細小裸藻的ter基因的制作方法

專利名稱：細小裸藻的ter基因的制作方法
概述本發明涉及核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的用途，當所述核苷酸序列表達時可增加轉基因生物體產生的脂類總量(如三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸)。
更加具體而言，本發明描述了細小裸藻(Euglena gracilis)來源的編碼反-2-烯酰CoA還原酶(TER-E.C.1.3.1.44)的核苷酸序列SEQ ID NO1的鑒定。
在另一個實施方案中，本發明指向了包含如SEQ ID NO2、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所顯示的氨基酸序列的蛋白質或其功能性片段、衍生物、變體或直向同源物。
本發明還包括如SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8或SEQ ID NO10所顯示的核酸序列，同樣也包括其基因組序列、cDNA序列、等位基因變體、合成變體及突變體部分。這些序列包括能用作探針、轉化用載體或克隆中間體的序列。
SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQID NO11是可讀框SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8或SEQ ID NO10的推導氨基酸序列。
本發明的另一方面涉及那些與SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有至少60％同一性的多肽。
本發明進一步涉及用于在植物、優選在植物種子表達編碼TER基因的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的表達構建體、表達TER基因的轉基因植物以及所述轉基因植物用于生產食物、飼料、種子、藥物制劑或精細化學藥品、具體而言用于生產油類的用途。
在油料作物如油菜、向日葵、油棕櫚等中，油(即三酰甘油)是種子或果實中最有價值的產物，而其它化合物如淀粉、蛋白質和纖維則被認為是價值較小的副產物。因此，在油料作物中，以其它化合物為代價提高基準重量的脂類數量將增加農作物的價值。如果將促進還原碳分配進入脂類產物的蛋白質通過過表達上調，則細胞在消耗其它產物的情況下將積累更多的脂類。此方法不僅能用來提高已經為油類高產生物例如油料作物中的脂類含量，而且還可以導致在中等或低含油量農作物如大豆、燕麥、玉米、馬鈴薯、甜菜和蕪箐以及微生物中產生相當量的脂類產物。
增加植物中、特別是植物種子中的脂類含量，對于傳統和現代植物的種植、尤其對于植物生物技術具有很大的價值。由于用于營養或工業應用的植物油消耗的增加，增加或改善蔬菜油類的可能性日益成為當前研究的目標(例如Tpfer等人(1995)Science 268681-686)。其目的特別是增加種子油類中的脂肪酸含量。
從植物油中獲得的脂肪酸也具有特殊的價值。例如，它們可用作增塑劑、潤滑劑、表面活性劑、化妝品等等的主要成分，而且用作食品和飼料工業中有價值的主要成分。因此，例如，既然在生產表面活性劑特別需要具有中等鏈長度脂肪酸的菜籽油，那么提供此種菜籽油具有特殊的價值。關于醫學方面，許多種子油類中的長鏈脂肪酸(18碳及更長)與高膽固醇血癥或與冠心病相關的其它臨床病癥的降低有聯系(Brenner 1976，Adv.Exp.Med.Biol.8385-101)。因此，食用脂肪酸水平增加的此類植物可以減少患心臟病的危險。種子油類含量水平的提高也大規模地增加種子油類的產量，并因此降低此種油類的成本。
通過重組方法對植物代謝途徑進行靶向調節，能夠以有利的方式對植物代謝進行修飾，當使用傳統種植方法時只有在復雜過程之后才能實現此種代謝或者根本無法實現此種代謝。因此，稀有脂肪酸，例如特殊的多不飽和脂肪酸，只在特定植物中合成或者在植物中根本不合成，因此其只能在轉基因植物中通過表達相關基因產生(例如Millar等人(2000)TrendsPlant Sci 595-101)。
三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和其它脂類從脂肪酸合成。脂肪酸的生物合成和三酰甘油的生物合成由于區室化作用被認為是各自獨立的生物合成途徑，但考慮到終產物它們被認為是單一生物合成途徑。脂類合成可被分成兩部分機制，一種可稱為“原核”機制而另一種稱為“真核”機制(Browse等人(1986)Biochemical J 23525-31；Ohlrogge和Browse(1995)Plant Cell 7957-970)。原核機制定位于質體并且包括游離脂肪酸的生物合成，游離脂肪酸輸出至胞質溶膠，并在其中以脂肪酸酰基輔酶A酯的形式進入真核機制。在此途徑中，脂肪酸分別被甘油-3-磷酸酰基轉移酶和溶血磷酯酸酰基轉移酶在3-磷酸甘油sn-1和sn-2位置上發生酯化產生磷脂酸(PA)。PA是其它極性和中性脂類的前體，后者在Kennedy途徑中形成(Voelker 1996，Genetic Engineering編者Setlow 18111-113；Shanklin和Cahoon 1998，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49611-641；Frentzen 1998，Lipids 100161-166；Millar等人2000，TrendsPlant Sci.595-101)。
已經表明三酰甘油合成的最后一步通過兩種不同的酶促反應進行，它們是由酰基輔酶A二酰甘油酰基轉移酶催化的酰基輔酶A依賴性反應(Cases，S等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 95，13018-13023；Lardizabal，等人，2001)和由磷脂二酰甘油酰基轉移酶催化的酰基輔酶A非依賴性反應(Dahlqvist等人，2000)。
在高等植物中，蠟酯由從質體輸出的脂肪酸及其衍生物、特別是非常長鏈脂肪酸及其衍生物合成(Dusty Post-BeittenmillerBiochemistry andmolecular biology of wax production in plants.在Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.(1996)；編者Jones，R L.，第47卷，第405-430頁)。
當細小裸藻在厭氧條件下生長時產生蠟酯。將裸藻從需氧條件轉移至厭氧條件，導致在消耗儲備多糖副淀粉的情況下快速形成蠟酯。蠟酯的厭氧形成伴隨著ATP的凈合成(Inui，H.等人(1982)FEBS Lett.15089-93)，照此此現象稱為蠟酯發酵。
脂肪酸在裸藻中合成的四種系統已有描述1)包括胞質溶膠中的多功能脂肪酸合成酶，2)葉綠體中的酰基-載體-蛋白質依賴系統和3)包括微粒體中的脂肪酸合成酶(Kitaoka，S.(1989)Enzymes and their functionallocation.第2-135頁，在D.E.Buetow編，The biology of Euglena，第4卷.Subcellular biochemistry and molecular biology.Academic Press，SanDiego)。
此外，發現了第4種新系統(見


圖1)發現在細小裸藻的線粒體中，脂肪酸的從頭合成系統不同于胞質溶膠中的系統(FAS I)和葉綠體中的系統(FAS II)(Inui等人.1982，1984)。此反應是用反2-烯酰輔酶A還原酶(TER)(E.C.1.3.1.44)取代降解系統中的酰基輔酶A脫氫酶的脂肪酸β-氧化機制的逆過程(Inui，H.等人Eur.J.Biochem.142(1984)121-126)。既然反2-烯酰輔酶A還原酶(TER)催化循環的最后一步并產生終產物脂肪酰輔酶A，那么它是該脂肪酸生物合成途徑的關鍵酶。盡管Inui和同事測定了TER的酶活性而且實現了蛋白質的部分純化，但沒有得到蛋白質序列。由于沒有關于肽和核苷酸序列的信息，關于此酶的多肽鏈、基因和mRNA仍然未知。到目前為止，在任何其它生物體中沒有描述具有此種功能的酶。
本發明的目標是提供增加植物中脂類含量的另外的方法。
我們已經發現通過本發明實現了此目標。
本發明中顯示，細小裸藻中存在多核苷酸SEQ ID NO1、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10，并且當在植物中過表達時可增加三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸在植物中積累的數量。
如實施例1所描述，對來自細小裸藻Z株的反-2-烯酰CoA還原酶(TER)進行生物化學純化。進行一系列層析純化步驟，見表4。這些步驟包括離子交換層析(DEAE-Fraktogel)、疏水性相互作用(phenylsapharose)、親和層析(Reaktive Red 120)和羥磷灰石色譜法。相應的純化水平見表4。而且，完備的純化方案還包括另外的離子交換層析(Mono Q)，經制備型凝膠純化以及通過Superdex 200的最終凝膠過濾。此方案達到1600倍以上的純化。當使用標準方法進行SDS-PAGE時，最終的酶制劑顯示為在44kDa左右非常接近的一條主帶和一條細的次帶，見圖2。如Inui和同事所描述(Inui等人，1984)測定酶活性，并且活性與上面的主帶相關。
從凝膠中分別切下主帶和次帶，并根據標準方法用胰蛋白酶消化。從凝膠中提取所得到的肽并根據標準方法用ESI-Q-TOF MS/MS分析。表明兩個條帶產生了完全一樣的肽，這證實與Inui和同事的描述(Inui，H.等人，(1986)J.Biochem.100995-1000)相比，TER作為單一亞單位酶被完全純化。
按照實施例2所描述的方法從細小裸藻細胞中分離出RNA。
如實施例3所描述構建細小裸藻的cDNA文庫。
使用ExAssist輔助噬菌體通過體內切除從cDNA庫產生pBluescript噬菌粒(phagemides)用于進一步分析。
根據這些肽(見實施例4)設計簡并引物，并以cDNA作為模板進行PCR。使用下面的引物擴增出一個837bp的片段5’-GGITGGTAYAAYACIGTIGC-3’(參照肽7)和5’-GTYTCRTAICCIGCRAARTC-3’(參照肽9)。將此片段克隆入pBluescript SK+/HincII并進行測序(SEQ ID NO3)。所翻譯序列包括純化蛋白質的幾種肽，因此837bp片段用作雜交探針來篩選由裸藻細胞的mRNA構建的cDNA文庫。篩選250,000個重組噬菌體后產生了6個獨立克隆。cDNA插入片段的變化范圍在1600bp和1900bp之間。對所有6個克隆從兩端測序表明所有克隆代表同一轉錄本，而僅在長度上有所變化。最長的克隆經核酸外切酶III刪除進行雙鏈完全測序。此克隆長1912bp，并且包含可編碼539個氨基酸的1620bp的可讀框(SEQ ID NO1和SEQID NO2)。在克隆兩端具有含NotI和EcoRI限制性酶切位點的接頭，并將該克隆插入載體pBluescript SK+的EcoRI位點，見圖3。
使用EcoRI從pBluscript SK+釋放此克隆。使用綠豆核酸酶(Roche)根據廠商提供的方法去除5’懸突，并使用標準方法與雙元載體pSUN 300或ST593進行鈍末端連接。
從細小裸藻TER在大腸桿菌(E.coli)中的表達研究結果(見實施例6)可以認為cDNA克隆的N-末端部分構成了線粒體靶向信號，必須切除該靶向信號以產生成熟的活性TER蛋白質。盡管如此仍不能排除cDNA克隆的N末端部分構成跨膜結構域的可能性。該可能的跨膜結構域在細小裸藻TER的純化過程中可能會丟失(見實施例1)。如果在大腸桿菌中表達，此結構域由于錯誤卷繞或缺少膜連接可能破環使用C4-底物進行的活性測定(見實施例1)。
本發明的第一個主旨包括增加植物生物體或者組織、器官、部分、細胞或其繁殖材料中總脂類含量的方法，所述方法包括a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10在上述植物生物體或組織、器官、部分、細胞或其繁殖材料中的轉基因表達，和b)選擇植物生物體，其中與起始生物體對比或相比總脂類含量在上述植物生物體或組織、器官、部分、細胞或其繁殖材料中有所增加。
產生與SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所顯蛋白質作用相同的其它蛋白質可從本文提供的特異性序列獲得。而且，很明顯人們能夠獲得天然的和合成的TER，包括那些具有修飾氨基酸序列的TER以及用于人工樣式蛋白質的起始物質，所述人工樣式蛋白質是從例證性TER和從使用此種例證性序列得到的TER得到的。經修飾氨基酸序列包括已經突變、截短、增加等等的序列，而不管此序列是否是部分或完全合成的。
另外，來自本發明SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8或SEQ ID NO10的核酸探針(DNA或RNA)可用來篩選和回收多種植物和微生物來源的同源序列或相關序列。
SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQID NO10在酵母或植物中過表達會增加總脂類的含量，并且與野生型酵母或植物相比還能提高所積累的三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸的量。
本發明的特征在于以下方面實施例1描述了反-2-烯酰CoA還原酶從細小裸藻中的生物化學純化。
實施例2描述了從細小裸藻細胞中分離總RNA和poly-(A)+RNA。
實施例3描述了細小裸藻cDNA文庫構建。
實施例4描述了通過相應cDNA的肽指紋和亞序列克隆鑒定TER蛋白質序列。
實施例5描述了三酰甘油在表達TER基因的酵母細胞中的積累。
實施例6描述了反-2-烯酰CoA還原酶在大腸桿菌中的功能性表達。
實施例7描述了用于在擬南芥(Arabidopsis)中過表達的TER構建體。
實施例8描述了用于植物轉化的質粒。
實施例9描述了擬南芥的轉化。
實施例10描述了轉基因植物中TER基因功能的體外分析。
實施例11描述了過表達TER基因的轉基因擬南芥植物中的脂類含量。
實施例12描述了基于序列比較的反烯酰活性的氨基酸特點。
本發明的特征還有編碼蛋白質SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9或SEQ ID NO11的核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的用途，所述序列能增加三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸的產量；具有上述序列的產油生物體的遺傳轉化以便在該生物體中表達，得以產生可增加生物體中脂類含量的活性蛋白質。
核苷酸序列來自SEQ ID NO1中所顯示的細小裸藻TER基因(基因組克隆或cDNA)的序列，或者來自包含這樣一種核苷酸序列的核酸序列或cDNA，其中所述核苷酸序列編碼具有與SEQ ID NO2中所示氨基酸序列具有60％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白質。
我們稱作反-2-烯酰CoA還原酶(TER)的基因產物不能自我催化三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂和/或蠟酯的合成，但是它的存在可增加所合成脂肪酸的數量。
本發明涉及包含本發明所述核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的基因構建體，其與異源核酸有效連接。
術語“有效連接”指如啟動子、編碼序列、終止子和/或更多調控元件的一系列組織，由此每一元件能夠在核苷酸序列表達過程中實現其最初功能。
