富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法及蠟酯制造方法

專利名稱：富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法及蠟酯制造方法
技術領域：
本發明涉及富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法及蠟酯制造方法，所述富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法能夠以低能量、低成本生產富含成為生物燃料的原料的蠟酯的微藻類的裸藻屬藻體。
背景技術：
近年來，全球暖化問題日益嚴重，抑制作為溫室效應氣體之一的二氧化碳氣體的排放量、通過固定二氧化碳而降低大氣中的二氧化碳濃度成為大的課題。
這樣的情況下，使用含有被固定的二氧化碳的化石燃料作為能源會導致將固定的二氧化碳再次釋放到大氣中，而成為環境問題。另外，由于化石燃料為有限的資源，因此也存在枯竭的問題。
為了解決如上述那樣的問題，需要除化石燃料以外的燃料源，對以高等植物或藻類為原料的生物燃料的開發的期待升高。
作為成為生物燃料原料的候選的高等植物，已知有大豆、玉米、棕櫚等，但在以可食用作物為原料的情況下，有可能導致糧食不足而成為問題。另一方面，利用麻風樹、亞麻薺等非食用植物的生產也正在推進，但是存在每單位面積的生產量低的問題。
另一方面，普遍棲息于湖或沼澤中的光合微生物或原生動物具有與植物相同的光合能力，從水與二氧化碳生物合成碳水化合物和脂質，在細胞內蓄積幾十質量％。已知，與植物相比，其生產量以每單位面積計，為被認為其生產量高的棕櫚的10倍以上。
但是，作為一種光合微生物的微藻類的裸藻屬藻體為鞭毛蟲的一組，包括作為有運動性的藻類有名的 眼蟲藻(日文$ K 'J ^ ) 0大部分的裸藻屬藻體具有葉綠體，進行光合作用，而進行獨立營養生活，也有的捕食或者吸收營養。裸藻屬(Euglena)為分類到動物學與植物學的雙方的屬。
在動物學中，有屬于原生動物門(Protozoa)的鞭毛蟲綱(Mastigophorea)、植鞭亞綱(Phytomastigophorea)的目中的眼蟲目(Euglenida),其由三個亞目、即眼蟲亞目 (Euglenoidina)、Peranemoidina、Petalomonadoidina 組成。
在眼蟲亞目中，包括眼蟲屬(Euglena)、殼蟲藻屬(Trachelemonas)、陀螺藻屬 (Strombonas)、扁裸藻屬(Phacus)、鱗孔藻屬(Lepocinelis)、變胞藻屬(Astasia)、柄裸藻屬(Colacium)作為屬。在植物學中，有裸藻門(Euglenophyta),其下面有裸藻綱 (Euglenophyceae)、裸藻目(Euglenales),作為包括在該目中的屬，除了裸藻屬(Euglena) 以外，與動物分類表相同。
裸藻屬藻體在細胞內蓄積裸藻淀粉(Paramylon)作為碳水化合物。裸藻淀粉為約 700個葡萄糖通過β-1，3-鍵聚合的高分子體粒子。
裸藻屬藻體如果被置于厭氧狀態，則分解儲備多糖、即裸藻淀粉而進行以由脂肪酸和脂肪醇形成的蠟酯為最終產物的蠟酯發酵。
在非專利文獻I中記載了，將裸藻屬藻體在光照射下培養后，在置換成無氮源的培養基的實驗區，每I個細胞的裸藻淀粉蓄積量增加，但在置換成添加了氮源的培養基的實驗區，每I個細胞的裸藻淀粉含量降低。
在專利文獻I中記載了，通過將裸藻屬藻體好氧培養后置于厭氧條件下，從而使儲備多糖裸藻淀粉發酵并轉換成蠟酯。
