專利名稱：一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法
技術領域：
本發明涉及貝類多倍體的誘導和培育，特別提供了一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法。
背景技術：
利用生物技術培育優良的養殖品種，是發展海水貝類養殖亟待解決的關鍵問題之一。三倍體貝類具有許多優良生產性狀，是一類很有價值的養殖貝類新品系。目前通常采用理化方法人工誘導多倍體，倍化率變化幅度大，很難達到100％，并且人工誘導對誘導對象造成的負面影響大，表現為存活率低、異常發育的胚胎和幼蟲比例高。利用人工培育的四倍體，與正常二倍體雜交，可以高效獲得高倍化率的三倍體，是最有前景的三倍體貝類制備方法。
目前國內外成熟的貝類四倍體技術僅見美國學者利用三倍體長牡蠣(通稱為太平洋牡蠣)的卵子與來自二倍體的精子受精，采用細胞松弛素B抑制受精卵第一極體的釋放，獲得了四倍體長牡蠣。該技術中通過人工解剖方法分別從三倍體和二倍體獲取卵子和精子。該技術已經受到國際專利的保護。我國學者也采用該方法，獲得少量合浦珠母貝四倍體。但是直接從二倍體制備四倍體的技術，國內外鮮有報道。
櫛孔扇貝三倍體性腺發育嚴重受阻，無法通過催產三倍體獲取卵子，而且人工解剖獲取的卵子無法完成受精。因此利用三倍體來誘導四倍體的技術不可行，需要探索櫛孔扇貝四倍體的制備方法。
發明內容
本發明旨在提供一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，人工培育櫛孔扇貝的四倍體，促進三倍體櫛孔扇貝的開發利用。
為了實現上述目的，本發明的技術方案如下
1)選取性腺發育飽滿成熟，1～3齡，在自然海區棲息的二倍體櫛孔扇貝；2)分別催產雄貝和雌貝獲取精子和卵子，經人工同步授精獲取受精卵，受精卵密度在10～50萬粒/L，然后進行誘導加倍；3)利用細胞松弛素B或者6-二甲氨基嘌呤，處理受精卵，使其染色體數目從二倍體加倍至四倍體，用海水漂洗受精卵，利用篩絹網過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮；4)在水溫18～20℃下，按常規方法培育誘導出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態為幼貝；5)利用流式細胞術，篩選四倍體，從而獲得四倍體。其中四倍體誘導處理是在水溫18～20℃下，加入細胞松弛素B或者6-二甲氨基嘌呤，有效劑量分別為0.1～1mg/L和300～500μmol/L，處理時間15～20min，處理開始的時間為受精后10-15min。
對實施誘導處理的材料，采用活體取樣制備單細胞懸浮液，細胞密度為5000～100000個/mL，加入DNA特異性熒光染料DAPI(4′，6-二聯脒-2-吲哚苯)，加入量為1～10mg/L，利用流式細胞儀檢測樣品的染色體倍性組成，篩選出四倍體。
本發明的原理在于現有技術中，從人工誘導培育的三倍體獲取卵子，利用二倍體產生的精子受精后，采用細胞松弛素B抑制受精卵第一極體的釋放，獲得了四倍體長牡蠣。而本發明取材于自然棲息的二倍體，采用細胞松弛素B或6-二甲氨基嘌呤處理，并且通過控制水溫、處理時間、處理開始的時間等，在抑制受精卵第一極體釋放的基礎上改變受精卵的染色體行為，實現部分受精卵的染色體數目從二倍體加倍至四倍體，經培育后，采用流式細胞術篩選出四倍體。
本發明提供的櫛孔扇貝四倍體制備過程中，要求被處理的受精卵的發育具有較高同步性，以實現較高的四倍體胚胎誘導率。為了解決這一問題，首先選擇性腺發育成熟的親本，以保證高質量的精子和卵子。其次，實施同步人工授精，具體而言，將雌、雄親本甄選分開，分別進行產卵和排精，然后進行人工授精，授精時的精子與卵子的比例不少于100∶1，授精后不斷攪動。
流式細胞術是對單個細胞或其他生物微粒進行快速定量分析與分選的技術，其原理是將懸浮在液流中的單細胞逐個通過測量區，用儀器檢測細胞內的光學參數而達到快速、大量地測定細胞的一系列物理特性和生化特性。如果單細胞樣品經DNA特異性熒光染料處理，就可測定樣品的DNA含量，判斷其倍性。自20世紀80年代以來，國際貝類多倍體研究中廣泛利用流式細胞術檢測實驗材料的倍性組成。本發明采用流式細胞術對幼貝進行分析，在不殺死檢測對象的條件下，實現了快速、準確篩選四倍體。
本發明的有益效果是1、本發明提供的四倍體制備方法，直接利用自然海區棲息具有繁殖力的自然二倍體櫛孔扇貝，經人工授精制備受精卵，施加化學誘導劑處理使受精卵的染色體加倍，獲得四倍體胚胎，利用流式細胞術對誘導培育獲得的材料進行活體檢測，篩選四倍體。本發明制備的四倍體櫛孔扇貝是利用染色體組操作技術獲得的特有種質資源。
2、本發明材料來源豐富，并且四倍體誘導率穩定，四倍體幼蟲的比例在30％以上。
具體實施例方式
以下給出幾個典型實施例，但本發明并不局限在以下實施例中。
實施例1利用本發明方法，制備櫛孔扇貝四倍體，具體操作為1)從自然海區選取性腺發育飽滿，性腺色澤鮮艷的1齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實施人工催產獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為100∶1，獲得受精卵，調整其密度為10萬粒/L；3)在18℃下，受精后15min按0.5mg/L的濃度加入細胞松弛素B，處理15min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；
5)在水溫18℃下，按常規方法培育誘導出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態為幼貝；在受精后48h，采用流式細胞術分析表明四倍體幼蟲比例為50％；6)在完成變態的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細胞懸液，細胞密度為5000個/mL，加入DAPI，加入量為1mg/L，采用流式細胞術逐個分析，檢測到四倍體，比例為3％。
實施例2利用本發明方法，進行櫛孔扇貝的多倍體幼蟲樣品制備，具體操作為1)從自然海區選取性腺發育飽滿，性腺色澤鮮艷的2齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實施人工催產獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為120∶1，獲得受精卵，調整其密度為50萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在20℃下，受精后12min按0.1mg/L的濃度加入細胞松弛素B，處理20min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫20℃下，按常規方法培育誘導出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態為幼貝；在受精后48h，采用流式細胞術分析表明四倍體幼蟲比例為50％；6)在完成變態的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細胞懸液，細胞密度為10000個/mL，加入DAPI，加入量為2mg/L，采用流式細胞術逐個分析，檢測到四倍體，比例為2％。