另外，本發明考慮了包含本發明的所述核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的載體。載體還包括含有選擇標記基因和/或用于在宿主細胞中復制和/或整合到宿主細胞基因組中的核酸序列的表達載體。
此外，本發明涉及經細胞內構建體表達而在宿主細胞或其后代(包括遺傳工程化油類種子、酵母和霉菌或任何其它積累油類的生物體)中產生由核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所編碼TER的方法。特別感興趣的是，本發明的核苷酸序列從優選在植物種子組織中表達的轉錄起始區表達。進一步考慮合成編碼TER的人造基因序列，特別是提供植物優選密碼子。由于TER編碼序列的表達而包含TER的轉基因細胞也考慮在本發明的范圍內。
另外，本發明涉及包含所述核苷酸序列和/或所述基因構建體和/或所述載體的轉基因細胞或生物體。本發明的進一步目標是真核細胞或真核生物體的轉基因細胞或生物體。優選地，轉基因細胞或生物體是酵母細胞、植物細胞或植物。本發明還涉及具有增強的用于三酰甘油合成所用底物產生的生物合成途徑的所述轉基因細胞或生物體。具有增加的脂類含量的轉基因細胞或生物體也考慮在本發明的范圍內。
再者，本發明涉及轉基因細胞或生物體，其中由核酸序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所編碼TER的活性在所述細胞或生物體中是增加的。TER活性的增加以基因表達、催化活性和/或酶活性調節的改變為特征。而且，本發明包括轉基因細胞或生物體，其中用于三酰甘油合成所用底物產生的增強的生物合成途徑是以例如增加的脂肪酸生物合成代謝前體的供應為特征。
在不同的實施方案中，本發明還涉及使用核酸序列SEQ ID NO1、SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10增加不同生物體細胞中脂類含量的方法。
此外，本發明使提高三酰甘油產量的方法成為可能，其包括在核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10表達的情況下使轉基因細胞或生物體生長，以便在這些細胞中產生TER蛋白質從而使三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸產量增加。
編碼TER的相應基因可以從其它生物體，特別是從裸藻門、裸藻目、裸藻屬和/或裸藻亞屬、Calliglena亞屬或Discoglena亞屬中分離。屬于Calliglena亞屬的種例如血紅裸藻(Euglena sanguinea)、易變裸藻(Euglenamutabilis)、潔凈裸藻(Euglena clara)、Euglena velata、敏捷裸藻(Euglenaagilis)、尾裸藻(Euglena caudate)、多形裸藻(Euglena polymorpha)、顆粒裸藻(Euglena granulata)、Euglena rostrifera、Euglena repulsans、Euglenaanabaena和Euglena satelles。屬于裸藻亞屬的種例如綠裸藻(Euglenaviridis)、Euglena stellata、膝曲裸藻(Euglena geniculata)、三星裸藻(Euglenatristella)和Euglena chadefaudii。屬于Discoglena亞屬的種例如梭形裸藻(Euglena acus)、Euglena texta、三棱裸藻(Euglena tripteris)、靜裸藻(Euglena desces)、尖尾裸藻(Euglena oxyuris)、旋紋裸藻(Euglenaspirogyra)、Euglena helicoidea、近軸裸藻(Euglena proxima)和帶形裸藻(Euglena ehrenbergii)。
編碼TER的相應基因可以從密切相關的的屬如柄裸藻屬(Colacium)、變體裸藻屬(Eutreptia)、Eutreptiella、扁裸藻屬(Phacus)、鱗孔藻屬(Lepocinclis)、雙板藻屬(Cryptoglena)、囊裸藻屬(Trachelomonas)、陀螺藻屬(Strombomonas)、囊胞藻屬(Ascoglena)、Klebsiella、變胞藻屬(Astasia)、桿胞藻屬(Rhabdomonas)、弦月藻屬(Menoidium)、袋鞭藻屬(Peranema)、異鞭藻屬(Anisonema)、Tetreutreptia、Hyalophacus、克氏藻屬(Khawkinea)、多形藻屬(Distigma)、Cyclidiopsis、內管藻藻(Entosiphon)、Ploeotia、螺肋藻屬(Gyropaigne)、Notoselenus、瓣胞藻屬(Petalomonas)、Parmidium中分離。
本發明還涉及在其基因組或質體中包含根據上面由重組DNA技術轉移的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的轉基因生物體。本發明涵蓋的一種重要類型的轉基因生物體是其中所述核酸序列優選在貯藏器官特異性啟動子控制下表達的商業相關植物。備選地，核酸序列也可以在種子特異性啟動子控制下表達，或在適于在植物中進行組織特異性高水平表達的任何其它啟動子控制下表達。
本發明還涉及由SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8或SEQ ID NO10的DNA分子所編碼的蛋白質，或在轉基因生物體中具有TER活性的其功能性生物學活性片段。備選地，本發明涉及在生物體中產生的蛋白質，所述生物體具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所示氨基酸序列或者與具有TER活性的所述氨基酸序列具有至少60％同源性的氨基酸序列。
如實施例1所述，可從細小裸藻分離蛋白質，但也可以從其他生物體中分離。
TER可通過本技術領域眾所周知的多種方法從植物材料中回收。在從植物器官中分離種子貯藏化合物之前，從其它組織或器官機械分離出植物器官。將組織勻漿之后，離心去除細胞碎片，保留含有可溶性蛋白質片段的上清液部分以備進一步純化目的化合物。如果產物從培養基中生長的細胞中分泌，則通過低速離心從培養基中去除細胞，然后保留上清液部分以備進一步純化。
將從任何一種純化方法獲得的上清液部分用適宜樹脂進行色譜分析，其中目的分子保留在色譜樹脂上而樣品中的許多雜質則不保留，或者雜質保留在樹脂上而樣品不保留。如有必要，可以使用相同的或不同的色譜樹脂重復此種色譜分析步驟。本技術領域中的技術人員非常精通適宜色譜樹脂的選擇以及它們對于待純化特殊分子的最有效應用。純化產物可通過過濾或超濾濃縮，并于產物穩定性最佳的溫度下保存。
已有本技術領域中已知的大量純化方法，前述純化方法并不意味著是限制性的。此類純化技術描述于例如Bailey J.E.和Ollis D.F.1986，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-HillNew York。本文描述的用于從細小裸藻進行純化的純化方法可以作為范例，并且此方法容易被本技術領域中的那些技術工人應用于其它生物體。
所分離化合物的鑒定和純化可通過本技術領域中的技術標準進行評定。這些技術包括高效液相色譜(HPLC)、光譜學方法、染色方法、薄層層析法、分析型色譜法如高效液相色譜、NIRS、酶分析法或微生物學方法。此類分析方法綜述于Patek等人(1994，Appl.Environ.Microbiol.60133-140)、Malakhova等人(1996，Biotekhnologiya 1l27-32)和Schmidt等人(1998，Bioprocess Engineer 1967-70)、Ulmann工業化學百科全書(1996，第A27卷，VCHWeinheim，第89-90頁，第521-540頁，第540-547頁，第559-566，575-581頁和第581-587頁)和Michal G.(1999，BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wileyand Sons；Fallon，A.等人，1987，Applications of HPLC in Biochemistry在Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷)。
本發明此外還涉及根據SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的蛋白質或具有TER活性從而增加三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸產量的蛋白質衍生物的用途。
意外發現細小裸藻TER基因的異源性表達導致如實施例11所述的擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)種子中三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸含量(貯藏油)的顯著增加。與野生型對照植物相比脂類含量增加了5％左右，在一個轉基因系中甚至增加了10％。編碼TER蛋白質的核酸序列的過表達對于轉化植物的生長或其它特性沒有不利影響。
根據本發明的方法除了應用于模式生物擬南芥菜之外，在理論上還可應用于所有植物種類。根據本發明的方法優選應用于天然油類含量已經很高和/或用于工業生產油類的脂類農作物。
植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料通常被理解為同樣能夠進行光合作用的任何單細胞或多細胞生物體或者細胞、組織、器官、部分、細胞或繁殖材料(如種子和果實)。為了本發明的目的，包括植物界中高等植物和低等植物的所有屬和種。優選一年生植物、多年生植物、單子葉植物和雙子葉植物。還包括成熟植物、種子、芽和幼苗、部分、繁殖材料(例如塊莖、種子或果實)以及來源于它們的培養物，例如細胞培養物或愈傷組織培養物。
植物包括所有一年生和多年生的單子葉植物或雙子葉植物，并且以實例的方式包括但不限于南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、核桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、Solarium、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、菊苣屬(Cichorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、Panieum、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、蛾蝶花Salpiglossis、香瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍屬(Zea)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)、云杉屬(Picea)和楊屬(Populus)的植物。
優選的植物是來自下列科的植物莧科(Amaranthaceae)、Asteraceae、蕓苔科(Brassicaceae)、Carophyllaceae、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、蝶形花亞科(Papilionoideae)百合科(Liliaceae)、亞麻科(Linaceae)、錦葵科(Malvaceae)、薔薇(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、番苦木科(Tetragoniaceae)、山茶科(Theaceae)、傘形科(Umbelliferae)。
優選的單子葉植物特別是選自單子葉的農作物植物，例如禾本科(Gramineae)，諸如稻、玉米、小麥或其它谷類物種如大麥、粟和高梁、黑麥、黑小麥或燕麥，以及甘蔗和所有草本物種。
本發明非常特別優選應用于雙子葉植物生物體。優選的雙子葉植物尤其選自例如下列的雙子葉農作物植物-Asteraceae科如向日葵(Heliantus annuus)、萬壽菊或金盞花和其它，-菊科，特別是萵苣屬，非常特別的是萵苣(sativa)和其它，-十字花科，特別是蕓苔屬，非常特別是歐洲油菜(napus)(油料種子油菜)、蕓苔油菜(campestris)(甜菜)、oleracea cv Tastie(甘藍)、oleracea cvSnowball Y(花椰菜)和oleracea cv Emperor(花莖甘藍)以及其它甘藍；和擬南芥屬，非常特別是擬南芥菜(thaliana)以及水芹或蕓苔和其它，-葫蘆科如甜瓜、西葫蘆/南瓜或胡瓜和其它，-豆科，特別是大豆屬，非常特別是大豆(max)、黃豆和紫苜蓿、豌豆、豆類(beans)或花生以及其它，-茜草科，優選Lamiidae亞類如小果咖啡(Coffea arabica)或大果咖啡(Coffea liberica)(咖啡叢(coffee bush))和其它，-茄科，特別是番茄屬，非常特別是番茄(esculentum)(西紅柿)、茄屬(Solanum)，非常特別是馬鈴薯(tuberosum)(土豆)和茄(melongena)(茄子)以及辣椒屬，十分特別是辣椒(annuum)(胡椒)和煙草或紅辣椒以及其它，-梧桐科，優選Dilleniidae亞類，例如可可樹(Theobroma cacao)和其它，
-山茶科，優選Dilleniidae亞類，例如大葉茶(Camellia sinensis或Theasinensis)(茶樹)以及其它，-傘形科，特別是胡蘿卜屬(非常特別是胡蘿卜(carota))和芹菜屬(Apium)(非常特別是旱芹(graveolens dulce)(celeary))以及其它；和亞麻子、棉花、大麻、亞麻、黃瓜、菠菜、胡蘿卜、甜根菜(sugar beet)和各種各樣的樹、堅果和葡萄藤種類，特別是香蕉和獼猴桃。
也包括觀賞植物、有用的或觀賞性的樹、花、鮮切花、灌木或草坪植物，其以實例的方式包括但不限于被子植物、苔蘚類植物如苔綱(Hepaticae)(地錢)和蘚綱(Musci)(苔蘚)；蕨類植物如蕨類、木賊和石松；裸子植物如松柏、蘇鐵、銀杏和Gnetatae；藻類如綠藻綱(Chlorophyceae)、褐藻綱(Phaeophpyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、粘藻綱(Myxophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae)、硅藻綱(Bacillariophyceae)(硅藻)和裸藻綱(Euglenophyceae)。本發明范圍內的植物以實例的方式包括但不限于薔薇科如玫瑰、杜鵑花科如杜鵑花(rhododendron和azalea)、大戟科(Euphorbiaceae)如猩猩木和巴豆、石竹科(Caryophyllaceae)如石竹、茄科如矮牽牛、苦苣苔科(Gesneriaceae)如非洲紫羅蘭、鳳仙花科(Balsaminaceae)如鳳仙花、蘭科(Orchidaceae)如蘭花、鳶尾科(Iridaceae)如唐菖蒲、鳶尾、香雪蘭和番紅花、菊科如萬壽菊、牻牛兒苗科(Geraniaceae)如天竺葵、百合科如龍血樹、桑科(Moraceae)如無花果、天南星科(Araceae)如cheeseplant以及許多其它植物。
另外，用于本發明目的的植物生物體是能夠進行光合作用的生物體如藻類、藍細菌和蘚類。優選的藻類是綠藻如紅球藻屬(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、團藻屬(Volvox)或杜氏藻屬(Dunaliella)。特別優選集胞藻屬(Synechocystis)。
