專利名稱：器官玻璃化冷凍保存液的制作方法
技術領域：
腎臟是人體中機能復雜的器官，在4°C灌注條件下只能離體保存最多50小時。要長期甚至永久保存腎臟，必須進一步降低保存溫度，抑制組織細胞的代謝率，甚至使細胞代謝完全停止。腎臟如能在合適的冷凍條件下長期保存，在需要時將冷凍保存的供腎采用合適的手段“復蘇”后再移植，將為臨床移植工作開辟一個嶄新的前景。冷凍保存方法被認為是實現器官長期保存的理想途徑，問題的關鍵是器官體積較大，在降溫和復溫過程中很難克服細胞內外冰晶形成，同時不能避免機械、化學、 滲透壓以及生物學方面的損傷，所以至今較大體積器官的凍存問題仍未解決。玻璃化 (Vitrification)是指液體轉變為非晶態(玻璃態)的固化過程。玻璃態固體分子之間的關系和液態無明顯區別，在降溫冷凍過程中不形成冰晶，因而是一種理想的冷凍保存途徑。
背景技術：
近期以來，冷凍保存細胞、精子、胚胎甚至卵巢組織已先后取得成功，但是復雜器官如腎臟的冷凍保存，卻依然是個尚未突破的難題。當今世界，隨著腎臟移植技術的迅速發展和腎病患者數量的不斷增加，迫切需要大量的腎臟貯備和供應。目前臨床移植用供腎均在0°C以上保存，此方法雖然比較成熟、簡便，但保存時間十分有限。雖然國內外學者從改進保存液水平及保存工具等方而著手延長腎臟保存時間，或在有限的保存時間內完善組織配型工作，以提高供腎的合理使用率和移植后的長期存活率，但仍不能滿足臨床需求。此外， 在國內供體器官缺少的情況下，由于配型、病人條件不符和地域等原因也會造成一定的器官資源浪費。能否在一個國家乃至整個世界范圍內共享人白細胞抗原(HLA)配型吻合的腎臟，使每一個受者都能及時得到最優化的供腎？對于這樣理想化的愿望，只有通過改進腎臟保存技術，延長供腎保存時間至數月甚至數年，并建立“器官庫”(Organ Bank)才能最終實現。
發明內容
本發明所述器官玻璃化冷凍保存液，由二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份組成，二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖濃度均為 0. l-6mol/L，聚乙二醇濃度為l-20mmol/L，PH值范圍為5. 0-8. 0。玻璃化冷凍保存液在降溫冷凍過程中溶液呈玻璃態，不形成冰晶，避免或減少細胞的冰凍損害，可保護細胞結構和形態的完整性，同時完全抑制組織細胞的能量代謝。經合適的手段復蘇后細胞代謝活動得到恢復，可重新發揮生物學功能。本發明所述器官玻璃化冷凍保存液，可用于腎臟的冷凍保存(-200--30°C)，也可應用于其他器官(肝臟、心臟等)的長期冷凍保存。
具體實施例方式將經本發明所述器官玻璃化冷凍保存液灌注腎臟，降溫至_80°C，轉入深低溫冰箱或液氮長期保存。器官復蘇時升溫至4°C，洗脫保存液后進行相關形態學和功能學檢查。
通過本發明所述器官玻璃化冷凍保存液在-80°C保存2周的新西蘭大白兔腎臟， 大體形態未見明顯冰凍損害，皮髓質結構清晰，光學顯微鏡下腎小球內毛細血管襻完整，腎小管上皮細胞輕微腫脹，電子顯微鏡下腎小球濾過膜、足細胞和系膜細胞等超微結構清晰， 細胞核染色質濃密，胞質內細胞器數目正常，上皮細胞腔面刷狀緣微絨毛排列整齊，血管內皮細胞及彈性膜完整，顯示腎臟經冷凍保存后組織形態未見明顯破壞。通過本發明所述器官玻璃化冷凍保存液在-80°C保存2周的新西蘭大白兔腎臟， 離體灌注后進行酚紅排泌試驗(PSP試驗)、靛胭脂實驗測定腎小管功能，PSP15分鐘和120 分鐘排泌量，均接近正常值(25% ；55% )，靛胭脂灌注后即刻見到藍色尿液排出，顯示腎臟經冷凍保存后腎小管具有排泌功能。通過本發明所述器官玻璃化冷凍保存液在-80°C保存2周的比格犬腎臟，自體腎移植術后1個月進行彩色多普勒超聲、發射單光子計算機斷層掃描(ECT)和靜脈分泌造影 (IVP)等檢查，彩超可見移植腎臟內血流通過，IVP和ECT顯示腎臟分泌/濾過功能持續存在。
權利要求
1.一種器官玻璃化冷凍保存液，其特征在于，包含二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、 丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份。
2.根據權利要求1所述的保存液，其特征在于，二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖濃度均為0. l-6mol/L，聚乙二醇濃度為l-20mmol/L，PH值范圍為5. 0-8. 0。
3.根據利權要求1所述的保存液，其特征在于，保存溫度為-200-30攝氏度。
4.根據權利要求1至3任一所述的保存液，其特征在于所述的器官為腎臟、肝臟、心臟、 肺臟、皮膚或者肢體等。
5.一種器官保存方法，包括將器官放入保存液中，其特征在于，所述保存液中包含二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份。
6.根據權利要求5所述的保存方法，其特征在于，將器官進行玻璃化冷凍保存。
全文摘要
本發明涉及醫學器官保存領域，具體公開了用于器官長期保存的玻璃化冷凍保存液，其特征在于該保存液由二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份組成，二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖濃度均為0.1-6mo/L，聚乙二醇濃度為1-20mmol/L，pH值范圍為5.0-8.0。實施按照本發明提供的用于器官保存的玻璃化保存液，在降溫冷凍過程中呈玻璃態不形成冰晶，保護組織形態和結構完整性，在冷凍條件下完全抑制組織細胞的能量代謝，復蘇后恢復其生物學功能，可用于腎臟的冷凍保存，也可進一步推廣應用于其他器官的長期冷凍保存，供科研和臨床應用。
文檔編號A01N1/00GK102550541SQ201010601358
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者劉迪, 潘峰 申請人:劉迪, 潘峰