專利名稱：器官保存液及其制法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物學和醫學領域，更具體地涉及一種用于器官移植的器官保存液及其制備方法和用途。
背景技術：
目前，器官移植手術仍然是救治某些疾病的重要手段。然而，在將器官從供體上取下，然后移植到受體，常常需要在一定溫度下保存。因此為了延長移植物的存活時間，提高移植物再宿主體內的存活率，人們常常使用器官移植保存液來保存移植器官。由于移植過程中的排斥反應與免疫系統產生的多種因子有關，因此各細胞因子與免疫排斥之間的關系一直是研究重點。
TNF-α和IL-1是介導同種免疫應答的關鍵因子，在急、慢性同種排斥反應的各個階段均有TNF-α的合成和釋放并介導排斥反應的發生發展；可溶性腫瘤壞死因子受體(sTNFR)具有中和及拮抗TNF-α的作用，是體內自然存在的TNF-α拮抗劑。sTNFR可有效阻滯TNF-α介導的損傷，美國FDA已批準其(即p75-sTNFRIg融合蛋白，商品名Enbrel)作為治療類風濕關節炎的一線藥物而進入臨床，但有關sTNFR在移植排斥反應中的作用和效能了解較少。可溶性IL-1受體(sIL-1R)是體內IL-1的天然拮抗劑。sIL-1R在自身免疫性疾病的動物模型，如EAE和自身免疫性糖尿病模型中表現出良好的治療作用，揭示其在治療人類自身免疫病方面也具有廣闊的應用前景。
目前采用的器官移植保存液如目前常用的器官保存液UW液的成分是乳糖鉀鹽 100mmol 胰島素100UKH2PO425mmol青霉素40UMgSO45mmol 地塞米松 8mg棉糖 30mmol別嘌呤醇 1mmol腺苷 5mmol 羥乙基淀粉50g谷胱甘肽 3mmol
UW液的特點有(a)不含葡萄糖，而用乳糖鹽作為非滲透陰離子，加棉糖作為附加的滲透支持。(b)含羥乙基淀粉，作為有效膠體發揮其滲透壓力，可以阻止有害的細胞間隙擴大。(c)以磷酸鹽預防酸中毒。(d)用谷胱甘肽、別嘌呤醇對抗氧自由基。臨床證實UW液可保存胰腺、腎達72小時，保存肝20～24小時。現在，UW液及其各種UW型改良液已在國際上日益廣泛應用，有替代Collins類型溶液的明顯趨勢。
但是目前此類保存液僅是從如何保存組織中細胞的活性，并不能降低器官移植過程中的移植物抗宿主或宿主抗移植物的反應，從而提高器官移植后的存活率。
由于移植器官的保存對于移植手術的成功與否至關重要，因此，本領域迫切需要開發新的器官移植保存液，該保存液不僅可以有效降低器官移植過程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反應，延長移植物的存活時間，和/或可以提高移植物再宿主體內的存活率，從而可有效地應用于包括腎、肝、心臟等重要臟器的移植。
發明內容
本發明的目的就是提供一種器官移植保存液，該保存液不僅可以有效降低器官移植過程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反應，延長移植物的存活時間，和/或可以提高移植物再宿主體內的存活率。
在本發明的第一方面，提供了一種器官保存液，它含有以下組分(a)30-300ug/L的可溶性TNF受體或TNF拮抗劑，或者1×109-1014PFU/升表達可溶性TNF受體或TNF拮抗劑的載體，按保存液的總體積計；(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑，或者1×109-1014PFU/升表達可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑的載體，按保存液的總體積計；以及(c)藥學上可接受的稀釋劑。
在另一優選例中，所述保存液含有(a)30-300ug/L的可溶性TNF受體或TNF拮抗劑，按保存液的總體積計和(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑，按保存液的總體積計。
在另一優選例中，所述保存液含有以下組分(a)1×1010-1013PFU/升表達可溶性TNF受體或TNF拮抗劑的載體，按保存液的總體積計；(b)1×1010-1013PFU/升表達可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑的載體，按保存液的總體積計。
在另一優選例中，所述的載體選自下組真核表達載體和重組病毒載體。
在另一優選例中，所述的重組病毒載體是選自下組的載體重組腺病毒、逆轉錄病毒、重組痘苗病毒、單純皰疹病毒。
