一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法
【專利摘要】本發明提供一種利用木豆無菌苗葉片進行外植體轉化，建立木豆毛狀根培養體系方法。本發明采用葉片為外植體,建立毛狀根培養體系：葉片在1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8g/L的培養基上預培養兩天后進行菌液侵染，菌液濃度OD600為0.6-0.8，侵染5-10min后轉入1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8g/L培養基上共培養3天，然后轉入抑菌培養基1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8g/L+400mg/L羧芐青霉素，約一周左右便可形成毛狀根。PCR檢測證明外源基因已經轉入到木豆毛狀根中，轉化率為60%。轉化后毛狀根在無激素培養基上生長速度非常快，一個月能增殖7-8倍。次生代謝產物含量高，芹菜素和染料木素含量分別為0.58mg/g(DW)和1.32mg/g(DW)，顯著高于實生苗根中含量。本發明提供的培養簡單、再生周期短、可持續獲得木豆毛狀根方法，可用于規模化培養木豆毛狀根來提取有價值次生代謝產物，具有很好的應用前景。
【專利說明】一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法
【技術領域】:
[0001]本發明是一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，遺傳轉化率高且周期短，毛狀根生長速度快，次生代謝產物含量高。本發明屬于農業生物【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]木豆[Cajanuscajan (L.) Millspaugh],蝶形花科(Papilionaceae),木豆屬(Cajanus)，是一種短期夏季生長的一年生豆類作物，因豆莢結于樹冠枝梢上，故稱木豆；鴿子愛吃，又稱鴿豆；是世界第六大食用豆類，也是木豆屬中唯一的一個栽培種。木豆的根、莖、葉、花、莢和種子都可以入藥，全身是寶，除具有很高的經濟、生態利用價值外，還具有顯著的藥用價值。
[0003]在木豆根的有效藥用化學成分中，芹菜素和染料木素是主要的黃酮苷元成分，具有很好的藥理活性。芹菜素具有抑制致癌物質活性，作為治療HIV和其它病毒感染的抗病毒藥物，具有低毒、無誘變性的特點。染料木素具有抗氧化作用，可以抑制酪氨基酸蛋白激酶(PTK)和拓撲異構酶II的活性，具有誘發細胞程序性死亡、提高抗癌藥效、抑制血管生成等作用，是一種很有潛力的癌癥化學預防劑，其抗癌作用及機制具有廣泛的應用前景。
[0004]利用毛狀根培養技術生產有價值的木豆次生代謝產物芹菜素和染料木素是一條經濟有效的途徑，毛狀根具有生長迅速、生長和遺傳穩定以及在無激素的培養基上生長等特點，它能夠合成與 原植物含量相當或高于原植物含量的次生代謝產物，而且生產能力穩定，利于天然產物的開發和利用。因此利用發根農桿菌侵染木豆葉片，產生毛狀根，并對毛狀根進行繼代增殖培養，可規模化生產芹菜素和染料木素，是木豆藥用資源可持續發展的有效途徑之一。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的是提供一種遺傳轉化率高，毛狀根生長速度快且次生代謝產物含量高的木豆毛狀根遺傳轉化體系建立方法，為木豆有藥用價值次生代謝產物生產源源不斷地提供原料。該發明為利用毛狀根培養規模化生產木豆有價值的次生代謝產物成分奠定基礎。
[0006]本發明主要是涉及利用木豆無菌苗的葉片為外植體，利用發根農桿菌介導，建立木豆毛狀根培養體系的方法。主要包括外源生長調節物質，培養基組成，預培養時間，共培養時間，菌液濃度，侵染時間等，建立快速高效的木豆毛狀根培養體系。
[0007]具體的技術路線包括以下幾方面內容:
[0008]1、木豆無菌苗的獲得:
[0009]將滅菌后的木豆種子接種到MS+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂的培養基上培養，一個星期左右，木豆種子發芽，兩周左右可獲得木豆的無菌苗。
[0010]2、外植體轉化
