純化采用標準程序及方法(參見《分子克隆》)。質粒質量為OD260/OD280在1.7-1.8之間。質粒DNA濃度稀釋為1μg/μl，于-20℃保存備用。
2)、稱取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一個Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇劇烈渦旋3-5分鐘，然后靜置15分鐘，室溫下15000rpm離心5秒后去除上清液。
3)、加1ml無菌水，劇烈渦旋1分鐘，靜置1分鐘，室溫下15000rpm離心5秒后去除上清液。此步驟重復3次。
4)、第三次洗滌后的金粉，加50μl 50％滅菌甘油(終濃度為60mg/ml微彈。該制備液室溫可貯存2周)。
5)、使用時渦旋5分鐘打破金粉凝集。
6)、分散后金粉依次加入5μl質粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5molL-1CaCl2、20μl 0.1molL-1亞精胺，邊旋渦邊加樣。
7)、繼續旋渦2-3分鐘，靜置1分鐘。
8)、15000rpm離心2秒后棄上清液，加140μl 70％乙醇。
9)、靜置沉淀，15000rpm離心2秒后棄上清液。
10)、加48μl無水乙醇，輕彈管壁數次，低速下渦旋2-3秒，然后取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。
11)、在直徑9cm的培養皿中倒入0.4cm厚的基本培養基，然后將叢生芽塊(0.3-0.5cm大小，繼代培養后7-12天)高密度放入培養皿中。
12)、用基因槍轟擊叢生芽塊，每皿轟擊1-2次。轟擊參數取可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網的距離為0.8cm，微彈飛行距離6-9cm。其它參數按使用說明書取值。
2、轉化后叢生芽組織塊的篩選和培養1)、轟擊后叢生芽塊在暗中恢復培養2-3天，然后將它們轉入成分不變的新培養基中培養3周。此期叢生芽塊生長良好，轉入的目標基因得到充分表達。
2)、將恢復培養后叢生芽塊轉入加有選擇劑(抗生素或除草劑)的繼代成叢培養基上進行篩選培養，連續篩選三代，每代15-20天。
(三)、轉基因植株的再生和移栽從選擇培養基上挑選出三代篩選后存活的組織塊轉移到無選擇劑的繼代及成叢培養基上誘導叢生芽形成，并通過在繼代及成叢培養基上繼代培養一次獲得較大的叢生芽及小苗。從叢生芽塊上切取2-3厘米的小苗轉入生根培養基中誘導生根。在生根培養基上，當小苗根長到2-3cm時放在自然光下培養1-2天，然后去掉封口膜煉苗1-2天，于清晨或傍晚移栽轉基因植株的移栽和田間管理同普通試管苗。
(四)轉基因植株的分子生物學檢測提取轉化植株葉片DNA，根據目標基因或/和選擇標記基因的DNA序列設計PCR引物。通過PCR檢測初步確定轉基因植株。取PCR陽性的植株進行Southern印跡法鑒定，探針取自目的基因片段。
本發明能獲得大量的具有很強植株再生能力的叢生芽塊，可從絕大多數基因型中高效獲得轉基因植株，且再生植株體細胞無性系變異小，多數植株生長發育正常。本發明的特點在于1)大幅度減少基因型障礙，可誘導絕大多數基因型的早熟禾莖尖基部產生膨大組織進而產生叢生芽塊，2)培養細胞的轉化頻率較高，3)取材不受季節限制，4)轉基因植株絕大多數保持原基因型的特征特性。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明實施例1叢生芽塊的誘導和繼代培養取草地早熟禾品種獎品的種子用70％酒精滅菌1-2分鐘，0.2％升汞(氯化汞)10分鐘，無菌水沖洗4次，播種在濕潤的無菌濾紙上萌發，12天左右切取莖尖放在誘導培養基(加入2，4-D 0.2mgL-1，6-BA 2mgL-1)上培養，誘導基部膨大，膨大率為100％。在誘導培養基上培養20天后，切下莖尖基部膨大組織(直徑1-3mm)轉入繼代及成叢培養基(取2，4-D 0.1mgL-1，6-BA 2mgL-1)上誘導叢生芽發生，15-20天后，多數膨大基部分化出叢生芽，成叢率為75％左右，每叢芽數多為15-20個。將叢生芽塊分割后轉入繼代及成叢培養基上，叢生芽塊細胞迅速增生，一般15天繼代培養一次。若要獲得較大小苗，去掉繼代及成叢培養基中2，4-D，保留2mgL-16-BA。在24±2℃、500-1000Lx光照(14h/d)下培養離體莖尖和莖尖基部膨大物及叢生芽塊。