在另一優選例中，所述保存液還含有選自下組的一種或多種添加劑(d1)9±0.5克 NaCl；(d2)20-200克 白蛋白；(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素選自青霉素、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、先鋒霉素；(d4)25mmol/L KH2PO4；(d5)5mmol/L MgSO4；(d6)30mmol/L棉糖；(d7)3mmol/L谷胱甘肽；(d8)1mmol/L別嘌呤醇；(d9)50g/L羥乙基淀粉。
本發明還提供了上述保存液的凍干制劑，即將保存液凍干從而去除水分所形成的凍干制劑。
在本發明的第二方面，提供了本發明上述的器官保存液的用途，它被用于保存待移植的器官和組織。
在本發明的第三方面，提供了一種保存待移植用器官或組織的方法，包括步驟將本發明所述器官保存液通過動脈灌注于待移植器官或組織，和/或將待移植器官或組織在該保存液中浸泡1小時-10天。
在本發明的第四方面，提供了一種本發明上述的器官保存液的制備方法，包括以下步驟混合以下各組分，按1升保存液計算
(a)1×109-1014PFU表達可溶性TNF受體的重組腺病毒；(b)1×109-1014PFU表達可溶性IL-1受體的重組腺病毒；(c)藥學上可接受的稀釋劑；從而制得保存液。
在另一優選例中，所述的組分還包括選自下組的一種或多種(d1)9±0.5克 NaCl；(d2)20-200克 白蛋白；(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素選自青霉素、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、先鋒霉素；(d4)25mmol/L KH2PO4；(d5)5mmol/L MgSO4；(d6)30mmol/L棉糖；(d7)3mmol/L谷胱甘肽；(d8)1mmol/L別嘌呤醇；(d9)50g/L羥乙基淀粉。
圖1顯示了本發明一個實例中器官移植保存液對小鼠心臟移植存活期的延長作用。圖中，“control”表示對照，“LacZ-heart”表示采用表達LacZ的重組腺病毒處理的小鼠心臟，“sTNFr-sIL-1r-heart”表示采用表達sTNFr的重組腺病毒以及表達sIL-1r的重組腺病毒處理的小鼠心臟。
圖2顯示了心臟移植后不同時間小鼠外周血sTNFr和sIL-1r的表達。
圖3顯示了本發明的器官移植保存液抑制移植物浸潤細胞(GIC)的同種反應活性。
圖4顯示了本發明的器官移植保存液抑制移植物浸潤細胞(GIC)的同種細胞殺傷活性(CTL)。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，對器官保存液的各成分進行了篩選，發現當添加適量的可溶性TNF受體或TNF拮抗劑和適量的可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑時，可以有效降低器官移植過程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反應，延長移植物的存活時間，提高移植物再宿主體內的存活率，因而可有效地應用于器官移植，包括腎、肝、心臟等重要臟器的移植。
用于配制本發明器官保存液的各組分都是現有技術中已知的，可用現有技術中常規的方法制備或直接購得。
如本文所用，術語“可溶性TNF受體或TNF拮抗劑”指可溶性腫瘤壞死因子受體p55以及可溶性腫瘤壞死因子受體p75以及抗TNF的單克隆抗體以及可以抑制TNF表達分泌的蛋白質或化合物，代表性的例子包括Genbank登錄號為NP 001057.1或NP 001056.1的蛋白質，DNA序列可見登錄號BC010140。
在眾多文獻中也公開了可溶性TNF受體(sTNFR)的序列，表達方法以及相應的載體和宿主細胞。例如US6306820給出了I型和II型sTNFR的氨基酸序列和編碼序列。