最優選的為油料作物。油料作物認為是天然高脂類含量的植物和/或可用于工業生產油類的植物。這些植物具有高脂類含量和/或其它具有工業價值的特殊脂肪酸成分。優選的植物是那些按重量計脂類含量為至少1％的植物。油料作物包括列舉的植物Borvago officinalis(紫草)、蕓苔屬如蕓苔油菜(B.campestris)、歐洲油菜(B.napus)、蕪箐(B.rapa)、大麻(Cannabissativa)、紅花(Carthamus tinctorius)、椰子(Cocos nucifera)、海甘藍(Crambeabyssinica)、萼距花屬(Cuphea)物種(萼距花屬物種產生尤其用于工業應用的中等鏈長度的脂肪酸)、油棕(Elaeis guinensis)(非洲油棕櫚)、美州油棕(Elaeis oleifera)(美國油棕櫚)、大豆(Glycine max)、陸地棉(Gossypiumhirisutfum)(美州棉花)、海島棉(Gossypium barbadense)(埃及棉花)、草棉(Gossypium herbaceum)(亞洲棉花)、向日葵(Helianthus annuus)、亞麻(Linum usitatissimum)(亞麻子或胡麻)、月見草(Oenothera biennis)(夜來香)、油橄欖(Olea europaea)(橄欖)、稻(Oryza sativa)、蓖麻(Ricinus communis)、胡麻(Sesamum indicum)(芝麻)、小麥屬(Triticum)物種(小麥)、玉蜀黍(Zeamays)(玉米)和各種各樣的堅果種類如胡桃和扁桃。
“總脂類含量”指的是所有油類的總和，優選地指三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸的總和。
“脂類”包括中性和/或極性脂類以及這些脂類的混合物。表1中的那些脂類以實例的方式提及，但不受限定。
表1植物脂類的分類


中性脂肪優選地指三酰甘油。中性和極性脂類都包括大范圍的多種脂肪酸。表2的脂肪酸以實例的方式提及，但不受限定。
表2多種脂肪酸概述(選擇)

1鏈長度雙鍵數目*植物中非天然存在油類優選指種子油。
總脂類含量的“增加”指植物或其部分、組織或器官、優選植物種子器官中脂類含量的增加。在此上下文，與不使用本發明方法但未進行另外修飾的起始植物相比，在其它相同條件下脂類含量增加至少5％、優選至少10％、特別優選至少15％、非常特別優選至少20％，最優選至少25％。本文中的條件指與萌芽、植物培育和生長有關的所有條件，如土壤條件、氣候條件、光照條件、受精、灌溉、植物保護處理等等。
“TER”通常指那些具有反-2-烯酰CoA還原酶活性以及如果相應核酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10在產油生物體，尤其是微生物、酵母、真菌和植物中表達時導致脂類含量增加的所有蛋白質，并且所述蛋白質與SEQ ID NO2、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11相同或者與SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有同源性。
具體而言，TER指多肽序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11。
最優選地，TER指如SEQ ID NO2所示的細小裸藻蛋白質TER和功能等效物或其它上述功能等效物部分。
反-2-烯酰CoA還原酶可通過各種本技術領域中熟知的方法從不同的生物體或植物材料中獲得。在從植物器官分離種子貯藏化合物之前，可從其它組織或器官中機械分離植物器官。將組織勻漿后，通過離心去除細胞碎片并保留含有可溶性蛋白質的上清液部分以備進一步純化目的化合物。如果產物從培養的細胞中分泌出來，則通過低速離心從培養基中去除細胞并保留上清液部分以備進一步純化。
使用適當樹脂將從兩種純化方法獲得的上清液部分進行色譜分析，其中目的分子保留在色譜樹脂上而樣品中的許多雜質則不保留，或者雜質被樹脂保留而樣品不保留。必要時，可使用相同或不同色譜樹脂重復此色譜步驟。本技術領域中技術工人非常精通對適宜色譜樹脂的選擇以及它們對待純化特殊分子的最有效應用。純化產物可通過過濾或超濾來濃縮，并于產物穩定性最佳的溫度下保存。
本技術領域中有大量已知的純化方法，前述純化方法并不意味著對純化方法的限制。例如，此種純化技術描述于Bailey J.E.和Ollis D.F.1986，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-HillNew York。本文描述的用于從細小裸藻純化的純化方法可作為范例，并且純化方法可通過那些本技術領域中的技術人員容易地適用于其它生物體。
“功能等效物”特別指如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所示的細小裸藻TER蛋白質的天然突變體或人工突變體，以及來自其它屬于例如裸藻門生物體的、與上面所定義TER具有相同基本特征的同源性多肽。突變體包括一個或更多個氨基酸殘基的替代、增加、缺失、倒置或插入。
在本發明范圍內有利應用的TER可以容易地通過使用如列舉的SEQID NO2所示多肽序列或者如SEQ ID NO1所示編碼所述多肽序列的核苷酸序列作為搜索序列或探針，進行數據庫搜索或者篩選基因文庫或cDNA文庫而發現。
所述功能等效物與SEQ ID NO2蛋白質的同源性優選為至少60％，特別優選至少70％，特別優選至少80％，最優選至少90％。
此外，可以使用SEQ ID NO3核酸序列以便從生物體中鑒定和克隆編碼與SEQ ID NO3具有至少60％的同源性的TER的基因。
SEQ ID NO2的功能等效物與SEQ ID NO2的同一性至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％，優選至少58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％，更優選71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％，最優選至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
此外，下列核酸序列可用于從不同生物體鑒定和克隆編碼與SEQ IDNO2具有至少40％同一性的TER的基因來自SwissProt/TREMBL的序列(代碼和物種)Q87QB9 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q8D8Y6 創傷弧菌(Vibrio vulnificus)Q8PE66 野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonascampestris pv.Campestris)Q83EP5 伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii.)Q8PR25 地毯草黃單胞菌柑桔致病變種(Xanthomonas axonopodispv.Citri)Q8EG14 Shewanella oneidensisQ87CN3 苛養木桿菌(Xylella fastidiosa)Q88E33 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)Q8XIP1 產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)Q8D795 創傷弧菌Q93HE4 阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)Q87HT6 副溶血弧菌來自PIR的序列(代碼和物種)A83277 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)H82630 苛養木桿菌AD0498 鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)B82164 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)B82418 霍亂弧菌G96956 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)來自Genbank REFSEQ的序列(代碼和物種)ZP00116993 哈氏噬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)ZP00064975 Microbulbifer degradansZP00033810 Burkholderia fungorum表3顯示了TER氨基酸序列與這些同源性核酸的氨基酸序列以及相應保守氨基酸殘基的比較。保守殘基顯示為灰色陰影。在序列下方給出這些殘基的一致殘基大寫字母代表強制(mandatory)殘基；正常體字母給出了在此位置上強制相似性組中的最主要的氨基酸。
通過與功能性特征序列相比較，SEQ ID NO2中假定功能位點被確定為下列氨基酸段
●NADH結合位點SEQ ID NO2中第190-196位氨基酸(Jrnvall等人，(1995)，“Short-chaindehydrogenases/reductases(SDR)”.Biochem.346003-6013.)●短鏈脫氫酶/還原酶催化位點SEQ ID NO2中第231-238位和第279-285位氨基酸(Das等人(2000)“Molecular cloning and expression ofmammalian peroxisomal trans-2-enoyl-coenzyme A reductasecDNAs.”J.Biol.Chem.27524333-24340.)●FAD結合位點SEQ ID NO2中第515-520位氨基酸(Chang和Hammes(1989)“Homology analysis of the proteinsequences of fatty acid synthases from chicken liver，ratmammary gland，and yeast.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868373-8376.)
*20 *40 *60 *80 *TER MSCPASPSAAVVSAGALCLCVATVLLATGSNPTALSTASTRSPTSLVRGVDRGLMRPTTAAALTTMREVPQMAEGFSGEATSAWAAAGPQ 90Q88E33 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8D795 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8D8Y6 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8EG14 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8PE66 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8PR25 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q8XIP1 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q93HE4 ------------------------------------------------------------------------------------------ -A83277 ------------------------------------------------------------------------------------------ -AD0498 ------------------------------------------------------------------------------------------ -B82164 ------------------------------------------------------------------------------------------ -B82418 ------------------------------------------------------------------------------------------ -G96956 ------------------------------------------------------------------------------------------ -H82630 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q83EP5 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q87CN3 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q87HT6 ------------------------------------------------------------------------------------------ -Q87QB9 ------------------------------------------------------------------------------------------ -ZP00033810 ------------------------------------------------------------------------------------------ -ZP00064975 ------------------------------------------------------------------------------------------ -ZP00116993 ------------------------------------------------------------------------------------------ -





兩種多肽之間的同源性可理解為通過借助程序算法GAP(Wisconsin軟件包，版本10.0，Wisconsin大學，遺傳學計算機組(GCG)，Madison，美國)比較計算的全部序列長度范圍內氨基酸序列的同一性，其中在所述算法中參數設定如下開口加權8長度加權2平均匹配2,912平均錯配-2,003例如，與序列SEQ ID NO2在蛋白質水平具有至少80％同源性的序列可理解為當使用上述程序算法并使用上面設定的參數與序列SEQ IDNO2比較時具有至少80％同源性的序列。
例如，功能等效物還包括那些由與核酸序列SEQ ID NO1至少具有60％、特別優選至少70％、尤其優選至少80％、最優選至少90％同源性的核酸序列所編碼的蛋白質。
兩個核酸序列之間的同源性可理解為借助程序算法GAP(Wisconsin軟件包，版本10.0，Wisconsin大學，遺傳學計算機組(GCG)，Madison，美國)計算比較的全部序列長度范圍內兩個核酸序列的同一性，其中在所述算法中參數設置如下開口加權50長度加權3平均匹配10平均錯配0例如，與序列SEQ ID NO1在核酸水平至少具有80％的同源性的序列可理解為當使用上述程序算法并使用上述設置的參數與序列SEQ IDNO1相比較時具有至少80％同源性的序列。
功能等效物還包括由這樣一種核酸序列所編碼的、并具有通過SEQ IDNO2所表征的TER基本特征的那些蛋白質，其中所述核酸序列在標準條件下與SEQ ID NO1所述核酸序列雜交或者與上述序列互補或部分互補的核酸序列雜交。
此外，通過本身已知的雜交技術從例如核酸序列SEQ ID NO1或SEQID NO3開始可以在多種其基因組序列未知的生物體中容易地發現TER的天然實例和相應基因。