篩選劑濃度的確定將除草劑綠黃隆(沈陽農藥廠生產，有效成分25％)水溶液過濾滅菌后，加入(培養基溫度低于50℃時)去掉酪蛋白水解物的誘導培養基中。綠黃隆濃度分別為0、2、4、5、6、7mgL-1，即6個梯度濃度。將誘導出的獎品叢生芽切成單芽后放入含有不同濃度綠黃隆的培養基上培養，每種選擇培養基上接種小苗100株。每15天繼代培養一次，共連續篩選三代。根據篩選后的存活率，確定獎品小苗的除草劑綠黃隆篩選濃度為5-6mgL-1。在此濃度下小苗存活率約為5％左右。
農桿菌介導的遺傳轉化將帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農桿菌LBA4404放在附加抗生素的LB培養基中27℃下震蕩培養，使細菌處于對數生長期(OD600＝0.4-0.6)。然后離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體基本培養基洗滌，再離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmolL-1和表面活性劑Silwet L-77 0.02％的1/2濃度的液體基本培養基懸浮，稀釋10-20倍用于轉化。將繼代培養8天的叢生芽塊切至暴露出芽尖生長點，放入菌液中浸染4-6分鐘，并附以0.5×105Pa負壓處理。轉染后組織塊用無菌濾紙吸干后轉入繼代及成叢培養基(6-BA2mgL-1)培養2-3天，然后轉入加有抗生素頭孢霉素250mgL-1的抑菌培養基抑制農桿菌生長，10-15天后再轉入含綠黃隆6mg L-1的篩選培養基篩選3代，每代15天。然后將抗性組織塊轉入繼代及成叢培養基上分化小苗。小苗在無激素的培養基上生根長大。生根小苗移入花盆，每5天澆灌一次1/2基本培養基的無機鹽溶液，隔天澆水一次。移栽成活的小苗取葉片用于分子生物學檢測。經PCR和Southern印跡法分析，轉化率(產生轉基因植株的芽塊數/農桿菌感染的芽塊數*100)為5％左右。
實施例2叢生芽誘導和繼代培養程序同實施例1，但早熟禾品種為新哥來得。選用的繼代及成叢培養基中的激素組合為2，4-D 0.07mgL-1、6-BA 3mgL-1。
篩選劑濃度的確定篩選劑為潮霉素。潮霉素水溶液過濾滅菌后，加入誘導培養基中，濃度分別為0、2、4、6、8、10、12、14mgL-1，即8個梯度濃度。篩選程序和方法同實施例1。根據篩選后的存活率，確定新哥來得小苗的潮霉素篩選濃度為10mgL-1。在此濃度下小苗存活率約為3％左右。
基因槍轟擊法轉化叢生芽塊質粒為pCAMBIA1300-hpt-antiport。提取和純化采用標準程序及方法(參見《分子克隆》)。質粒質量為OD260/OD280在1.7-1.8之間。質粒DNA稀釋為1μg/μl。
微彈制備和基因槍轟擊1)、稱取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一個Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇后劇烈渦旋3-5分鐘，然后靜置15分鐘。室溫下15000rpm離心5秒，去除上清液。
2)、加1ml無菌水，劇烈渦旋1分鐘，靜置1分鐘，室溫下15000rpm離心5秒，去除上清液。此步驟重復3次。
3)、無菌水洗滌后的金粉，加50μl 50％滅菌甘油(終濃度為60mg/ml微彈)。該制備液可室溫貯存2周，使用時渦旋5分鐘打破金粉凝集。
4)、分散后金粉依次加入5μl質粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5molL-1CaCl2、20μl 0.1molL-1亞精胺，邊加樣邊旋渦。然后，繼續旋渦2-3分鐘，靜置1分鐘。
5)、15000rpm離心2秒，棄上清液。加140μl 70％乙醇，靜置，15000rpm離心2秒后棄上清液。