此外，以下文獻中也給出了適用于本發明的各種TNF受體(sTNFR)的序列和表達方法US 6,667,390“Human tumor necrosis factor receptor TR9”；US6,623,941“Nucleic acids encoding human tumor necrosis factor TR20”；US6,607,726“Human tumor necrosis factor receptor TR10”；US6,534,061“Tumor necrosis factor receptor homologs and nucleic acidsencoding the same”；US6,509,170“Polynucleotides encoding human tumornecrosis factor delta”；US6,506,882“Antibodies that bind tumor necrosisfactor delta”；US6,506,569“Antibodies to human tumor necrosis factorreceptor TR10”；US6,503,184“Human tumor necrosis factor receptor-likeproteins TR11，TR11SV1 and TR11SV2”；US6,455,040“Tumor necrosis factorreceptor 5”；US6,300,349“Inhibition of tumor necrosis factor alpha”；US6,261,801“Nucleic acids encoding tumor necrosis factor receptor 5”；US6,214,580“Human tumor necrosis factor receptor tr10”；US5,962,478“Inhibition of tumor necrosis factor.alpha.”；US5,945,397“Purified p75(type II)tumor necrosis factor receptorpolypeptides”。這些文獻的公開內容全部納入本文作為參考。
如本文所用，術語“可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑”指白細胞介素1的II型受體或者白細胞介素1的單克隆抗體，以及抑制白細胞介素1表達分泌的蛋白質或化合物，代表性的例子包括Genbank登錄號為NP_775465的蛋白質，相應的DNA序列登錄號為AY124010。
眾多文獻中也公開了可溶性IL1受體(sIL-1R)的序列，表達方法以及相應的載體和宿主細胞。例如以下文獻中也給出了適用于本發明的各種可溶性IL1受體的序列和生產方法US5,488,032“Method of using soluble humaninterleukin-1 receptors to suppress inflammation”；US5,464,937“Type IIInterleukin-1 receptors”；US5,350,683“DNA encoding type II interleukin-1receptors”；US5,319,071“Soluble interleukin-1 receptors”；US5,296,592“Process for purifying interleukin-1 receptors”；US5,180,812“Soluble humaninterleukin-1 receptors，compositions and method of use”；US5,081,228“Interleukin-1 receptors”；US4,968,607“Interleukin-1 receptors”。這些文獻的公開內容全部納入本文作為參考。
US可溶性TNF受體或TNF拮抗劑以及可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑可以直接以蛋白形式使用。可溶性TNF受體或TNF拮抗劑的用量通常為30-300ug/L保存液，當含量低于30ug時，保存器官的存活率下降，當含量大于300ug時，保存器官存活時間無明顯延長。可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑的用量通常為30-600ug/L保存液，當含量低于0ug時，保存器官的存活率下降，當含量大于600ug時，保存器官存活時間無明顯延長。
除了直接使用可溶性TNF受體或TNF拮抗劑以及可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑，也可以使用表達上述受體或拮抗劑的載體(尤其是病毒載體)。優選的病毒載體的例子包括(但并不限于)重組腺病毒.逆轉錄病毒.重組痘苗病毒、單純皰疹病毒。通常，以載體形式使用時，其用量通常為1×109-1014PFU/升保存液。當含量低于1×109PFU/升時，保存器官的存活率下降，當含量大于1014PFU/升保存液，保存器官存活時間無明顯延長.