在專利文獻2中記載了如下方法通過將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養，添加不飽和脂肪酸后，置于厭氧條件下，從而使儲備多糖裸藻淀粉發酵并轉換成蠟酯，由此生產不飽和蠟酯，該不飽和蠟酯成為用作優質潤滑油的抹香鯨油的代替原料。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1:日本特公平3-65948號公報
專利文獻2 :日本特公平5-27384號公報
非專利文獻
非專利文獻1:Sumida et al. , Ammoni a-and Linght-1nduced Degradationof Paramylum in Euglena gracilis. Plant Cell Physiol.28 (8).P1587-1592 (1987)發明內容
發明所要解決的課題
但是，在非專利文獻I中，僅對裸藻淀粉的分解控制有記載，并未暗示與蠟酯發酵的組合。
另外，在專利文獻I中，作為好氧培養的方法，僅公開了添加葡萄糖等有機物作為碳源、或者在通常的光合條件下進行培養等通常的方法。
在生物燃料的制造中，使用葡萄糖等碳源的培養法并不劃算，與二氧化碳的固定也無關。
此外，專利文獻2中所公開的技術的目的在于，以高收量得到不飽和蠟酯，但作為生物燃料的原料，飽和蠟酯更為理想。
本發明的目的在于解決上述各問題，提供富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法及蠟酯制造方法，所述富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法通過利用光合作用以二氧化碳為碳源將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養后，在氮饑餓狀態下進一步進行培養，從而增加每一個細胞的裸藻淀粉蓄積量，然后置于厭氧狀態下，由此能夠生產富含蠟酯的裸藻屬藻體。
用于解決課題的手段
上述課題是根據本發明的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，通過包括如下工序來解決的 第I工序，將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養；第2工序，使培養有所述微藻類的裸藻屬藻體的培養基為氮饑餓狀態后進一步進行培養;第3工序，將細胞保持在厭氧狀態下。
如此，通過實施好氧培養一在氮饑餓狀態下進一步進行培養一將細胞保持在厭氧狀態下這樣的一系列工序，能夠有效生產蠟酯的含量高的裸藻屬藻體。
S卩，通過工序2的氮饑餓狀態下的培養，能夠使裸藻屬藻體充分蓄積碳水化合物。
因此，在工序3中，通過將在工序2中培養的細胞置于厭氧狀態，使在工序2中充分蓄積的碳水化合物轉換為蠟酯，因此結果是在工序3中的蠟酯蓄積量飛躍性增加。
換言之，通過組合這些工序I —工序2 —工序3，產生蠟酯的蓄積量飛躍性增加這樣的有益效果。
另外，在氮饑餓狀態下培養的裸藻屬藻體的細胞即使在剛剛厭氧處理后也呈現與培養時同樣的綠色，幾乎沒有死亡細胞，細胞的大小也與厭氧處理前沒有變化。
S卩，當在不含氮源的培養基中進行厭氧處理時，還產生與含有氮源的培養基的情況相比裸藻屬藻體的細胞的生存率大幅改善這樣的有益效果。
另外，此時，所述氮饑餓狀態如果通過將上述培養基置換成氮源缺乏培養基來創建，則能夠有效創建氮饑餓狀態，因此優選。
如此，通過實施好氧培養一置換成氮源缺乏培養基進一步進行培養一將細胞保持在厭氧狀態下這樣的一系列工序，能夠有效生產蠟酯的含量高的裸藻屬藻體。
具體地說，優選地在所述第I工序中，在將所述微藻類的裸藻屬藻體用不含氮源的培養基開始好氧培養的同時，適宜地調節流加量而加入氮源，進行持續且好氧的培養，當細胞濃度達到一定水平時停止氮源的流加，在所述第2工序中，置于氮饑餓狀態下進一步進行培養。