6)、加48μl無水乙醇，輕彈管壁數次，低速下渦旋2-3秒，然后取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。
7)、在直徑9cm的培養皿中倒入0.4cm厚的繼代及成叢培養基，然后將叢生芽塊(0.2-0.4cm大小，繼代培養后8天)高密度放入培養皿中。
8)、用基因槍轟擊叢生芽組織塊，每皿轟擊一次。轟擊參數取可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網的距離為0.8cm，微彈飛行距離6-9cm。其它參數按使用說明書取值。
轟擊后材料在暗中恢復培養3天，然后將材料轉入成分不變的新培養基中培養3周，使轉入的目標基因充分表達，然后轉入加有10mgL-1潮霉素的培養基上連續篩選3代，存活的組織塊在無潮霉素的繼代及成叢培養基上恢復培育10-20天，部分組織塊產生小苗。
轉化小苗的生根、移栽和分子生物學檢測同實施例1。
權利要求
1.一種建立早熟禾轉基因受體體系的方法，其特征在于①種子萌發小苗的莖尖離體培養和基部膨大組織的誘導及培養基，②培養莖尖基部膨大組織誘導叢生芽及培養基，③叢生芽塊繼代培養，④以叢生芽塊為受體進行遺傳轉化及受體組織繼代培養時間和轉化參數；所述的轉基因受體體系是指莖尖離體培養產生的叢生芽塊及其擴增和繼代培養物；叢生芽塊是指離體培養莖尖在含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-芐基嘌呤)的培養基上產生的由叢生小芽和未組織化細胞組成的組織塊及其繼代培養物。
2.按照權利要求1所述的建立早熟禾轉基因受體體系的方法，其特征在于，用于莖尖離體培養的誘導培養基含有酪蛋白水解物500mg L-1，2，4-D 0-2.0mg L-1，激動素(KT)或6-BA 0.1-5.0mg L-1；用于叢生芽誘導和叢生芽塊繼代的繼代及成叢培養基含有酪蛋白水解物500mg L-1，2，4-D 0-1.0mg L-1，激動素(KT)或玉米素或6-BA0.1-4.0mg L-1；生根培養基含有激動素(KT)或6-BA0.001-2.0mg L-1，萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)或吲哚乙酸(IAA)0.002-2.0mg L-1。
3.按照權利要求1所述的建立早熟禾轉基因受體體系的方法，其特征在于，離體莖尖取自無菌萌發的種子，待小苗長到3-5厘米時，切取莖尖接種到誘導培養基上，于弱光下誘導莖尖基部膨大，然后將膨大組織切下轉移到繼代及成叢培養基上誘導叢生芽發生，叢生芽塊在繼代及成叢培養基上增殖，小苗在生根培養基上生根長大。
4.根據權利要求1限定的早熟禾轉基因受體體系的應用，其特征在于，用基因槍轟擊法或農桿菌介導法進行叢生塊遺傳轉化，轉化后材料恢復培養后，在抑菌或/和在選擇培養基上連續篩選，通過加壓篩選獲得轉基因細胞及叢生芽塊，進而再生出轉基因植株。
5.按照權利要求1或4限定的早熟禾轉基因受體體系的應用，其特征在于，取繼代后培養7-12天的叢生芽塊作為轉基因受體。
6.按照權利要求1或4限定的早熟禾轉基因受體體系的應用，其特征在于，采用農桿菌介導法在0.95-0.10個大氣壓(0.95×105Pa---1×1.04Pa)下進行遺傳轉化，在菌液中加入濃度為0-0.3％的表面活性劑Silwet L-77。
全文摘要
本發明公開一種建立早熟禾遺傳轉化體系的方法及應用，主要步驟包括以草地早熟禾的種子苗莖尖為材料，離體培養誘導莖尖基部膨大，切取膨大組織轉入繼代及成叢培養基上誘導叢生芽發生。在繼代及成叢培養基上叢生芽塊持續增殖，轉入成苗培養基和生根培養基后產生完整植株。取適宜生長期的叢生芽塊為受體采用基因槍轟擊法或農桿菌介導法進行遺傳轉化，獲得轉基因植株。在農桿菌介導的遺傳轉化中，采用表面活性劑Silwet L－77處理和減壓處理有效提高了轉化頻率，從而建立起一個高效的基因型制約小的早熟禾轉基因技術體系。
文檔編號A01H4/00GK1596617SQ20041002453
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月6日 優先權日2004年8月6日
發明者張舉仁, 楊愛芳, 張可煒, 尹小燕, 谷曉峰 申請人:山東大學