[0011]在超凈工作臺中，將木豆植株葉片剪成兩端有傷口，約0.5cmX0.5cm大小，放在1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L的培養基上，26°C暗培養，預培養2天后，將木豆葉片放進發根農桿菌LBA9402菌液(0D_為0.6-0.8)中浸染20min，用無菌濾紙吸去多余菌液，放在共培養培養基1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L上共培養3天。
[0012]3、外植體抑菌
[0013]共培養3天后，將木豆葉片轉入含有400mg/L羧芐青霉素的1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L培養基上抑菌，20天后將感染后長出的毛狀根，從葉片上剪下，放到含有400mg/L羧芐青霉素的1/2MS培養基上培養，并觀察毛狀根的除菌情況，調整培養基中羧芐青霉素含量，直至毛狀根除菌完全。
[0014]4、轉化毛狀根PCR檢測
[0015]完全抑菌的毛狀根經PCR檢測表明，外源基因已經整合到毛狀根體內，具有很高遺傳轉化率，遺傳轉化率為60%。
[0016]5、木豆毛狀根次生代謝產物含量檢測
[0017]采用HPLC法，對木豆毛狀根次生代謝產物含量進行檢測，木豆毛狀根的芹菜素和染料木素的含量分別為0.58mg/g(Dff)和1.32mg/g(DW)，顯著高于木豆實生苗中芹菜素和染料木素的含量，高出2倍之多。
[0018]6、木豆毛狀根繼代增殖培養
[0019]將上述獲得的毛狀根接種到無激素培養基1/2MS+蔗糖20g/L中進行繼代增殖培養，毛狀根生長速度快，保 持很高的增殖倍數，一個月能增殖7-8倍。
[0020]本發明所使用的培養基都是按照常規的方法處理的，pH值均為5.8-6.0，高溫高壓(121°C，1.5個大氣壓)20min后使用的。
[0021]本發明的培養室是在常規的組織培養室(溫度25°C左右，光照1000-15001ux，光/暗周期16h/8h，濕度70%左右)中進行的。
[0022]本發明的技術特征:.[0023]I)以木豆無菌苗葉片為外植體建立了木豆毛狀根培養體系。
[0024]2)木豆毛狀根誘導所花費的時間短，僅需一周左右。
[0025]3)木豆毛狀根生長速度快，次生代謝產物含量高。
[0026]4)可以為木豆有價值的次生代謝生產源源不斷地提供原料。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0027]附圖1木豆無菌苗葉片誘導毛狀根
[0028]附圖2繼代培養基上生長木豆毛狀根
[0029]附圖3轉化毛狀根PCR檢測，M，DL2000marker ;1，陽性對照(質粒DNA) ;2，陰性對照(非轉化根)；3_6，轉化不同毛狀根無性系
[0030]附圖4液體培養基培養木豆毛狀根
【具體實施方式】:
[0031]1、木豆無菌苗的獲得
[0032]在超凈工作臺中，將清洗干凈的木豆種子用75%的酒精殺菌30s，然后用無菌水洗2遍，再用3%的次氯酸鈉消毒2min，無菌水清洗3遍，濾紙吸干種子表面水分，接種到固體培養基上。培養條件為溫度(25±1) °C，光照強度1500-20001UX，光周期16h/8h。一個星期左右，木豆種子發芽，兩周左右可獲得木豆的無菌苗。
[0033]2、外植體轉化
[0034](I)外植體的準備
[0035]在超凈工作臺中，將木豆無菌苗葉片邊緣剪掉，所剪葉片大小約為0.5cmX0.5cm。
[0036]( 2 )外植體預培養
[0037]將剪好的葉片培養在1/2MS+IBA0.2mg/L+20g/L蔗糖+瓊脂8.0g/L的培養基上，25°C暗培養，預培養的時間設置為0，1，2，3及4天，研究發現，預培養2天可以得到較高的轉化率，因此確立2天為木豆葉片外植體的預培養時間。
[0038](3)菌液濃度的確立
[0039]本發明所采用的發根農桿菌菌株為LBA9402，將菌株劃線培養在YEP固體培養基上，28°C培養2天后，挑取單菌落接種到5mL YEP液體培養基中，160r/min震蕩培養24h，取ImL菌液稀釋50倍繼續震蕩培養至600nm處菌液吸光度值分別為0.2,04,0.6,0.8及1.0時，侵染預培養2天的葉片，當菌液OD6tltl值為0.6-0.8時，轉化率較高。因此0D_的值為
0.6-0.8的菌液均可用于侵染。
[0040](4)菌液侵染時間的確立
[0041]在確立好菌液濃度的基礎上，將預培養2天的葉片放進準備好的菌液(0D_的值為0.6-0.8)，設置不同的侵染時間:5min, IOmin, 15min，20min及25min。結果表明，在5min-20min內，隨著侵染時間的延長,遺傳轉化率逐漸提高,在20min時達到最大值,超過20min,外植體褐化死亡。因此確立20min為最佳的菌液侵染時間。