進而，具體地說，在所述第I工序中，通過通入二氧化碳氣體，而賦予混有二氧化碳源的氧氣源，所述二氧化碳氣體更優選為從發電廠排放的二氧化碳氣體。
通過這樣構成，可以將培養過程確定而進行工業化，而 能夠進行大量生產。
進而，能夠有效利用作為排放氣體可得到的二氧化碳氣體，因此成為在成本方面上有利、且在環境方面也非常有用的技術。
另外，就工序2的氮饑餓狀態而言，由于在工序I中停止氮源的流加，因此產生裸藻屬藻體同化全部氮源的結果。
此外，優選在所述第3工序中，利用從通入不活潑氣體、靜置處理、借助離心分離的濃縮中選擇的至少一種方法，進行厭氧處理。
可以選擇其中一種方法，也可以組合多種方法。
另外，上述課題是根據本發明的蠟酯制造方法，通過使用富含蠟酯的裸藻屬藻體， 該裸藻屬藻體利用方案I至方案5中任一項所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法來生產，并實施如下工序來解決的用有機溶劑提取油組份而得到提取液，將該提取液濃縮而得到蠟成分的工序；利用柱從所述蠟成分中分離蠟酯而進行第I精制的工序。
如此，在本發明中，可以利用培養后的裸藻屬藻體，簡易地精制蠟酯成分。
該裸藻屬藻體可以利用上述方案I至方案6中所述的方法，以富含蠟酯的狀態簡易且大量培養。
因此，根據本發明，可以利用大量培養的裸藻屬藻體，穩定地供給優質且清潔的燃料。
具體地說，所述濃縮優選在50°C 土 10°C的范圍內實施。
如果低于該溫度，則因蠟成分的粘性而突沸，無法消除蠟成分噴出到濃縮器、即蒸發器內的可能性。
更具體地說，優選實施如下的工序作為后續工序對通過所述進行第I精制的工序而得到的所述蠟酯進行水解，進行第2精制的工序。
如果這樣構成，則可以將在第I精制中粗制的物質通過第2精制進一步精制，而可以提供更優質的燃料。
即，通過在進行第I精制的工序后，在第2精制中進行水解，從而碳鏈變短，揮發性增加，作為燃料的價值升高。
另外，在所述進行第I精制的工序中，作為適用于所述柱的洗脫溶劑，優選使用己烷或者將醚以10體積％以下混合后的己烷和醚的混合溶劑。
如果這樣構成，則可以有效分離葉綠素，并且可以有效排除其他色素，因而優選。
因此，可以提供更優質的燃料。
另外，利用上述蠟酯制造方法由裸藻屬藻體制造的蠟酯成為優質的生物燃料，這些生物燃料可以大量且穩定地提供。
此外，其為清潔能源，大大有助于改善環境問題等。
如上所述，為了解決上述課題，本發明的蠟酯制造方法的最大特征在于，包括將裸藻屬藻體好氧培養的培養工序；通過在培養工序后、在氮饑餓狀態下進一步進行培養使碳水化合物蓄積的培養工序；通過將培養的細胞置于厭氧狀態而使碳水化合物轉換為蠟酯的厭氧發酵工序。
發明效果
根據本發明，可以由通過光合作用而固定的二氧化碳廉價地提供油脂含量多的生物質原料。
另外，如果根據本發明來制造生物燃料，則也帶來能源自給率的提高。


圖1為示出本發明的第I實施方式涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法的工序圖。
圖2為示出本發明的第2實施方式涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法的流程圖。
圖3為示出本發明的一實施方式涉及的蠟酯的制造方法的工序圖。
具體實施方式
下面，基于附圖，說明本發明的一實施方式。
需要說明的是，下面說明的構成并不限定本發明，而在本發明的主旨的范圍內能夠進行各種改變。
本實施方式涉及一種裸藻屬藻體的生產方法,其通過在好氧條件下培養裸藻屬藻體后，在氮饑餓狀態下進一步進行培養，然后置于厭氧狀態，從而使裸藻屬藻體富含蠟酯。
(第I實施方式)