實施例31)從自然海區選取性腺發育飽滿，性腺色澤鮮艷的3齡二倍體櫛孔扇貝；
2)雌雄分選，分別實施人工催產獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為100∶1，獲得受精卵，調整其密度為10萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在18℃下，受精后10min按1mg/L的濃度加入細胞松弛素B，處理15min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫18℃下，按常規方法培育誘導出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態為幼貝；在受精后48h，采用流式細胞術分析表明四倍體幼蟲比例為60％；6)在完成變態的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細胞懸液，細胞密度為50000個/mL，力入DAPI，加入量為5mg/L，采用流式細胞術逐個分析，檢測到四倍體，比例為3％。
實施例4利用本發明方法，制備櫛孔扇貝四倍體，具體操作為1)從自然海區選取性腺發育飽滿，性腺色澤鮮艷的3齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實施人工催產獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為150∶1，獲得受精卵，調整其密度為30萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在19℃下，受精后10min加入終濃度為300μmol/L的6-二甲氨基嘌呤，處理20min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫19℃下，按常規方法培育誘導出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態為幼貝；在受精后48h，采用流式細胞術分析表明四倍體幼蟲比例為70％；
6)在完成變態的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細胞懸液，細胞密度為80000個/mL，加入DAPI，加入量為8mg/L，采用流式細胞術逐個分析，檢測到四倍體，比例為3％。
實施例5利用本發明方法，制備櫛孔扇貝四倍體，具體操作為1)從自然海區選取性腺發育飽滿，性腺色澤鮮艷的3齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實施人工催產獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為150∶1，獲得受精卵，調整其密度為40萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在19℃下，受精后15min加入終濃度為500μmol/L的6-二甲氨基嘌呤，處理18min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫19℃下，按常規方法培育誘導出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態為幼貝；在受精后48h，采用流式細胞術分析表明四倍體幼蟲比例為60％；6)在完成變態的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細胞懸液，細胞密度為100000個/mL，加入DAPI，加入量為10mg/L，采用流式細胞術逐個分析，檢測到四倍體，比例為2％。
權利要求
1.一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征在于包括如下過程1)選擇親本選取自然棲息的二倍體櫛孔扇貝，性腺發育飽滿成熟；2)獲取受精卵分別催產雄貝和雌貝獲取精子和卵子，經人工同步授精獲取受精卵，受精卵密度在10～50萬粒/L，然后進行誘導加倍；3)誘導加倍在水溫18～20℃下，利用化學誘導劑處理受精卵使其染色體數目從二倍體加倍至四倍體，受精后10～15min開始處理，處理時間15～20min，用海水漂洗受精卵，利用篩絹網過濾去除藥物；4)培育幼體在水溫18～20℃下，按常規方法培育誘導出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態為幼貝；5)篩選四倍體采用流式細胞術逐個分析幼貝，篩選獲得四倍體。
2.按照權利要求1所述適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征是所述化學誘導劑為細胞松弛素B，或者為6-二甲氨基嘌呤。
3.按照權利要求1或2所述適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征是所述化學誘導劑的劑量，細胞松弛素B為0.1～1mg/L，6-二甲氨基嘌呤為300～500μmol/L。
4.按照權利要求1所述適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征是所述流式細胞術包括活體取樣，制備單細胞懸浮液，加入DNA特異性熒光染料DAPI，利用流式細胞儀檢測樣品的染色體倍性。
全文摘要
本發明公開一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法。它利用具有繁殖力的自然二倍體櫛孔扇貝，經人工授精制備受精卵，施加化學誘導劑處理使受精卵的染色體加倍，獲得四倍體，利用流式細胞術活體篩選四倍體。本發明制備的四倍體櫛孔扇貝是利用染色體組操作技術獲得的特有種質資源。本發明材料來源豐富，并且四倍體誘導率穩定，四倍體幼蟲的比例在30％以上。
文檔編號A01K61/00GK1739343SQ20041005030
公開日2006年3月1日 申請日期2004年8月24日 優先權日2004年8月24日
發明者闕華勇, 張國范, 張福綏 申請人:中國科學院海洋研究所