可用于本發明的抗菌素沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)青霉素、慶大霉素、卡那霉素、先鋒霉素。
本發明的器官保存液還可含有其他額外的添加劑，例如羥乙基淀粉、白蛋白、谷胱甘肽、別嘌呤醇、棉糖。
可用于本發明的藥學上可接受的稀釋劑沒有特別限制。一種優選的稀釋劑是生理鹽水，即氯化鈉含量為9克/升的無菌水。另一種優選的稀釋劑是現有的器官保存液如UW液。
本發明的器官保存液除了可以單獨使用，也可與其他器官保存液聯用。
本發明的主要優點在于(1)可以明顯的延長移植器官的存活時間。
(2)提高移植物再宿主體內的存活率，特別適合腎、肝、心臟等重要臟器的移植。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
制備實施例1～5按表1中所示的配方，將表達可溶性TNF受體的重組腺病毒以及表達可溶性IL-1受體的重組腺病毒按表1的劑量，在4℃條件下加入含2％白蛋白及40U/L青霉素的無菌生理鹽水中，分別制得器官移植保存液a、b、c、d和e。
表1 器官移植保存液的配方(按1升保存液計算)
*表達II型可溶性TNF受體的重組腺病毒用中國專利98126748.3和98126747.5中所述的相同方法制備，不同點僅在于用II型可溶性TNF受體編碼序列替換原專利文獻方法中的IL12或IL18的編碼序列。
**表達可溶性IL-1受體的重組腺病毒用用中國專利98126748.3和98126747.5中所述的相同方法制備，不同點僅在于用IL-1受體(II型)編碼序列(AY124010)替換原專利文獻方法中的IL12或IL18的編碼序列。
測試例在以下測試例1-4中，首先測試了實施例2中的器官移植保存液b。
測試例1器官移植保存液對小鼠心臟移植存活期的延長作用選取雄性，8-12周齡體重在20-25g C57BL/10(H-2B)與BALB/C(H-2K)小鼠作為心臟移植模型，以C57BL/10小鼠為供者，整個手術操作在清潔環境下進行，操作時顯微鏡放大倍數為10倍。小鼠麻醉后固定在簡易手術臺，正中切口開腹，顯露下腔靜脈，注入50U/ml 4℃肝素生理鹽水1ml進行全身肝素化及降溫，立即沿雙側腋前線整塊切除胸前壁，將心臟連同肺部完整切除后，迅速置于4℃乳酸林格氏冰水混合物中，心臟完全停跳后，游離、結扎下腔靜脈、上腔靜脈及肺靜脈(盡量靠近心臟)并于離心端切斷。游離左肺動脈至左側肺門處，切斷左肺動脈供裝Cuff用，右肺動脈結扎。完全游離主動脈，在無名動脈水平予以切除修整。切除肺葉和多余的組織。為左肺動脈安裝0.8mm內徑的Cuff，用10-0的縫線固定，將0～4℃新型器官移植用器官保存液0.5ml經動脈緩慢灌注，孵育1小時后，移植給受者。以BALB/C小鼠為受者，受者小鼠麻醉后固定在簡易手術臺上，采用縱行切口，上至下頜骨下至鎖骨，暴露右側頸部。切除下頜腺體及部分切除胸鎖乳突肌，游離右側頸外靜脈，結扎后，近心端用血管夾封閉血流，近結扎端切斷，50U/ml肝素生理鹽水沖洗。盡可能游離頸內動脈，遠心端結扎后，近心端用血管夾阻斷血流，于結扎點的近心端切斷，50U/ml肝素生理鹽水沖洗，安裝0.4mm內徑的Cuff，用11-0的縫線固定。將供心的裝好Cuff的左肺動脈套入受者右側頸外靜脈，10-0的縫線固定，將受者的裝好Cuff的頸內動脈套入供心的主動脈，10-0的縫線固定。在熱鹽水迅速復溫的同時，開放血流。開放血流后，大約30秒至1分鐘，心臟開始纖顫，并迅速恢復竇性心率。7-0的縫線縫合關閉切口。采用心電圖檢測移植心臟的存活時間，。如圖1所示，灌注保存液組移植心臟的存活明顯延長，平均存活天數從對照組和灌注含有表達LacZ重組腺病毒的對照組的9.6±1.4天延長至80.1±29.3天，大約40％的心臟移植物(每組10例)的存活能夠超過100天。
測試例2器官移植保存液灌注小鼠心臟移植后sTNFr以及sIL-1r的表達在心臟移植后不同時間抽取小鼠靜脈血，采用sTNFr和sIL1r ELISA檢測試劑盒(購自BioSource Europe S.A公司)檢測檢測sTNFr和sIL1r的表達。