根據圖1，對本發明涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法的第I實施方式進行說明。
本生產方法包括工序1(相當于第I工序)，將裸藻屬藻體用添加了氮源的培養基進行好氧培養；工序2 (相當于第2工序)，置換成不含氮源的培養基而進行好氧培養；工序3 (相當于第3工序)，進行厭氧處理，使碳水化合物發酵成蠟酯。
首先，工序I中的裸藻屬藻體的培養也可以通過將大氣通入培養基中作為二氧化碳源來進行，但為了提高培養效率，優選將二氧化碳氣體通入培養基中。
S卩，由于在大氣或二氧化碳氣體中還含有氧氣，由此進行好氧培養。
二氧化碳氣體的通入可以通過利用例如從工廠或發電廠等排放的燃燒排氣來進行。此時，優選利用集塵機、脫硝裝置、脫硫裝置等預先去除燃燒排氣中的塵埃、NOx和S0X。 另外，攪拌可以采用借助通氣的氣升(airlift)方式、或使用攪拌葉片的方法等通常的技術。
對于光而言，可以通過照射熒光燈等人工光進行培養，但為了以更低能量、更低成本進行培養，優選僅用太陽光進行培養。
另外，培養基的水溫優選控制在29± 1°C。
但是，為了對水溫控制不投入能量而不進行溫度控制，或者若進行水溫控制，則優選進行如下的最小限度的控制按照不會達到裸藻屬藻體死亡那樣的高溫的方式進行冷卻、按照在冬季或夜間水溫不會下降過低的方式加熱等。
作為裸藻屬藻體的培養基組成，例如可以使用改良Cramer-Myers培養基 ((NH4)2HPO41. Og/L, KH2PO41. Og/L、MgSO4 · 7H20 O. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、Fe2 (SO2)3 · 7H20 3mg/L、MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、鹽酸硫胺素(維生素 B1) 0. lmg/L、 氰鈷胺素(維生素B12)、(ρΗ3·5))。另外，(NH4)2HPO4可以改變為(NH4)2S04或NH3aq。
需要說明的是，培養基組成當然并不限于此。
培養基的pH只要在2 7. 5的范圍內即可，但優選調節到3. 5或5. 5。特別是，通過使pH為4. 5以下的酸性，能夠有效抑制動物性浮游生物或細菌等的污染。
接著，在工序2中，置換成不含氮源的培養基，進一步進行培養。
工序2中的不含氮源的培養基組成例如可以使用Resting培養基、I %甘露醇、 O. 2% MgCl2 · 6Η20、0· 14% ΚΗ2Ρ04。
需要說明的是，培養基組成只要不含氮源則當然并不限于此。
接著，在工序3中，進行培養后的裸藻屬藻體的厭氧處理。
厭氧處理通常通過向培養后的培養基中通入氮氣等不活潑氣體來進行。此外，厭氧處理也可以通過將培養基靜置來進行。這是因為，如果將培養基不攪拌而靜置則細胞會沉淀，形成高密度，結果導致缺氧。也可以通過利用離心分離制造高密度狀態來進行厭氧處理。
此時的pH只要不是極度低或高的值即可，光照射的有無對蠟酯發酵沒有影響。保持溫度只要不是裸藻屬藻體死亡那樣的高溫、培養基凍結那樣的低溫即可。通常在6小時 72小時內蠟酯發酵結束。
另外，通過在工序2的氮饑餓狀態下的培養，能夠使碳水化合物充分蓄積在裸藻屬藻體內。
因此，在工序3中，通過將在工序2中培養后的細胞置于厭氧狀態，使在工序2中充分蓄積的碳水化合物轉換為蠟，因此結果是工序3中的蠟酯蓄積量飛躍性增加。
換言之，通過將這些工序I —工序2 —工序3組合，產生蠟酯的蓄積量飛躍性增加這樣的、由各單獨工序得不到的有益效果。
另外，在下述實施例中會進行詳述，在氮饑餓狀態下培養的裸藻屬藻體的細胞在剛剛厭氧處理后也呈現與培養時同樣的綠色，幾乎沒有死亡的細胞，細胞的大小也與厭氧處理前沒有變化。