雜交可以在溫和(低嚴格性)或優選在嚴格(高嚴格性)條件下進行。
此類雜交條件尤其描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，第9.31-9.57頁，或者Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
作為實例，在洗滌步驟中的條件可以從那些低嚴格性(2×SSC，50℃)和那些高嚴格性(0.2×SSC，50℃，優選65℃)所限定的條件范圍內選擇(20×SSC0.3M檸檬酸納，3M氯化鈉，pH7.0)。
此外，洗滌步驟過程中溫度可以從室溫22℃的溫和條件提高到65℃的嚴格條件。
鹽濃度和溫度兩個參數可以同時變化，而且也可以維持兩個參數之一不變而只改變另一個參數。還可以在雜交過程中使用變性劑，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在情況下，雜交優選在42℃進行。
一些可效仿的雜交條件和洗滌步驟列舉如下(1.)雜交條件，例如(i)4×SSC，65℃，或(ii)6×SSC，45℃，或(iii)6×SSC，68℃，100mg/ml變性魚精DNA，或(iv)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml變性的片段化鮭精DNA，68℃，或(v)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml變性的片段化鮭精DNA，50％甲酰胺，42℃，或(vi)50％甲酰胺，4×SSC，42℃，或(vii)50％(vol/vol)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％菲可，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5，750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42℃，或(viii)2×或4×SSC，50℃(溫和條件)，或(ix)30-40％甲酰胺，2×或4×SSC，42℃(溫和條件)。
(2.)洗滌步驟，每次洗滌10分鐘，例如(i)0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS，50℃，或(ii)0.1×SSC，65℃，或(iii)0.1×SSC，0.5％SDS，68℃，或(iv)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，42℃，或(v)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃，或(vi)2×SSC，65℃(溫和條件)。
此外，本發明還涉及能確保由SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所表征TER在植物生物體或所述植物生物體的組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中進行轉基因表達的轉基因表達構建體。
上面給出的定義可應用于TER，特別優選的是編碼TER且通過SEQID NO1序列描述的核酸的轉基因表達。
在所述轉基因表達構建體中，編碼TER的核酸分子優選處于與至少一種能夠確保TER在植物生物體或同一生物體的組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中表達的遺傳控制元件(例如啟動子)的有效連接中。
特別優選的是轉基因表達盒，其中編碼TER的核酸序列通過下列序列描述a)序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10或b)依照遺傳密碼簡并性從SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10衍生的序列c)與序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10具有至少60％同一性的序列。
有效連接可理解為例如啟動子與編碼TER的可表達核酸序列(例如SEQ ID NO1所示序列)的連續排列，并且如果適當的話，還可以以如下方式存在更多的調控元件(如終止子)，即當核酸序列重組表達時每一個調控元件能實行其功能。對于本目的不需要化學意義上的直接連接。遺傳控制序列如增強子序列還可以從更離的位置或者甚至從其它DNA分子的位置對靶序列發揮它們的作用。優選的排列是那些排列，即待重組表達的核苷酸序列位于作為啟動子的序列的后面，以致于兩個序列彼此共價連接。啟動子序列和待重組表達核苷酸序列之間的距離優選少于200個堿基對，特別優選少于100個堿基對，非常特別優選少于50個堿基對。
通過常規重組和克隆技術方式可以實現有效連接和轉基因表達盒，所述重組和克隆技術描述于如Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy TJ，Berman ML和EnquistLW(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel FM等人(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和WileyInterscience以及Gelvin等人(1990)Plant Molecular Biology Manual。然而，更多的序列如作為具有特異性限制性酶切位點或信號肽的接頭也可以位于這兩個序列之間。同樣，序列的插入也導致融合蛋白的表達。優選地，包含與待表達核酸序列連接的啟動子的表達盒可以是整合載體形式，并且可通過例如轉化將其插入到植物基因組。
然而，轉基因表達盒還理解為那些構建體，其中編碼TER的核酸序列位于內源性植物啟動子之后，以這樣一種方式植物啟動子引起TER的表達。
優選引入轉基因表達盒的啟動子是那些能在植物生物體或同一生物體的組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中有效的啟動子。在植物生物體中有效的啟動子可理解為能夠控制基因(特別是外源基因)在植物或植物部分、植物細胞、植物組織或植物培養物中表達的任何啟動子。例如，在該情況下，表達可以是例如組成型的、可誘導的或生長依賴性的。
優選下列啟動子a)組成型啟動子“組成型”啟動子指確保在大多數(優選全部)組織中在植物發育的重要時期(優選在植物發育的所有時期內)表達的那些啟動子(Benfey等人，(1989)EMBO J 82195-2202)。特別優選使用植物啟動子或植物病毒來源的啟動子。特別優選啟動子CaMV(花椰菜花葉病毒)35S轉錄本(Franck等人，(1980)Cell 21285-294；Odell等人，(1985)Nature 313810-812；Shewmaker等人，(1985)Virology 140281-288；Gardner等人，(1986)Plant Mol Biol6221-228)或19S CaMV啟動子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人，(1989)EMBO J 82195-2202)。另一個適宜組成型啟動子是核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基(SSU)啟動子(US 4,962,028)、豆球蛋白B啟動子(GenBank登錄號X03677)、來自農桿菌屬(Agrobacterium)的胭脂氨酸合酶啟動子、TR雙元啟動子、來自農桿菌屬的OCS(章魚堿合酶)啟動子、泛蛋白啟動子(Holtorf S等人(1995)Plant Mol Biol 29637-649)、泛蛋白1啟動子(Christensen等人，(1992)Plant Mol Biol 18675-689；Bruce等人，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(US 5,683,439)、空泡ATP酶亞基啟動子、擬南芥菜腈水解酶1基因啟動子(GenBank登錄號U38846，核苷酸3862至核苷酸5325或5342)或來自小麥的脯氨酸富含蛋白質啟動子(WO 91/13991)和另外的技術人員已知在植物中組成型表達的基因的啟動子。特別優選CaMV 35S啟動子和擬南芥菜腈水解酶1基因啟動子。
b)組織特異性啟動子此外，優選具有種子特異性的啟動子，例如菜豆蛋白啟動子(US 5,504,200；Bustos MM等人，(1989)Plant Cell 1(9)839-53)、2S白蛋白基因啟動子(Joseffson LG等人，(1987)J Biol Chem 26212196-12201)、豆球蛋白啟動子(Shirsat A等人，(1989)Mol Gen Genet 215(2)326-331)、USP(未知種子蛋白質)啟動子(Bumlein H等人，(1991)Mol Gen Genet225(3)459-67)、油菜籽蛋白基因啟動子(US 5,608,152；Stalberg K等人，(1996)L Planta 199515-519)、蔗糖結合蛋白啟動子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4啟動子(LeB4；Bumlein H等人，(1991)Mol Gen Genet 225121-128；Bumlein等人，(1992)Plant Journal 2(2)233-9；Fiedler U等人，(1995)Biotechnology(NY)13(10)1090f)、擬南芥屬油質蛋白啟動子(WO98/45461)和蕓苔屬Bce4啟動子(WO 91/13980)。
更多適宜的種子特異性啟動子是那些編碼高分子量麥谷蛋白(HMWG)、麥醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶或淀粉合酶的基因的啟動子。進一步優選的啟動子是那些允許在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等中進行種子特異性表達的啟動子。可以有利地采用lpt2或lpt1基因啟動子(WO 95/15389，WO 95/23230)或者如WO 99/16890中所述的啟動子(大麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或裸麥醇溶蛋白基因的啟動子)。
c)化學誘導型啟動子表達盒還包括化學誘導型啟動子(綜述文章Gatz等人，(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通過此種啟動子可將外源基因在植物中的表達控制在特定時間點。此類啟動子如PRP1啟動子(Ward等人，(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、水楊酸誘導啟動子(WO95/19443)、苯磺酰胺誘導啟動子(EP 0388186)、四環素誘導啟動子(Gatz等人，(1992)Plant J 2397-404)、脫落酸誘導啟動子(EP 0335528)或乙醇-環己酮誘導啟動子(WO 93/21334)同樣可以使用。適宜啟動子還有谷胱甘肽-S轉移酶異形體II基因(GST-II-27)啟動子，其可通過外源性應用安全劑如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(WO 93/01294)而激活，并在單子葉植物和雙子葉植物的大多數組織中是可使用的。
特別優選的是組成型啟動子、非常特別優選種子特異性啟動子、具體而言是油菜籽蛋白啟動子和USP啟動子。
此外，使得在另外的植物組織或其它生物體如大腸桿菌中表達成為可能的更多啟動子可以與待表達的核苷酸序列有效連接。原則上，適宜的植物啟動子是所有上述啟動子。
存在于本發明的轉基因表達盒或轉基因載體中的核酸序列可以與除啟動子以外的更多遺傳控制序列有效連接。術語遺傳控制序列可廣義地理解，并且指對根據本發明的表達盒的確立或功能具有影響的所有那些序列。遺傳控制序列會修飾例如原核和真核生物體的轉錄和翻譯。根據本發明的轉基因表達盒優選包含在每一情況中位于待重組表達核酸序列的5’上游的植物特異性啟動子和3，下游的終止子序列(作為額外的遺傳控制序列)以及(如果適當的話)在每一情況下與待重組表達核酸序列有效連接的更多常用調控元件。
遺傳控制序列還包括能改善表達控制特性的更多啟動子，啟動子元件或最小啟動子。因此，遺傳控制序列可以引起額外依賴于一定應激因素的組織特異性表達。此類元件例如對于水分應激、脫落酸(Lam E和Chua NH，J Biol Chem 1991；266(26)17131-17135)和熱應激(Schoffl F等人，(1989)Mol Gen Genetics 217(2-3)246-53)的元件。
例如，更多有利的控制序列有革蘭氏陽性細菌啟動子amy和SPO2，以及酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。
原則上，具有類似上述調控序列的所有天然啟動子可以用于根據本發明的方法。此外，合成啟動子也可以有利地使用。
遺傳控制序列還進一步包含基因的5’非翻譯區、內含子或3’非編碼區，例如肌動蛋白-1內含子或Adh1-S內含子1、2和6(對于綜合性參考文獻見The Maize Handbook，第116章，編者Freeling和Walbot，Springer，NewYork(1994))。已經表明它們在調控基因表達方面發揮了重要作用。因此已經表明5’非翻譯序列可加強異源基因的瞬時表達。以實例方式提到的翻譯增強子有煙草花葉病毒5’前導序列(Gallie等人，(1987)Nucl Acids Res158693-8711)等等。它們可進一步提高組織特異性(Rouster J等人，(1998)Plant J 15435-440)。
瞬時表達盒可有利地包含一種或更多與啟動子有效連接的被稱作增強子的序列，并且它們使核酸序列重組表達的增加成為可能。另外的有益序列如更多調控元件或終止子也可以插入到待重組表達核酸序列的3’末端。基因構建體中可以存在一個或更多個拷貝的待重組表達核酸序列。
適宜作為控制序列的多腺苷酸化信號是植物多腺苷酸化信號，優選基本對應于根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA多腺苷酸化信號那些多腺苷酸化信號，具體而言是那些Ti質粒pTiACHS的T-DNA基因3(章魚堿合酶)多腺苷酸化信號(Gielen等人，(1984)EMBO J 3835以及下列等等)或其功能等效物。特別適宜的終止子序列的實例是OCS(章魚堿合酶)終止子和NOS(胭脂氨酸合酶)終止子。
控制序列可以進一步理解為那些使同源重組、插入宿主生物體基因組或從基因組中去除成為可能的序列。例如在同源重組的情況下，特異性內源基因的編碼序列可以以定向形式與編碼dsRNA的序列互換。方法如cre/lox技術允許將表達盒從宿主生物體基因組中以組織特異性(或許為誘導性)去除(Sauer B(1998)Methods.14(4)381-92)。在這里，一定的側翼序列被加入到靶基因中(lox序列)，從而使以后通過cre重組酶的方法去除成為可能。