結果如圖2所示，表明在小鼠心臟移植后近2周的時間，可以檢測到sTNFr和sIL1r在外周血的表達。
測試例3器官保存液抑制移植物浸潤細胞(GIC)的同種反應活性(MLR)于移植后第7天，處死各組小鼠，獲取移植心臟，浸于濃度為100μg/ml的IV型膠原酶(購于Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)中，37℃消化30分鐘。收集細胞，用PBS洗兩遍，接著用Percoll細胞分離液進行梯度離心(2000轉/分鐘×30min)，收集懸于頂層(含消化的間充質細胞和殘余心肌細胞)和界面的細胞。洗兩遍，用RPMI-1640完全培養基將收獲的細胞濃度調至2×106/ml，將收獲的移植物浸潤細胞(GIC)以不同的比例(分別為2∶1，5∶1，10∶1，20∶1)與γ射線(20Gy)滅活的C57BL/6脾T淋巴細胞作72小時混合培養。混合培養在圓底96孔板內進行，每個比例設為三復孔。在培養的最后的12小時，每孔加入1μCi of[3H]-TdR。用夜閃計數儀(購于Wallac公司)測定[3H]-TdR摻入。結果表示為cpm平均值±SD。
結果發現，移植各組的GIC的數目存在明顯差別，保存液組單位移植心臟的GIC數目為5×105±1.2×105，明顯低于對照組和LacZ組的5×106±2.2×106，其比例約為1∶10～20左右。LacZ組和未轉染組的GIC以T淋巴細胞為主，CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例為4～5∶1，保存液組的移植物浸潤細胞(GIC)T細胞在浸潤細胞中的比例明顯下降。將不同組的移植物浸潤細胞(GIC)與γ射線(20Gy)滅活的供者來源的T淋巴細胞作72小時MLR，結果如圖3所示，保存液組的移植物浸潤細胞(GIC)增殖受到了明顯的抑制，AdmLacZ組和未轉染組的GIC顯示較強的對同種刺激的增殖活性。
測試例4保存液抑制移植物浸潤細胞(GIC)的同種細胞殺傷活性(CTL)將新鮮分離的移植物浸潤細胞(GIC)用作CTL效應細胞，小鼠EL-4淋巴瘤細胞(H-2b)用作同種抗原特異性靶細胞，小鼠P815乳腺瘤細胞(H-2d)用作同質對照靶細胞。靶細胞用100μCi的51Cr標記30分鐘后，作標準的4小時殺傷實驗。
結果如圖4所示，LacZ組和對照組的移植物浸潤細胞(GIC)對同種供者特異性細胞EL-4細胞有明顯殺傷活性，保存液組對EL-4表現輕度殺傷性能。
測試例5在本測試例中，按測試例1-4相同的方法，測試測試了實施例1、3-5中制備的器官移植保存液a、c、d、和e。
結果表明，器官移植保存液a、c、d、和e也具有明顯延長移植小鼠心臟存活時間的作用。
討論腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)是多功能細胞因子，具有廣泛的生物學活性。大量的研究證明，TNF-α幾乎參與炎癥反應的每一個階段，其效應者功能和機制是多方面的。TNF-α可以提高抗原提呈細胞(APCs)和血管內皮細胞表面的MHC分子及粘附分子的表達，TNF-α可以活化趨化因子，從而進一步活化單核細胞和巨嗜細胞及T細胞，引起淋巴細胞向炎性組織內遷移和浸潤。TNF-α對白細胞炎性組織組織內遷移和在正常次級淋巴組織器官內歸巢具有不可替代的作用。正常白細胞在所有組織內遷移必須有血液來源的TNF-α的作用，隨后組織內的趨化因子的產生依賴于組織細胞表達的TNFR-p55的信號傳導。近來的證據表明，TNF-α敲除動物的中樞系統炎癥模型中，MCP-1和MIP-1γ的產生是TNF-α存在的結果，使用抗TNF制劑治療肺炎，可以降低肺內MCP-1、MIP-2和MIP-1α的產生。新近的證據揭示TNF-α和TNFR-p55在外周免疫系統正常發育的優化中扮演重要的角色。TNF-α可視為T細胞自分泌的生長因子，可引起T細胞克隆擴增，同時也是樹突狀細胞活化和成熟因子。脾DC、T細胞和B細胞在脾臟內的發育正常也需要TNF-α/TNFR-p55通路的調節。