[0042](5)共培養時間的確立
[0043]將侵染20min的葉片取出，用無菌濾紙吸去多余的菌液，葉面向軸面朝下放置在共培養培養基MS+IBA0.2mg/L+20g/L蔗糖+瓊脂8.0g/L上，設置不同的共培養時間:1天，2天，3天，4天及5天。共培養3天的遺傳轉化率最高，因此最佳的共培養時間為3天。
[0044](6)外植體的抑菌
[0045]將共培養3天的外植體轉入抑菌培養基，抑菌劑分別采用了頭孢霉素和羧芐青霉素，發現頭孢霉素對毛狀根的誘導和生長有抑制作用，而羧芐青霉素不但抑菌效果好，而且毛狀根的生長和誘導未受影響，因此本發明采用了羧芐青霉素作為抑菌劑，工作濃度為400mg/L。
[0046]3、木豆毛狀根PCR檢測
[0047]將外植體轉入抑菌培養基后，大約一周左右，葉片的切口部位將會有毛狀根出現(圖1)，毛狀根生長迅速，分枝多(圖2)。在抑菌培養基培養一段時間無發根農桿菌殘留后，將獲得的毛狀根進行PCR檢測，PCR檢測結果表明，發根農桿菌所攜帶的目的基因已經整合進木豆毛狀根體內(圖3)，遺傳轉化率為60%。
[0048]4、木豆毛狀根液體繼代增殖培養
[0049]將經PCR檢測呈陽性，生長旺盛且分枝多的毛狀根在液體繼代增殖培養基MS+20g/L蔗糖進行繼代增殖培養，木豆的毛狀根生長速度快，一個月能增殖7-8倍(圖4)。
[0050]5、木豆毛狀根次生代謝產物含量檢測
[0051]采用HPLC法對木豆毛狀根的次生代謝產物含量進行檢測，木豆毛狀根中芹菜素的含量為0.58mg/g(Dff),染料木素的含量為1.32mg/g(Dff)，比木豆實生苗根中的含量高出
兩倍之 多。
【權利要求】
1.一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，其特征在于: O采用木豆無菌苗葉片為外植體進行轉化；2)確立了適合木豆遺傳轉化的預培養時間、菌液濃度、侵染時間及共培養時間；3)外植體抑菌培養抑菌劑選擇；4)確立了最佳的預培養、共培養及繼代增殖培養基；5)此轉化程序具有很高的遺傳轉化率，毛狀根生長速度快，次生代謝產物含量高。
2.根據權利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，其主要特征在于:采用木豆無菌苗的葉片為外植體進行遺傳轉化，操作方便，可以避免外植體滅菌不徹底帶來的污染，外植體易于獲得，一個星期左右，便可以從葉片邊緣誘導出毛狀根，再生速度快。
3.根據權利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，其主要特征在于:用于轉化的葉片外植體預培養時間為2天，時間超過兩天，轉化假陽性比較多；侵染時菌液濃度0D_的值為0.6-0.8，菌液濃度低于0.6，木豆毛狀根再生速度慢，遺傳轉化率低，菌液濃度大于0.8，外植體抑菌困難，外植體易褐化死亡，降低遺傳轉化率；最佳侵染時間為20min，侵染時間過短或過長，均不利于外植體遺傳轉化；轉化外植體共培養時間為3天，共培養時間過長，發根農桿菌過度增殖，抑菌困難。
4.根據權利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，其主要特征在于:共培養后，外植體轉入抑菌培養基，所采用的抑菌劑為羧芐青霉素，羧芐青霉素不但抑菌效果好，而且毛狀根的生長速度未受影響。
5.根據權利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，外植體預培養及共培養的培養基為1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L培養基，繼代增殖的基本培養基為MS+蔗糖20 g/L。
6.根據權利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，其主要特征在于:遺傳轉化率高，PCR檢測證明，發根農桿菌Ti質粒所攜帶的目的基因已經整合進木豆毛狀根體內，遺傳轉化率為60%，毛狀根生長速度快且次生代謝產物含量高，一個月能增殖7-8倍，芹菜素和染料木素的含量分別為0.58mg/g(Dff)和1.32mg/g(Dff)。
【文檔編號】A01H5/00GK104017822SQ201310190956
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2013年5月22日
【發明者】王慧梅, 付玉杰, 王文杰, 祖元剛, 曲丹, 任潔 申請人:東北林業大學, 王慧梅