重組表達盒和來源于此的重組載體可包括更多的功能性元件。術語功能性元件應廣義地理解，并且指影響根據本發明的表達盒、載體或轉基因生物體產生、復制或功能的那些元件。可以提及的實例包括但不限于a)選擇標記，其對新陳代謝抑制劑如2-脫氧葡糖-6-磷酸(WO98/45456)、抗生素或殺生物劑(優選除草劑)例如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或膦絲菌素等等具有抗性。特別優選的選擇標記是對除草劑具有抗性的那些標記。下面以舉例的方式提到的有編碼膦絲菌素乙酰轉移酶(PAT)和滅活谷氨酰胺合酶抑制劑(bar和pat基因)的DNA序列、賦予對草甘膦(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSP合酶基因)、編碼草甘膦降解酶(草甘膦氧化還原酶)的gox基因、deh基因(編碼滅活茅草枯的脫鹵素酶)、滅活磺酰脲類和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶基因、編碼降解溴草腈的腈水解酶的bxn基因、賦予對抗生素apectinomycin抗性的aasa基因、抵抗鏈霉素的鏈霉素磷酸轉移酶(SPT)基因、賦予對卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因、賦予對潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(HPT)基因、賦予對磺酰脲類除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)基因(例如具有如S4和/或Hra突變的突變ALS變體)。
b)報告基因，其編碼容易定量的蛋白質并允許通過其顏色或酶活性評價轉化效率、表達位點或表達時間。在本文中非常特別優選的報告蛋白質(Schenborn E，Groskreutz D.Mol Biotechnol.1999；13(1)29-44)諸如“綠色熒光蛋白質”(GTP)(Sheen等人，(1995)Plant Journal 8(5)777-784)、氯霉素轉移酶、熒光素酶(Ow等人，(1986)Science 234856-859)、水母發光蛋白基因(Prasher等人，(1985)Biochem Biophys Res Commun126(3)1259-1268)、β-半乳糖苷酶，非常特別優選β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等人，(1987)EMBO J 63901-3907)。
c)復制起點，其允許根據本發明的表達盒或載體在例如大腸桿菌中復制。提到的例子有ORI(DNA復制的起點)、pBR322 ori或P15Aori(Sambrook等人Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
d)對于農桿菌介導的植物轉化所需的元件，例如T-DNA左邊界或右邊界或vir區域。
為了選擇已經成功進行同源重組的細胞或其它已成功轉化的細胞，通常還需要額外引入選擇標記，所述選擇標記可以賦予成功經歷重組的細胞對殺生物劑(如除草劑)、新陳代謝抑制劑例如2-脫氧葡糖-6-磷酸(WO98/45456)或抗生素的抗性。選擇標記允許從未轉化細胞中選擇出已轉化細胞(McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 581-84)。
此外，所述重組表達盒或載體可以包含不編碼核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10并且其重組表達會導致脂肪酸生物合成增加的更多核酸序列。此種核酸序列的實例(但不限于此)如額外重組表達的proOIL核酸序列，其選自編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAT)、二酰基甘油酰基轉移酶(DAGAT)和磷脂二酰基甘油酰基轉移酶(PDAT)的核酸。此類序列對于技術人員是已知的，并且容易從相應植物的數據庫或適宜cDNA文庫中獲得。
根據本發明的表達盒可以有利地通過使用重組表達盒所存在的載體導入生物體或其細胞、組織、器官、部分或種子(優選導入植物或植物細胞、組織、器官、部分或種子)。因此本發明進一步涉及包含核酸序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的重組表達盒的所述重組載體。
例如，載體可以是質粒、粘粒、噬菌體、病毒或者農桿菌。表達盒可以經適宜限制性酶切位點導入載體(優選質粒載體)。首先將獲得的載體導入大腸桿菌。選擇正確轉化的大腸桿菌并使其生長，使用技術人員已知的方法獲得重組載體。可使用限制性分析和測序驗證克隆步驟。優選的載體是那些能夠將表達盒穩定整合入宿主基因組的載體。
本發明還涉及包含如上定義的SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10、序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的轉基因表達盒或者包含此表達盒的轉基因載體的轉基因植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料。
通過例如相應蛋白質或核酸的轉化或轉染產生此類轉基因植物生物體。轉化生物體(或轉化細胞或轉化組織)的產生需要向所述宿主細胞導入所述DNA(例如表達載體)、RNA或蛋白質。對于轉化(或轉導或轉染)這一過程有多種方法可以使用(Keown等人，(1990)Methods in Enzymology185527-537)。因此，DNA或RNA可通過例如顯微注射或用DNA包被的微粒進行轟擊直接導入。還可使用例如聚乙二醇將細胞進行化學透化，從而DNA通過融合到達細胞。還可通過與含有DNA的單位(如小細胞、細胞、溶酶體或脂質體)進行原生質體融合將DNA導入。電穿孔對于DNA導入是更適宜的方法；在電穿孔中，通過電脈沖將細胞進行可逆性透化處理。在DNA溶液中浸泡植物部分以及花粉或花粉管轉化也是可能的。此種方法已有描述(例如，Bilang等人，(1991)Gene 100247-250；Scheid等人，(1991)Mol Gen Genet 228104-112；Guerche等人，(1987)Plant Science52111-116；Neuhaus等人，(1987)Theor Appl Genet 7530-36；Klein等人，(1987)Nature 32770-73；Howell等人，(1980)Science 2081265；Horsch等人，(1985)Science 2271229-1231；DeBlock等人，(1989)Plant Physiology91694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach編)Academic Press Inc.(1988)和Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski編)Academic Press Inc.(1989))。
對于植物轉化，可以使用雙元載體如pBinAR(Hfgen和Willmitzer1990，Plant Sci.66221-230)。雙元載體的構建可通過將cDNA以正義或反義方向連接入T-DNA來實現。cDNA 5’端的植物啟動子激活cDNA的轉錄。多腺苷酸化序列定位于cDNA的3’端。通過使用組織特異性啟動子實現組織特異性表達。例如，可通過將油菜籽蛋白、LeB4或USP啟動子克隆入cDNA的5’端實現種子特異性表達。還可以使用任何其它的種子特異性啟動子元件。為了在整個植物內組成型表達，可使用CaMV 35S啟動子。可使用如質體、線粒體或內質網的信號肽(Kermode 1996，Crit.Rev.Plant Sci.15285-423)將所表達蛋白質定向靶向細胞區室。將信號肽以與cDNA相同的閱讀框克隆入5’端以實現融合蛋白的亞細胞定位。
植物雙元載體的更多實例為TER候選基因被克隆入其中的pSUN300載體。這些雙元載體包含在Nos啟動子控制下驅動的抗生素抗性基因和位于帶有OCS終止子的候選基因之前的USP種子特異性啟動子，見圖4。將TER cDNA以正義方向克隆入植物雙元載體中位于USP種子特異性啟動子后面的多克隆位點。使用標準條將將包含目的基因的重組載體轉化入Dh5α細胞(Invitrogen)。在含有50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂上于37℃過夜生長篩選轉化細胞。使用QIAprep Spin小量制備試劑盒(Qiagen)根據廠商提供的說明書提取質粒DNA。根據標準分子生物技術(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual.第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，NY)進行亞克隆分析和限制酶切作圖分析。
在植物中，已經描述的轉化和從植物組織或植物細胞再生植物的方法可用于瞬時轉化或穩定轉化。適宜的方法特別是通過聚乙二醇介導DNA攝取的原生質體轉化、使用基因槍的生物射彈方法(其稱作粒子轟擊方法)、電穿孔、干胚胎在含DNA溶液中孵育和顯微注射。
除了此類“直接”轉化技術之外，還可能通過根癌農桿菌或發根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的細菌感染以及通過轉基因病毒感染將相應重組Ti質粒或Ri質粒轉移實現轉化。農桿菌介導的轉化最適合雙子葉植物的細胞。這些方法描述于例如Horsch RB等人，(1985)Science 2251229f。
當使用農桿菌時，表達盒要整合入特異質粒中(或者是穿梭載體或者是雙元載體)。如果使用Ti或Ri質粒進行轉化，Ti或Ri質粒T-DNA中至少右邊界(但在多數情況下是右邊界和左邊界)與待導入表達盒(作為側翼區)有效連接。
優選使用雙元載體。雙元載體能夠在大腸桿菌和農桿菌中復制。通常，雙元載體包括選擇標記基因和兩側為T-DNA右側和左側邊界序列的接頭或多接頭。它們可直接轉化入農桿菌(Holsters等人，(1978)Mol Gen Genet163181-187)。選擇標記基因，例如賦予對卡那霉素抗性的nptII基因，允許選擇出轉化的農桿菌。在此情況下，作為宿主生物體的農桿菌應該已包括帶有vir區域的質粒。在將T-DNA轉移入植物細胞中需要該質粒。以這種方式轉化的農桿菌可用于轉化植物細胞。用于植物細胞轉化的T-DNA的用途已經廣泛地進行了研究和描述(EP 120516；Hoekema，在The Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，第V章；An等人，(1985)EMBO J 4277-287)。已知多種不同雙元載體，其中一些是有商業可得的，如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.美國)。
已經描述了適于在植物中表達的其它啟動子(Rogers等人，(1987)Meth in Enzymol 153253-277；Schardl等人，(1987)Gene 611-11；Berger等人，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 868402-8406)。
直接轉化技術適用于任何生物體和細胞類型。在將DNA或RNA注射進入或電穿孔進入植物細胞的情況下，所使用質粒不需要滿足任何特殊要求。簡單的質粒如那些來自pUC系列的質粒也可以使用。如果從轉化植物中再生出完整植物，則在質粒中需要存在額外的選擇標記基因。
當選擇標記是所插入DNA的一部分時，可以將穩定轉化的細胞(即包含已整合入宿主細胞DNA的插入DNA的那些細胞)從未轉化細胞中選擇出來。能夠賦予對抗生素或除草劑(如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或膦絲菌素等)的基因可作為選擇標記(見上)。表達此類標記基因的轉化細胞能夠在存在殺死未轉化野生型細胞的濃度的抗生素或除草劑情況下存活。實例為上述提到的那些，并且優選包含賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(Rathore KS等人，(1993)Plant Mol Biol 21(5)871-884)、賦予對卡那霉素抗性的npII基因、賦予對潮霉素抗性的hpt基因或賦予對除草劑草甘磷抗性的EPSP基因。選擇標記允許從未轉化細胞中選擇出轉化的細胞(McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 581-84)。所獲得植物可以常規方式培育和雜交。為了確保基因組整合具有穩定性和遺傳性，應該生長兩代或更多代。
上述方法描述于例如Jenes B等人，(1993)Techniques for GeneTransfer，在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，SDKung和R Wu編，Academic Press，第128-143頁和Potrykus(1991)AnnuRev Plant Physiol Plant Molec Biol 42205-225。待表達的構建體優選克隆入適于轉化根癌農桿菌的載體，例如pBin19(Bevan等人，(1984)NuclAcids Res 128711f)。
對本文描述的TER核酸進行農桿菌介導的植物轉化可以使用標準轉化和再生技術進行(Gelvin，Stanton B.和Schilperoort R.A，Plant MolecularBiology Manual，第2版.Kluwer Academic Publ.，Dordrecht 1995in Sect.，Ringbuc Zentrale SignaturBT11-P；Glick，Bernard R.和Thompson，JohnE.Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，S.360，CRCPress，Boca Raton 1993)。例如，使用GV3(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204383-396)或LBA4404(Clontech)根癌農桿菌菌株進行農桿菌介導的轉化。
可以根據標準條件(Bechtold 1993，Acad.Sci.Paris.3161194-1199；Bent等人，1994，Science 2651856-1860)使擬南芥菜生長和轉化。另外，可經過子葉或胚軸(Moloney等人，1989，Plant Cell Report 8238-242；DeBlock等人，1989，Plant Physiol.91694-701)將本發明的TER核酸轉化入油菜籽。對農桿菌抗生素的使用和植物篩選取決于用于轉化的雙元載體和農桿菌菌株。通常使用卡那霉素作為植物選擇標記來選擇油菜籽。此外，向胡麻進行農桿菌介導的基因轉移可使用例如Mlynarova等人(1994，Plant Cell Report 13282-285)描述的技術實現。
大豆的轉化可使用例如EP 0424047，U.S.5,322,783(Pioneer Hi-BredInternational)或EP 0397687，U.S.5,376,543或U.S.5,169,770(Toledo大學)中描述的技術進行。在室溫下用70％的乙醇通過連續搖動將大豆種子表面滅菌4分鐘后，在補充有0.05％(v/v)Tween的20％(v/v)Clorox中連續搖動20分鐘。然后用蒸餾水沖洗種子4遍，并置于Petri培養皿中的潮濕的無菌濾紙上室溫6-39小時。剝離種皮，并從胚軸分離子葉。檢查胚軸以確保分生組織區域未被破壞。在半開的無菌Petri培養皿內收集離體的胚軸，并在密封Petri培養皿中空氣干燥至水分含量小于20％(鮮重)直到進一步使用。
從添加適當抗生素(例如100mg/l鏈霉素、50mg/l卡那霉素)的LB固體培養基中的單菌落制備根癌農桿菌培養物，然后將單菌落在液體LB培養基內生長至600nm處光密度為0.8。接著，于室溫下7000轉/分離心7分鐘沉淀細菌培養物，沉淀在補充有100mM乙酰丁香酮的MS培養基(Murashige和Skoog 1962，Physiol.Plant.15473-497)中重懸。在使用前，將細菌培養物在該預先誘導培養基中室溫培養2小時。大豆合子種子胚軸在大約44％的水分含量下用預先誘導農桿菌重懸培養物室溫浸滲2小時(用農桿菌培養物浸滲干胚芽也適用于玉米胚軸)。