TNF-α是多能的前炎癥細胞因子，其生物學功能由存在于所有有核細胞膜表面的兩種TNF受體(TNFR1、2)所介導，即TNFR1(TNFR-p55)和TNFR2(TNFR-p75)。TNF-α可通過TNFR-p55的信號傳導誘導細胞毒活性。TNF-α/TNFR-p55通路已被證明在T細胞的同種反應活性方面具有重要的調控作用。在TNF-α基因敲除的同種小鼠間進行骨髓移植的研究中，發現缺少TNFR-p55的T細胞可以抑制和降低GVHD的發生。對TNF-α阻滯的體內精確機制的明晰有助于成功的開展TNF-α的拮抗治療。
與膜表面TNFR相對應，可溶性TNF受體(soluble TNF receptor，sTNFr)也存在兩種p55-sTNFr和p75-sTNFr，可溶性TNF-α受體(sTNFr-p55和sTNFr-p75)是體內TNF-α的天然抑制劑，可中和和阻滯TNF-α的作用，減輕TNF-α引起的進一步損傷。它們與多種疾病，如腫瘤、感染、自身免疫性疾病、移植排斥反應等的診斷和治療密切相關。
可溶性TNF受體(sTNFr)通過與TNF競爭結合，阻止TNF與細胞表面的TNFR結合，影響TNF與它們的膜結合受體的平衡，，從而競爭抑制TNF的多種生物學功能，參與機體的生理和病理過程。
sTNFr可阻止TNF與細胞表面的TNFR結合，拮抗、阻斷TNF的多種生物學活性。sTNFr對TNF的抑制作用可表現在多個方面在體外，能抑制TNF對腫瘤細胞株L929和WHEI164的細胞毒作用，顯著降低TNF誘導產生的PGE2和IL-1的水平；sTNFr對TNF的體內抗腫瘤作用也有抑制作用，例如給荷有Meth肉瘤的小鼠體內注射TNF的同時注射sTNFR，結果使TNF的抗腫瘤效果顯著降低。sTNFr的作用有劑量依賴性，高劑量時能顯著抑制TNF體外細胞毒作用。兩種類型的sTNFr對于TNF-α和TNF-β的拮抗效力存在差別，天然的和重組sTNFr對TNF-α的抑制作用顯著強于對TNF-β的作用。另外，兩種類型的sTNFr的作用存在差別。據觀察發現粒細胞缺乏小鼠經LPS誘導后，3小時左右血清中p75-sTNF水平明顯低于正常小鼠，但p55-sTNFr水平卻沒有變化；同時發現TNF的生物學活性增高，致死劑量的LPS引起的小鼠死亡率隨之顯著增高。這些結果提示，LPS誘導后小鼠血清中的p75-sTNFr主要來于中性粒細胞，在調節TNF的活性方面p75-sTNFr比p55-sTNFr似乎具有更重要的作用。在體內中性粒細胞是通過產生p75-sTNFr來調節TNF的生物學活性的。
有關sTNFr在移植排斥反應中的作用目前知之甚少，在同種異體移植中的效能尚未證明。但TNF與移植排斥反應的發生及進程密切相關。以往的動物實驗和臨床研究證明移植排斥發生時TNF水平顯著增高，并且參與排斥反應的發生發展。當排斥反應發生時，血清中sTNFr-p55、p75的血清水平明顯升高。研究表明，TNF-α在同種免疫應答反應中，可引起T淋巴細胞增殖，Th1型細胞因子生成，對宿主的組織細胞產生細胞毒(CTL)作用并加重系統損傷。TNF-α對TNFR-p55基因敲除小鼠的骨髓移植的研究表明，宿主體內缺乏TNFR-p55(TNFR-p55-/-)的T細胞的存在可以顯著減少GVHD的發病率和GVHD引起的宿主死亡。當排斥反應發生時，血清中sTNFr-p55、p75的血清水平明顯升高。因此，有人用sTNFr作為觀測指標用于移植排斥反應的監測及判斷預后。OKT3可應用于腎移植后的急性排斥反應治療，但可引發嚴重的毒副作用，部分與TNF的誘生有關。Drge SE等對發生急性排斥反應的腎移植患者應用OKT3治療時的sTNFr-p55、p75的血清水平進行了檢測，發現sTNFr-p55、p75的血清水平與OKT3的治療有相關性，但不影響患者毒副作用的發生。而Wee S則發現血清sTNFr的升高可降低腎移植患者接受OKT3治療時細胞因子釋放引起的綜合癥。TNF-α是引起同種排斥反應和移植物抗宿主病(GVHD)的組織損傷的重要因子之一，但TNF-α在T淋巴細胞針對同種抗原的免疫反應中的作用機制尚待闡明。骨髓移植的患者發生并發癥時，可見患者血清sTNFr水平明顯升高，與并發癥有明顯的相關性，提示其可作為骨髓移植并發癥發生時的監測指標。