胚芽從浸滲培養液中移出并轉移入含有2％蔗糖的固體MS培養基的Petri培養皿中于室溫黑暗條件下培養2天。備選地，胚芽置于Petri培養皿中濕潤(液體MS培養基)的無菌濾紙上，并在與上述相同條件下培養。在該階段之后，將胚芽轉入含有能殺死農桿菌的500mg/l卡那霉素或300mg/l頭孢噻肟的固體或液體MS培養基中。
植物轉化的方法也適用于蕓苔屬或其它農作物。具體而言，將蕓苔種子用70％乙醇于室溫下連續搖動進行表面滅菌4分鐘之后，在補充有0.05％(v/v)Tween的20％(v/v)Clorox中于室溫下連續搖動20分鐘。然后用蒸餾水沖洗種子4遍，并將種子置于Petri培養皿中潮濕的無菌濾紙上室溫18個小時。剝離種皮，種子在半開的無菌Petri培養皿中進行空氣干燥過夜。在這期間，種子損失其水分含量的大約85％。然后將種子室溫保存于密封Petri培養皿內直至進一步使用(與用于大豆胚芽方法中所描述相似)。
一旦產生轉化植物細胞，可使用技術人員知道的方法獲得完整的植物。例如，使用愈傷組織培養物作為起始材料。枝或根的發育可以已知的方式在該尚未分化細胞生物量(biomass)中誘導。獲得的植物苗可移植到戶外并用于培育。
技術人員熟悉從植物細胞再生植物部分和完整植物的此類方法。例如，可用于此目的的方法例如Fennell等人，(1992)Plant Cell Rep.11567-570；Stoeger等人，(1995)Plant Cell Rep.14273-278；Jahne等人，(1994)TheorAppl Genet 89525-533中描述的那些方法。
例如以TER為例，“轉基因”指包含所述TER核酸序列的核酸序列、表達盒或載體或者指用所述核酸序列、表達盒或載體或通過重組方法建立的所有那些構建體轉化的生物體，其中a)編碼TER的核酸序列，或b)與a)中的所述核酸序列有效連接的遺傳控制序列，例如在植物生物體中有功能的啟動子沒有處于其天然遺傳環境中或者已經通過重組方法進行了修飾，修飾例如一個或多個核苷酸殘基的替代、加入、缺失、倒置或插入是可能的。天然遺傳環境指來源生物體或在基因組文庫中存在的天然染色體位點。以基因組文庫為例，優選至少在某種程度上保留核酸序列的天然遺傳環境。核酸序列的至少一側為其天然遺傳環境，并且天然遺傳環境中的序列長度至少50bp、優選至少500bp、特別優選至少1000bp、非常特別優選至少5000bp。天然存在的表達盒(例如天然存在的編碼TER的基因的啟動子和相應TER基因的組體)在通過非天然的、合成的(“人工的”)方法例如誘變處理將TER的基因進行修飾時，則變成轉基因表達盒。此類方法描述于US 5,565,350；WO 00/15815，還可參見上面。
優選作為轉基因生物體的宿主或起始生物體首先是符合上述定義的植物。為了本發明的目的，包括植物界中高等植物和低等植物的所有屬和種，特別是用于獲得油類的植物，例如蕪箐、向日葵、芝麻、紅花、橄欖、大豆、玉米、小麥和堅果物種。還包括成熟植物、種子、根和苗和部分、繁殖材料和其衍生的培養物如細胞培養物。成熟植物指幼苗期以外的任何發育階段的植物。幼苗指處于早期發育階段的幼小的、未成熟植物。
用上述用于生物體轉化或轉染的方法產生轉基因生物體。
本發明還涉及根據本發明的轉基因生物體的用途以及用于生產糧食、飼料、藥物或精細化學藥品特別是油類、脂肪、脂肪酸或其衍生物的細胞、細胞培養物、部分(如轉基因植物生物體的根、葉等等)以及轉基因繁殖材料如從中衍生的種子或果實。
SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQID NO10或其衍生物在植物中進行轉基因表達除了影響脂類含量以外，還介導其它有益作用，例如增加應激抵抗力。例如，鹽土和水中出現的此種滲透應激是農業中日益突出的問題。例如，增加應激耐受力使得能夠將常規可耕種植物生長不旺盛的區域用于農業使用。
在本技術領域中已經較好地建立了酶活性和動力學參數的測定。可根據Inui等人，(1984)，European J.Biochem.142121-126測定TER活性。
可以在轉錄或/和翻譯水平測定轉化宿主生物體中的重組基因產物的活性。確定基因轉錄水平(基因產物翻譯可利用的mRNA數量的指示)的有用方法是Northern印跡(對于參考文獻見例如Ausubel等人，1988，Current Protocols in Molecular Biology，WileyNew York)，其中設計結合目的基因的引物用可檢測標簽(通常為放射性或化學發光標簽)進行標記，以致于當從生物體培養物提取總RNA，在凝膠上進行電泳，轉移至穩定基質并用探針進行孵育時，探針的結合和結合數量提示該基因mRNA的存在以及mRNA的數量。此信息至少部分說明了轉化基因的轉錄程度。通過幾種方法從植物細胞、組織或器官中制備總的細胞RNA，所述方法是本技術領域中眾所周知的，例如描述于Bormann等人，(1992，Mol.Microbiol.6317-326)的方法。
為確定由此mRNA翻譯的蛋白質的存在和相對量，可以使用標準技術，例如Western印跡(見例如Ausubel等人，1988，Current Protocols inMolecular Biology，WileyNew York)。在此方法中，提取總細胞蛋白質，經凝膠電泳分離，轉移至基質如硝酸纖維素膜，并用探針如特異性結合目的蛋白質的抗體孵育。該探針通常標有容易檢測的化學發光標簽或顯色標簽。觀察到標簽的存在和標簽的量指示了細胞中目的突變體蛋白質的存在和數量。
植物中的遺傳修飾對目的種子貯藏化合物如三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸的影響可通過如下確定，即使修飾植物在適宜條件下生長并且分析種子或其它植物器官中目的產物的產量是否增加。此類分析技術對于本技術領域中的技術人員是熟知的，其包括光譜學、薄層色譜法、各種類型染色法、酶學和微生物學方法以及分析型色譜法如高效液相色譜(見例如，Ullman 1985，Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第89-90頁和第443-613頁，VCHWeinheim；Fallon，A等人，1987，Applications of HPLC in Biochemistry在Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等人，1993Productrecovery and purification，Biotechnology，第3卷，第III章，第469-714頁，VCHWeinheim；Belter，P.A.等人，1988Bioseparationsdownstreamprocessing for biotechnology，John Wiley和Sons；Kennedy J.F.和CabralJ.M.S.1992，Recovery processes for biological materials，John Wiley andSons；Shaeiwitz J.A.和Henry J.D.1988，Biochemical separations在Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，Separation andpurification techniques in biotechnology，第B3卷，第11章，第1-27頁，VCHWeinheim和Dechow F.J.1989)。
除了上述方法之外，如Cahoon等人，(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，2212935-12940)和Browse等人，(1986，Anal.Biochemistry442141-145)所述，可從植物材料中提取植物脂類。脂肪酸的定性和定量分析描述于Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology.Ayr/ScotlandOily Press.-Oily Press Lipid Library；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide-Ayr，ScotlandOilyPress，1989Repr.1992.-IX，307S.-Oily Press Lipid Library；和Progressin Lipid Research，OxfordPergamon Press，1(1952)-16(1977)Progressin the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN。
脂肪酸產物存在的明確證明可通過根據標準分析方法如Christie及其參考文獻(1997在Advances on Lipid Methodology第4版Christie，OilyPress，Dundee，第119-169頁；1998)多方面描述的GC、GC-MS或TLC分析轉基因植物來獲得。關于葉的詳細方法由Lemieux等人描述(1990，Theor.Appl.Genet.80234-240)，而關于種子的詳細方法由Focks和Benning描述(1998，Plant Physiol.11891-101)。
甘油骨架的C-1、C-2或C-3位置的脂肪酸組成分析通過脂肪酶消化確定(見例如Siebertz和Heinz 1977，Z.Naturforsch.32c193-205和Christie 1987，Lipid Analysis第2版，Pergamon Press，Exeter，ISBN0-08-023791-6)。
例如，一般使用例如14C-醋酸鹽或14C-丙酮酸鹽標記葉或種子，通過分析碳流動(見例如Focks和Benning 1998，Plant Physiol.11891-101；Eccleston和Ohlrogge 1998，Plant Cell 10613-621)收集關于脂類和糖生物合成途徑中蛋白質活性增加或減少所產生影響的信息。碳-14在脂類和水溶性成分中的分布可在分別分離(例如在TLC板上)(包括14C-蔗糖和14C-蘋果酸之類的標準)后通過液體閃爍計數進行測定(Eccleston和Ohlrogge1998，Plant Cell 10613-621)。
待分析的材料可經超聲處理、玻璃研磨、液氮和磨碎或經其它適用方法進行碎裂。材料破碎后必須離心。將沉淀重懸于蒸餾水中，于100℃加熱10分鐘，冰上冷卻，再次離心后在含有2％二甲氧基丙烷的溶于甲醇的0.5M硫酸中于90℃提取1小時，導致產生水解油類和脂類化合物從而獲得轉甲基脂類。在石油醚中提取這些脂肪酸甲基酯，最后使用毛細管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52CB，25m，0.32mm)進行GC分析，分析時于170℃-240℃間的溫度梯度下20分鐘并且于240℃下5分鐘。對所獲得脂肪酸甲基酯的鑒定可通過使用可得的商業化來源(即Sigma)標準進行定義。
在沒有脂肪酸標準的情況下，通過衍生作用和隨后的GC-MS分析鑒定分子。例如，三鍵脂肪酸的定位經4，4-二甲基-噁唑啉衍生作用后經GC-MS顯示(Christie，Oily Press，Dundee，1998)。
例如，可以構建含有本文公開的核酸或其片段的酵母表達載體，并使用標準方法轉化入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。然后，分析所得到轉基因細胞中的糖、油類、脂類或脂肪酸含量的改變。
同樣地，可以構建包含本文公開的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10或其片段的植物表達載體，并使用標準方法轉化入適宜植物細胞如擬南芥菜、大豆、蕓苔、玉米、小麥、蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)等。然后，分析所得到轉基因細胞和/或來源于其的植物中油類、脂類或脂肪酸含量的變化。
另外，本文公開的序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10或其片段可用來在多種生物體如細菌、哺乳動物細胞、酵母細胞和植物細胞的基因組中產生敲除突變(Girke等人，1998，Plant J.1539-48)。然后，評價所得到敲除細胞中種子貯藏混合物的組成和含量，以及突變對表型和/或基因型的影響。對于其它基因失活的方法包括US 6,004,804“非嵌合體突變載體”和Puttaraju等人的方法(1999，“Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy”Nature Biotech.17246-252)。
現在已經概括描述的本發明可通過參照下面的實施例更容易地理解，所述實施例僅僅是為了說明的目的，其并不旨在限制本發明的范圍。
實施例常規方法常規克隆過程克隆過程例如限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、核酸轉移至硝酸纖維素膜和尼龍膜、DNA片段的連接、轉化大腸桿菌和酵母細胞、細菌的生長以及重組DNA的序列分析按照Sambrook等人(1989，ColdSpring Harbor Laboratory PressISBN 0-87969-309-6)或Kaiser，Michaelis和Mitchell(1994，“Methods in Yeast Genetics”，Cold SpringHarbor Laboratory PressISBN 0-87969-451-3)中所描述進行。
化學藥品如果在文中沒有另外指出，所用化學藥品以p.a.質量從Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)公司獲得。使用來自Milli-Q水系統水凈化裝置(Millipore，Eschborn)的凈化無熱原水(在下文中指定為H2O)制備溶液。限制性內切酶、DNA修飾酶和分子生物學試劑盒從AGS(Heidelberg)、Amersham (Braunschweig)、Biometra(Gttingen)、Boehringer(Mannheim)、Genomed(Bad Oeynnhausen)、New EnglandBiolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison，Wisconsin，USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)和Stratagene(Amsterdam，Netherlands)公司獲得。如果不另外指出，按照制造商的說明使用。
植物生長擬南芥菜植物生長于如Ogas等人(1997，Science 27791-94；1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9613839-13844)所描述的Murashige-Skoog培養基中或者生長于如Focks和Benning(1998，Plant Physiol.11891-101)所描述的標準條件下的土壤中。
實施例1來自細小裸藻的反-2烯酰輔酶A還原酶(TER)的生物化學純化1千克細小裸藻Z株細胞在需氧條件下生長1周用作起始材料。
裸藻培養在BIOSTAT B 10L發酵灌(Braun Biotech)中進行。培養條件如下培養體積為7升、光強度為5000lx持續光照、溫度為28℃、以200轉/分攪拌。將Ogbonna，J.C.等人(1981)J.Appl.Phycol.1067-74和Yamane，Y等人(2001)Biotech.Lett.231223-1228所描述的確定成分培養基改良并使用。1升培養基由12g葡萄糖；0.8g KH2PO4；1.5g(NH4)2SO4；0.5g MgSO4×7H2O；0.2g CaCO3；0.0144g H3BO3；2.5mg維生素B1；20μg維生素B12；1ml痕量元素溶液和1ml鐵溶液組成。痕量元素溶液為每100ml蒸餾水中包含4.4g ZnSO4×7H2O；1.16g MnSO4×H2O；0.3g Na2MoO4×2H2O；0.32g CuSO4×5H2O和0.38g CoSO4×5H2O并且鐵溶液為每100ml蒸餾水中包含1.14g(NH4)2SO4Fe(SO4)2×6H2O和1gEDTA。在培養期間培養基的pH維持在2.8并且向培養物通以2升/分鐘的空氣。
在使用標準技術收獲培養物之后，使用弗氏細胞壓碎器(French Press)破碎細胞。30％硫酸銨溶解(cut)用于去除細胞碎片。透析之后，進行一系列層析純化步驟，見表4。它們包括離子交換層析(DEAE-Fraktogel)、疏水相互作用(phenylsapharose)、親和層析(Reaktive Red 120)和羥磷灰石層析法。相應的純化水平見表4。而且，完備的純化方案還包括另外的離子交換層析(Mono Q)，經制備型凝膠純化以及通過Superdex 200的最終凝膠過濾。此方案達到1600倍以上的純化。
純化步驟的細節如下使用FPLC系統(Amersham Biosciences)開展全部層析步驟。根據廠商提供的說明書裝填所有柱子或使用預裝柱。所有緩沖液經0.45μm硝化纖維素濾膜(Sartorius，Gttingen)過濾并去除氣體。經弗氏細胞壓碎器破碎和30％硫酸銨溶解之后，使用DEAE-Fraktogel EMD650S(Merck)進行第一次層析步驟。在大小為2.6×12cm的XK 26柱(Amersham Biosciences)上進行10輪層析并且使用0-1M線性梯度KCl(25mM磷酸鉀緩沖液pH6.8，含有1mM EDTA、1mM DTT和1μM FAD)進行洗脫。將活性級分混合并在XK 26柱(2.6×14cm)上進行4輪PhenylSepharose 6 Fast Flow low sub(Amersham Biosciences)層析。使用1M-0M的NH4(SO4)2線性梯度(溶于10mM Tris-HCl pH 8.0，含有1mM EDTA、1mM DTT和1μM FAD)洗脫。將活性級分混合并在XK 16柱(1.6×9cm)柱上進行5輪Reaktive Red 120(Sigma)層析。使用0-1M KCl的線性梯度(25mM磷酸鉀緩沖液pH 6.8，含有1mM EDTA、1mM DTT和1μMFAD)洗脫。再次將活性級分混合并使用Eco-Pac CHT IICartridge(Bio-Rad，München)在羥磷灰石基質上進行8輪層析。使用從10mM到500mM的線性梯度磷酸鉀緩沖液(pH6.8，含1mM DTT和1μMFAD)洗脫。將活性級分混合并在Mono Q HR 5/5柱(Amersham Biosciences)上進行3輪層析。使用0到1M線性梯度的KCl(溶于10mM Tris-HCl pH8.0，含1mM EDTA、1mM DTT和1μM FAD)洗脫。
將活性級分混合并按照制造商的說明書在Mini Prep Cell(Bio-Rad)中進行6輪6％的連續天然聚丙烯酰胺凝膠層析。將活性級分混合并在Superdex 200HR 10/30柱(Amersham Biosciences)上進行3輪層析。用含有150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA和1μM FAD的10mMTris-HCl pH 8.0洗脫。使用標準方法將活性級分進行SDS-PAGE。最終的酶制劑顯示為在44kDa附近非常接近的一條主帶和一條次帶，見圖2。
當用標準方法進行SDS-PAGE凝膠(12％)電泳時，最終的酶制劑顯示為在44kDa附近非常接近的一條主帶和一條次帶。
使用如Inui，H等人(1984)Eur.J.Biochem.142121-126所描述且進行以下修飾的方法測量酶活性。測定混合物包含100mM磷酸鉀緩沖液pH6.2；0.75mM丁烯酰輔酶A(Sigma)；0.4mM NADH和2μM FAD和酶。不含底物的測定混合物在30℃預孵育10分鐘。反應也于30℃進行并從加入底物開始。通過340nm處吸光度的降低來測定活性。最終測定體積是1ml(Ultrospec 2000分光光度計，Amersham Biosciences)或200μl(GENios微量滴定板讀取儀，Tecan Instruments，Maennedorf，Switzerland)。
圖2顯示了不同純化步驟后TER在SDS-PAGE凝膠(12％)中的蛋白質模式。酶活性與較上的主帶相關。
表4從1000g裸藻細胞開始進行的反-2-烯酰輔酶A還原酶的純化

實施例2從細小裸藻細胞分離總RNA和poly-(A)+RNA為了研究轉錄本，分離了總RNA和poly-(A)+RNA。按照下面的方法從細小裸藻細胞中分離RNA分離總DNA的細節涉及使用5克鮮重的裸藻。材料在液氮條件下于研缽中研磨成細粉并溶于20ml重懸緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0；100mM NaCl；10mM EDTA；30mM 2-巰基乙醇；2％(w/v)SDS；4M異硫氰酸胍；5％(w/v)Polyclar)。將勻漿液轉入錐形管并使用相同體積苯酚/氯仿/異丙醇通過振蕩進行提取。提取物于室溫5000g離心5分鐘進行相分離。用冰冷的異丙醇在-20℃沉淀核酸60分鐘，然后于4℃6000g離心20分鐘，并將沉淀重懸于含有10μg/ml蛋白酶K的5ml TE緩沖液中。用1.25ml 10M LiCl于-20℃過夜沉淀RNA，然后在4℃于10000g離心30分鐘進行沉淀。RNA沉淀重懸于5ml DEPC處理的水中，為了進一步純化可再次使用乙醇于-20℃沉淀2小時。最后通過在4℃于10000g離心20分鐘獲得最終的RNA沉淀。將總RNA稀釋于2ml TE并測定濃度。
使用Amersham Biosciences的采用oligo(dT)-纖維素柱的mRNA純化試劑盒從總RNA中制備mRNA。
實施例3cDNA文庫的構建為了構建cDNA文庫，使用莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(AmershamBiosciences，Freiburg，德國)和oligo-d(T)引物完成第一條鏈的合成，通過與DNA聚合酶I、Klenow酶孵育并用RNA酶H于12℃消化(30分鐘)和22℃消化(1小時)來完成第二條鏈的合成。在65℃孵育(10分鐘)終止反應，隨后轉移至冰上。通過苯酚/氯仿抽提和Sepharose CL-4B去除核苷酸。使用T4-DNA連接酶(Amersham Biocsciences，12℃過夜)將EcoRI/NotI接頭(Amersham Biosciences，Freiburg)連接到cDNA末端并通過多核苷酸激酶孵育(Amersham Biosciences，37℃，30分鐘)將該接頭磷酸化。過量的接頭通過Sepharose CL-4B除去。cDNA分子連接到載體臂上，并使用GigapackIII Gold試劑盒(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)中的材料并按照廠商提供的說明書將其包裝入λZAPII噬菌體。
使用ExAssist輔助噬菌體(Stratagene，荷蘭)通過體內切除從cDNA庫產生pBluescript噬菌粒用于進一步分析。
實施例4通過肽指紋法和隨后相應cDNA的克隆鑒定TER蛋白質的序列將生物化學純化的TER進行SDS-PAGE電泳后出現44kDa的雙帶。從凝膠上分別切下主帶和次帶并使用標準方法用胰酶消化。所得到的肽用從凝膠提取，再按照標準方法使用ESI-Q-TOF MS/MS分析。兩個帶產生了完全相同的肽，這證實與Inui和同事的描述(Inui，H.等人，(1986)J.Biochem.100995-1000)相比，TER作為單一亞單位酶被完全純化。下面是使用ESI-Q-TOF MS/MS鑒定的肽肽1 ACLKPLGATYTNR肽2 AALEAGLYAR肽3 VLVLGCSTGYGLSTR肽4 TDPAT肽5 SLDGDAFDSTTK肽6 DLWSQVNTANLK肽7 AGWYNTVAFEK肽8 RVQEELAYAR肽9 DLSDFAGYQTEFLR肽10 LYPGDGSPLVDEAGR肽11 LTQQYGCPAYPVVAK肽12 VDDWEMAEDVQQAVK肽13 STGYG(AMVR/LSEK)肽14 AHPPTSPGPK肽15 ALSEAGVLAEQK肽16 ((GT)/(AS))HEGCLEQMVR
肽17 LYPENGAPLVDEQR根據這些肽設計簡并引物并用于以cDNA為模板的PCR。由于細小裸藻中的核酸GC含量高，在PCR之前要在98℃初始變性10分鐘。PCR條件如下94℃，30秒；50℃，30秒和72℃，90秒，30個循環；72℃最終延伸5分鐘。使用以下引物擴增得到837bp的片段5’-GGITGGTAYAAYACIGTIGC-3’(參照肽7)和5’-GTYTCRTAICCIGCRAARTC-3’(參照肽9)。將該片段克隆入pBluescript SK+/HincII并測序(SEQ ID NO3)。所翻譯序列含有純化蛋白質的幾種肽，并且因此837bp的片段用作雜交探針以篩選cDNA文庫，該文庫是使用來自如實施例2和3所描述的需氧生長的裸藻細胞mRNA構建的。篩選250,000個重組噬菌體得到6個獨立的克隆。cDNA插入片段在1600bp和1900bp之間。對所有6個克隆從兩端測序表明所有克隆代表同一轉錄本，而僅在長度上有所變化。最長的克隆經核酸外切酶III刪除進行雙鏈完全測序。此克隆長1912bp，并且包含可編碼539個氨基酸的1620bp的可讀框(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。在克隆兩端具有含NotI和EcoRI限制性酶切位點的接頭，并將該克隆插入載體pBluescript SK的EcoRI位點。圖3顯示了pBluescript SKP載體中TER克隆的圖譜。
實施例5表達TER基因的酵母細胞中三酰甘油的積累通過EcoRI消化從克隆載體pBluescript SK+載體上切下TER基因并克隆入多拷貝質粒pYES2(Invitrogen)中強誘導GAL1啟動子之后的EcoRI位點，從而產生質粒pYTER。用pYTER轉化的野生型酵母株By4742(MATα his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0)在缺乏尿嘧啶并添加2％(vol/vol)甘油和2％(vol/vol)乙醇的合成培養基(Sherman，F.等人(1986)Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics，Cold SpringHarbor Lab.Press，Plainview，NY.)中于30℃振蕩培養。生長24小時后通過加入終濃度為2％(wt/vol)的半乳糖誘導GAL1啟動子。在生長24小時或48小時后收獲細胞。用空載體(pYES2)轉化并在相同條件下培養的野生型細胞By4742用作對照。
為了定量總脂類的含量，通過離心收獲3份(每份5ml)酵母培養物，用蒸餾水洗滌得到的沉淀并凍干。測定干細胞的重量，在轉變成甲基酯后通過常規氣液相層析分析(GLC)定量脂肪酸含量(Dahlqvist等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6487-6492)。
脂類含量以nmol脂肪酸/mg干重計。測定了從35ml液體培養物收獲的細胞中酵母的脂類組成。收獲的酵母細胞在15ml玻璃管中用水重懸至終體積0.6ml，再加入3.75ml氯仿∶甲醇(1∶2)、50μl乙酸和2ml玻璃珠(0.45-0.50mm)。用劇烈攪動(5×1分鐘)破碎酵母細胞，再按照標準方法(Bligh，E.G.和Dyer，W.J.，Can.J.Biochem.Physiol.37(1959)，911-917)將脂類抽提入氯仿。將收集的脂類級分分成兩部分并且通過Silica Gel 60板(Merck)上的TCL在己烷/二乙醚/乙酸(70∶30∶1)中分離用于定量中性脂類(即未酯化脂肪酸(FA)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)和甾酯(SE))并且在氯仿/甲醇/醋酸/水(85∶15∶10∶3.5)中分離用于定量主要極性脂類(即磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、卵磷酯(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE))。通過短暫暴露于I2蒸氣中定位脂類位，并通過適當標準鑒定。不同的脂類種類從板上切下并通過在含有2％(vol/vol)硫酸的無水甲醇中將切下材料于85℃加熱60分鐘制備脂肪酸甲酯。將甲酯抽提出來并通過如Dahlqvist等人(2000)所描述的常規氣液色譜法(GLC)定量。
實施例6反-2-烯酰CoA還原酶(TER)在大腸桿菌中的功能性表達。
選擇TER cDNA克隆的兩個不同部分用于在大腸桿菌中進行異源性表達。第一個構建體(ter1)包含完整的可讀框(SEQ ID NO1)。第二個構建體(ter2)包含從136位氨基酸開始的部分可讀框。ter2長1215bp，計算分子量為45kDa，大小等同于與細小裸藻來源的純化TER蛋白質的分子量(見圖2)。使用下列引物從細小裸藻的cDNA中擴增構建體ter1和ter2TER1Ndefor 5’-TAT ACA TAT GTC GTG CCC CGC CTC GCC GTC TG-3’Nde I
TER1Bglfor 5’-TATAGA TCTTAT GTC GTG CCC CGC CTC GCC GTC TG-3’Bgl IITER2Ndefor 5’-TAT ACA TAT GTT CAC CAC CAC AGC GAA GGT CAT CC-3’Nde ITERXhorev 5’-TATCTC GAGCTA CTG CTG GGC AGC ACT GG-3’Xho Iter2由限制性位點Nde I和Xho I插入載體pET28a(Novagen，Darmstadt，德國)，并在大腸桿菌表達株BL21(DE3)(Novagen)中表達。
50-100ml含有抗生素的LB培養基培養單個大腸桿菌克隆。培養物于37℃振蕩生長直至OD6000.6-1。培養物用終濃度0.4mM的IPTG于16℃培養過夜進行誘導。隨后經4000g離心10分鐘收獲表達培養物。沉淀用裂解緩沖液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)重懸，再加入1mg/ml溶菌酶4℃培養30分鐘。用超聲處理進行細胞破碎，每個循環80W 10秒，共六個循環。加入RN酶A(10μg/ml)和DN酶I(5μg/ml)，再用探針4℃孵育10分鐘。10000g離心30分鐘后的上清液含有可溶性蛋白質級分。
4ml可溶性蛋白質級分補充1ml 50％的Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen，Hilden，德國)并于4℃振蕩培養1小時。然后全部樣品注入聚丙烯柱(Qiagen)，收集流出物。每次用4ml洗液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mMNaCl，20mM咪唑)進行洗脫步驟，多達3次。蛋白質的洗脫進行4次，每次用0.5ml洗脫液(50mM NaH2PO4pH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑)。