在體外的混合淋巴細胞培養(MLR)時，加入TNFR融合蛋白(sTNFRFc)可抑制T淋巴細胞的增生及Th1型細胞因子的產生。在存在TNF-α抑制劑的情況下，可以抑制T細胞增生和IFN-γ的產生。中和TNF-α的作用可抑制移同種骨髓移植后的移植物抗白血病(GVL)效應。因此，可以認為阻斷TNF-α的作用可以潛在的抑制同種器官移植所引起的同種免疫應答反應中同種反應性T細胞的作用。sTNFr與移植排斥反應的關系尚須進一步加以研究。
細胞介素1(IL-1)是重要的前炎癥細胞因子，在激活免疫反應中具有重要作用。IL-1既是樹突狀細胞(DC)活化的危險信號，又是APC細胞遞呈抗原后活化T細胞的關鍵因子。可溶性IL-1受體(sIL-1R)是IL-1家族成員之一，是體內天然IL-1的拮抗劑。移植物抗宿主病為異源骨髓移植主要并發癥，有研究支持移植物抗宿主病是IL-1介導的，通過使用IL-1r拮抗劑抑制IL-1活性可能達到控制移植物抗宿主病的效果。McCarthy等研究表明患移植物抗宿主病的小鼠皮膚表達IL-1 alpha增強，通過使用IL-1r拮抗劑能不影響造血干細胞移植的情況下抑制免疫，降低死亡率。Antin等在I/II期臨床試驗中，對有類固醇抗性的、急性移植物抗宿主病的17例患者，使用重組的人IL-1r拮抗劑，患者病情隨用藥逐漸改善，唯一發現的毒性反應是2位患者轉氨酶發生可逆升高。
McCarthy等在I/II期臨床試驗中，對有糖(腎上腺)皮質激素抗性的、患(惡化或頑固)急性移植物抗宿主病的14例患者，使用rhuIL-1R(重組的人IL-1受體)，57％的患者(8位)經過治療后病情改善，沒有患者產生毒性反應。
器官離體后，隨著氧供的停止可以引發由超氧離子、自由基和一氧化氮分子和一系列前凋亡事件介導的細胞和組織的降解。在器官保存液(例如UW液或EuroCollins液)的環境下，器官對損傷仍然敏感，初發損傷是引起急慢性排斥反應的重要因素之一。器官再灌注可以引起進一步的損傷，趨化炎性細胞浸潤至損傷位點。內皮細胞是缺血再灌注的極其敏感的早期靶目標。缺血再灌注(IRI)的機制包括前炎性細胞因子在炎性位點的釋放和中性粒細胞的浸潤。前炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β和激活的補體可趨化中性粒細胞，重組IL-1和TNF-α可模擬內毒素刺激的肝損傷，TNF-α抗體可防止小鼠肝內白細胞浸潤。這一現象也可見于人小腸的再灌注時或大鼠腎移植的慢性排斥反應。IL-1受體拮抗蛋白IRAP可阻滯IL-1和其受體的結合，可顯著降低內毒素釋放、白細胞與內皮的粘附及組織損傷。因此，基因修飾供者器官應用于器官的保存和抗移植排斥將是器官移植領域中另一重要的研究方向。
本發明的上述實驗結果證明了，采用攜帶sIL-1R和sTNFR基因腺病毒作為活性成分的器官移植保存液，具有延長移植物存活時間、減輕宿主抗移植物和移植物抗宿主反應的顯著作用。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種器官保存液，其特征在于，它含有以下組分(a)30-300ug/L的可溶性TNF受體或TNF拮抗劑，或者1×109-1014PFU/升表達可溶性TNF受體或TNF拮抗劑的載體，按保存液的總體積計；(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑，或者1×109-1014PFU/升表達可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑的載體，按保存液的總體積計；以及(c)藥學上可接受的稀釋劑。