轉化有ter2-pET28的大腸桿菌的可溶性蛋白質級分經SDS-PAGE顯示與對照細胞不同，主要條帶位于預期的45kDa大小的位置(見圖5)。ter2蛋白質借助添加的His標簽經Ni-NTA瓊脂糖純化并且12％SDS-PAGE顯示了ter2蛋白質的強富集(見圖5)。使用標準方法(Sambrook等人，1989，Cold Spring Harbor Laboratory PressISBN 0-87969-309-6)進行Western印跡分析和免疫檢測。作為第一抗體使用了單克隆小鼠IgG His標簽抗體(Novagen，Darmstadt，Germany)，所使用的第二抗體是HRP結合的山羊抗小鼠抗體(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)。使用ECLWestern印跡分析試劑盒(Amersham Biosciences)檢測二級抗體。用隨后的His標簽的免疫檢測對BL21(DE3)中構建體ter2-pET28進行Western印跡分析顯示了ter2蛋白質過表達的特異性信號(見圖6和7)。純化ter2蛋白質的特異活性為1510nmol/mg/分鐘。
ter1分別由限制性酶切位點Nde I和Xho I以及Bgl II和Xho I插入載體pET28a(Novagen)和pET32a(Novagen)中(見圖7和8)。見圖8Rosetta(DE3)中構建體ter1-pET32的western印跡顯示了大腸桿菌BL21(DE3)沒有表達ter1。因此，大腸桿菌表達宿主Origami株(DE3)和Rosetta株(DE3)(均來自Novagen)可用來檢測ter1的表達。pET28a中ter1構建體的SDS-PAGE顯示沒有表達。然而，接下來的his標簽免疫檢測的Western印跡顯示了大腸桿菌Rosetta(DE3)中構建體ter1-pET32的特異性信號(見圖8)。信號顯示了預期的78kDa大小的含有19kDa的硫氧還蛋白標簽的ter1-pET32構建體。不能測定用于表達的ter1蛋白質的TER特異活性。
大腸桿菌中細小裸藻TER的表達研究結果可作為考慮cDNA克隆N末端部分可以構成線粒體的靶向信號，其必須切除以產生成熟有活性的TER蛋白質。盡管如此，不能排除cDNA克隆的N末端部分構成跨膜結構域的可能性。此潛在跨膜結構域在從細小裸藻生物純化TER的過程中有可能丟失(見實施例1)。如果在大腸桿菌中表達，此結構域由于錯誤的旋轉或缺少膜連接可能破壞用C4底物進行的活性檢測(見實施例1)。
實施例7用于擬南芥中過表達的一系列TER構建體的構建既然TER基因的縮短形式ter2在大腸桿菌中有活性，可產生被縮短的和修飾的但有功能的TER形式。作為例子TER基因的兩個縮短版本可以通過PCR產生，測序，并且也可以轉入植物中具有SEQ ID NO4給出的ORF的一個導致產生SEQ ID NO5給出的蛋白質序列。此蛋白質的序列與SEQ ID NO2相比是縮短的，但與SEQ ID NO2的126位氨基酸殘基及下面的序列是相同的。然而在該相同區域之前具有不同于SEQ IDNO2的28個氨基酸N末端延伸。此28個氨基酸預測產生線粒體靶向作用而無需推定的SEQ ID NO2中125個氨基酸長的線粒體靶向序列。
第二種序列(SEQ ID NO6)產生的SEQ ID NO7氨基酸序列對應于上述作為ter2的縮短形式，并且在大腸桿菌中顯示有活性。由此序列產生的蛋白質預測不能導向至線粒體。
作為另一個變異的例子，ter1(SEQ ID NO1)和ter2(SEQ ID NO6)變異可克隆入雙元載體ST593(見
圖10)以至于在ORF加上一個新的N末端序列，從而分別產生序列8和序列10。相應的蛋白質序列(SEQ ID NO9和11)將成為分別融合ter1和ter2的Rubisco小亞基的質體靶向肽。
這些DNA序列可克隆入如實施例8中下面列舉的雙元載體。
實施例8用于植物轉化的質粒使用雙元載體如pBinAR用于植物轉化(Hfgen和Willmitzer 1990，Plant Sci.66221-230)。可通過以正義和反義方向連接cDNA至T-DNA進行雙元載體的構建。cDNA 5’初端的植物啟動子激活cDNA的轉錄。多聚腺苷酸序列定位于cDNA 3’末端。通過使用組織特異性啟動子獲得組織特異性表達。例如，種子特異性表達可通過將油菜籽蛋白、LeB4或USP啟動子克隆入cDNA 5’端中來獲得。也可以使用任何其它種子特異性啟動子元件。為在全部植物中組成型表達，可使用CaMV 35S啟動子。所表達的蛋白質可用信號肽靶向至細胞區室，如質體、線粒體或內質網(Kermode1996，Crit.Rev.Plant Sci.15285-423)。信號肽被克隆入cDNA框架的5’-端以獲得融合蛋白質的亞細胞定位。
植物雙元載體的更多例子有克隆有TER候選基因pSUN300載體，見圖4。這些雙元載體包括在Nos啟動子控制下驅動的抗生素抗性基因、位于候選基因前面的USP種子特異性啟動子并具有OCS終止子。將TERcDNA以正義和反義方向克隆入USP種子特異性啟動子后面的植物雙元載體的多克隆位點。含有目的基因的重組載體應用標準條件轉化入Dh5α(Invitrogen)。在含有100μg/ml鏈霉素的LB瓊脂上37℃過夜生長篩選轉化細胞。根據廠商提供的說明書使用QIAprep Spin小量制備試劑盒(Qiagen)提取質粒DNA。根據標準分子生物學技術進行亞克隆分析和限制性酶切圖譜分析(Sambrook等人1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual.2nd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold SpringHarbor，NY)。
實施例9擬南芥的轉化本技術領域中的技術人員可以從不同方法中選擇，下面將給出例子。
使用基本上如Cloug和Bent，1998描述的浸花法(floral dip)，分別用含有質粒pSUN300-USP-TER-OCS的根癌農桿菌C58C1轉化植物。全植株(花序和蓮座叢)在含有5％蔗糖、0.02％Silwet L-77(Osi Specialties，Danbury，CT)和重懸有經轉化的根癌農桿菌細胞的浸潤培養基浸沒20-30秒。然后植物轉入21℃光照16小時和18℃黑暗中8小時的光周期的生長室(70％濕度)或者類似空氣條件的溫室。從成熟植物中收集T1種子。然后轉化植物通過在補充卡那霉素(50μg/ml)的MS瓊脂板的選擇培養基上T1種子的生長來鑒定。
實施例10在轉基因植物中TER基因功能的體外分析酶活性和動力學參數的測定在本技術領域中已很好地建立。TER活性可根據Inui及其同事(Inui等人，1984)的方法進行測定。
實施例11過表達TER基因的轉基因擬南芥植物中的脂類含量如Cahoon等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2212935-12940)和Browse等人(1986，Anal.Biochemistry 442141-145)所描述，從植物材料中提取植物脂類。脂類和脂肪酸的定性和定量分析在Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology.Ayr/ScotlandOily Press.-(Oily PressLipid Library；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.APractical Guide-Ayr，ScotlandOily Press，1989Repr.1992.-IX，307)中有描述。
與不表達SEQ ID NO1、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的空載體擬南芥對照植物相比，來自過表達SEQ ID NO1、SEQ ID NO4或SEQ IDNO6的擬南芥植物的干T2代種子中總脂類含量有所增加。作為例子，表4中給出了經常規氣相色譜分析測定的T2種子的脂類含量，其以每mg過表達SEQ ID NO4的植物干種子中脂肪酸的mg來計算。
表4SEQ ID NO4過表達后的總種子脂類

圖9顯示了當與攜帶空pSun300-USP載體的對照植物相比，以相對種子脂類含量表示時，可觀察到明顯的增加。圖9描述了表達在種子特異性啟動子控制下的SEQ ID NO4的植物擬南芥T2(灰色柱)種子油類含量。白色柱代表T2對照。誤差棒代表了兩個獨立的T2種子提取物的標準差。所有值以相應對照植物平均值的百分數來顯示。獨立的線表示與對照相比種子儲存脂類至少增加10％。
實施例12以序列比較為基礎的反-烯酰活性的氨基酸殘基特點表3顯示了具有最接近發現序列的TER蛋白質序列的比對。另一方面，與來自公開數據庫的質體烯酰-ACP-還原酶序列相比較顯示幾乎沒有總體同源性，但是暗示了某些可能保守的氨基酸殘基。下面的表4列舉了在植物質體烯酰-ACP-還原酶以及在裸藻屬反-烯酰輔酶A還原酶中保守的TER(SEQ ID NO2)氨基酸殘基以及表3中顯示的序列同源物。表5顯示的氨基酸殘基顯示與烯酰還原酶功能有關，而與ACP或輔酶A依賴無關。還顯示了氨基酸殘基的相對位置，但本技術領域中的技術人員可以預見這些關鍵殘基的相對位置中有5-10個氨基酸的變異，在某些情況下有20-30個氨基酸的變異將出現在酶家族的一些成員中。
表5與烯酰還原酶功能相關的氨基酸殘基

由斜線分開的氨基酸在此位置上可以互換。括號里列舉的氨基酸可在大多數序列中發現。
序列表<110>巴斯植物科學有限公司(BASF PLANT SCIENCE GMBH)<120>細小裸藻的TER基因<130>AE 20030715<140>PF 54922<141>2003-10-10<160>11<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1620<212>DNA<213>細小裸藻(Euglena gracilis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1620)<223>
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權利要求
1.具有反-2-烯酰-CoA還原酶(TER)(EC 1.3.1.44)活性的分離多肽，其包含選自下列的多肽序列a)如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所描述序列，b)與如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所描述序列具有至少60％同一性的序列，和c)包含如SEQ ID NO2所描述序列中的至少10個連續氨基酸殘基的序列。
2.分離的核酸分子，其包含選自以下的序列a)如SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所描述的序列，b)編碼如權利要求1所述多肽的序列，和c)在嚴格條件下與編碼如權利要求1所述多肽的序列雜交的序列。
3.增加植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中總油類含量的方法，其包括a)將多核苷酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8或SEQ ID NO10在所述植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中進行轉基因表達，和b)選擇與起始生物體相對照或相比較在所述植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中的總油類含量增加的植物生物體。
4.如權利要求3所述的方法，其中TER蛋白質由選自下列的核酸序列編碼a)包含與核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸序列；b)包含含有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列中至少30個核苷酸片段的核酸序列；c)編碼多肽的核酸序列，其中所述多肽包含與氨基酸序列SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有至少60％同一性的氨基酸序列，和d)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的多肽片段的核酸序列，其中片段包含氨基酸序列SEQ ID NO2中至少10個連續氨基酸殘基。
5.權利要求3或4所述的方法，其中植物是油料作物。
6.權利要求5所述的方法，其中植物種子中總油類含量有所增加。
7.包含與調節序列結合的核酸序列的表達盒，其中所述核酸序列選自a)包含與核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸序列；b)包含含有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列中至少30個核苷酸片段的核酸序列；c)編碼多肽的核酸序列，其中所述多肽包含與氨基酸序列SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11具有至少60％同一性的氨基酸序列，和d)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的多肽片段的核酸序列，其中片段包含氨基酸序列SEQ ID NO2中至少10個連續氨基酸殘基，其中所述調節序列能夠調節所述核酸序列在植物中的表達。
8.根據權利要求7所述的表達盒，其中所述核酸序列編碼包含SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所示氨基酸序列的多肽。
9.權利要求7或8所述的表達盒，其中啟動子是種子特異性啟動子。
10.遺傳修飾的植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料，其包含如SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11所定義的多肽或如權利要求7-9中任意一項所述的表達盒。
11.如權利要求10所述的遺傳修飾植物生物體，其中植物生物體選自油料作物Borvago officinalis、蕓苔油菜(Brassica campestris)、歐洲油菜(Brassica napus)、蕪箐(Brassica rapa)、大麻(Cannabis sativa)、紅花(Carthamus tinctorius)、椰子(Cocos nucifera)、海甘藍(Crambeabyssinica)、Cuphea species、油棕(Elaeis guinensis)、美洲油棕(Elaeisoleifera)、大豆(Glycine max)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、海島棉(Gossypium barbadense)、草本棉(Gossypium herbaceum)、向日葵(Helianthus annuus)、亞麻(Linum usitatissimum)、月見草(Oenotherabiennis)、油橄欖(Olea europaea)、稻(Oryza sativa)、蓖麻(Ricinuscommunis)、胡麻(Sesamum indicum)、小麥屬(Triticum)物種、玉蜀黍(Zeamays)、胡桃和扁桃。
12.如權利要求10或11所述的遺傳修飾植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料的用途，其用于生產三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸或上述物質的衍生物。
全文摘要
本發明涉及細小裸藻來源的核苷酸序列SEQ IDNO1的鑒定和用途，當所述序列表達時將增加轉基因生物體所產生的油類(如三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油、磷脂、蠟酯和/或脂肪酸)總量。
文檔編號A01H5/00GK1882684SQ200480033794
公開日2006年12月20日 申請日期2004年10月8日 優先權日2003年10月10日
發明者P·奇爾普斯, O·奧斯瓦德, J·萊爾希爾, W·F·馬丁, M·霍夫麥斯特 申請人:巴斯福植物科學有限公司