2.如權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液含有(a)30-300ug/L的可溶性TNF受體或TNF拮抗劑，按保存液的總體積計和(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑，按保存液的總體積計。
3.如權利要求1所述的保存液，其特征在于，它含有以下組分(a)1×1010-1013PFU/升表達可溶性TNF受體或TNF拮抗劑的載體，按保存液的總體積計；(b)1×1010-1013PFU/升表達可溶性IL-1受體或IL-1拮抗劑的載體，按保存液的總體積計。
4.如權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的載體選自下組真核表達載體和重組病毒載體。
5.如權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的重組病毒載體是選自下組的載體重組腺病毒、逆轉錄病毒、重組痘苗病毒、單純皰疹病毒。
6.如權利要求1所述的保存液，其特征在于，它還含有選自下組的一種或多種添加劑(d1)9±0.5克 NaCl；(d2)20-200克白蛋白；(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素選自青霉素、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、先鋒霉素；(d4)25mmol/LKH2PO4；(d5)5mmol/LMgSO4；(d6)30mmol/L棉糖；(d7)3mmol/L谷胱甘肽；(d8)1mmol/L別嘌呤醇；(d9)50g/L羥乙基淀粉。
7.如權利要求1所述的器官保存液的用途，其特征在于，用于保存待移植的器官和組織。
8.一種保存待移植用器官或組織的方法，其特征在于，包括步驟將權利要求1所述器官保存液通過動脈灌注于待移植器官或組織，和/或將待移植器官或組織在該保存液中浸泡1小時-10天。
9.一種權利要求1所述的器官保存液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟混合以下各組分，按1升保存液計算(a)1×109-1014PFU表達可溶性TNF受體的重組腺病毒；(b)1×109-1014PFU表達可溶性IL-1受體的重組腺病毒；(c)藥學上可接受的稀釋劑；從而制得保存液。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的組分還包括選自下組的一種或多種(d1)9±0.5克 NaCl；(d2)20-200克白蛋白；(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素選自青霉素、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、先鋒霉素；(d4)25mmol/LKH2PO4；(d5)5mmol/LMgSO4；(d6)30mmol/L棉糖；(d7)3mmol/L谷胱甘肽；(d8)1mmol/L別嘌呤醇；(d9)50g/L羥乙基淀粉。
全文摘要
本發明提供一種器官保存液及其制法和用途，該保存液含有可溶性TNF受體及可溶性IL－1受體或者表達所述受體的載體。應用該保存液可以有效降低器官移植過程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反應，延長移植物的存活時間，提高移植物再宿主體內的存活率，因而可有效地應用于器官移植，包括腎、肝、心臟等重要臟器的移植。
文檔編號A01N1/02GK1742574SQ20041005417
公開日2006年3月8日 申請日期2004年9月1日 優先權日2004年9月1日
發明者王建莉, 萬濤, 王青青, 曹雪濤 申請人:浙江大學