S卩，如果用不含氮源的培養基進行厭氧處理，則還產生與含有氮源的培養基相比裸藻屬藻體的細胞的生存率大幅改善這樣的有益效果。
如上所述，通過將這些工序I —工序2 —工序3組合，可以得到與以往相比含有顯著多的蠟酯的細胞活性高的裸藻屬藻體。
(第2實施方式)
根據圖2，對本發明涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法的第2實施方式進行說明。
需要說明的是，由于培養基組成、培養條件等與第I實施例相同，因此省略同樣的說明，僅對不同點進行說明。
工序I中的好氧培養工序中，使用從第I實施方式的工序I中的改良 Cramer-Myers培養基中去掉氮源的培養基。
S卩，在開始階段，用不含氮源的培養基開始裸藻屬藻體的好氧培養。
工序I中，首先，在步驟SI中，向接種了裸藻屬藻體的培養基流加氮源。
然后，由步驟S2進行好氧培養。
接著，在步驟S3中，判定能否終止氮源添加。
在步驟3中，如果判定為不終止氮源添加(步驟S3 :否)，則處理返回至步驟SI而流加氮源。
另外，在步驟3中，如果判定為可以終止氮源添加(步驟S3 :是)、則處理推進至步驟S4，終止氮源添 加。
S卩，在工序I中，逐漸流加氮源，進行含氮源的好氧培養。
該氮源的流加量等依賴于氣候、氣溫等條件，通過考慮這些條件來適宜地調節。
另外，作為終止氮源添加的大概標準，本實施方式中，在考慮上述條件等的同時， 選擇例如細胞濃度達到一定水平的時期等。
接著，在工序2(步驟S5)中，繼續進行必要期間的好氧培養。
此時，雖然在初始階段殘留有氮源，但隨著時間的推移氮源被裸藻屬藻體同化，形成氮源饑餓狀態。
由此，實現所謂工序2的“好氧培養工序、無氮源”這樣的培養工序。
接著，在步驟S6中，實施工序3的厭氧發酵工序，該工序與第I實施方式相同。
另外，作為添加氮源的方法，還可以考慮將氮源在培養開始時一次性投入的方法。
該情況下，雖然在初始階段殘留有氮源，但隨著時間的推移氮源被裸藻屬藻體吸收，形成氮源饑餓狀態。
由此，實現氮饑餓狀態下的好氧培養、即“好氧培養工序、無氮源”這樣的培養工序。
上述第2實施方式涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法在對工業化生產線進行放大時有效。
S卩，可通過連續操作進行培養，而不需要用于置換培養基的離心分離作業等。
因此，減少培養所需的能源用量，有效應用于富含蠟酯的裸藻屬藻體的大量生產。
接著，參照圖3，對本實施方式涉及的由裸藻屬藻體制造蠟酯的方法的工序進行說明。
首先，在工序i中培養裸藻屬藻體。這是上述第I實施方式或第2實施方式涉及的生產工序中的培養。
接著，在工序2中提取蠟酯。
然后，將工序2中所得到的成分在工序3中進行第I精制，接著，在工序4中進行第2精制，得到蠟酯。
在第I精制中，利用有機溶劑由裸藻屬藻體提取蠟酯，在第2精制中，利用柱進行蠟酯的分離精制。
這樣精制的蠟酯有效用作含有該蠟酯的生物燃料。
實施例
(關于富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法)
下面，對本發明涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體，示出一實施例而進行具體說明。
在該實施例中，使用了 Euglena graclilis Z株。
培養基通過對改良Cramer-Myers 培養基((NH4) 2HP041. Og/L、KH2PO4L Og/L、 MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、Fe2(SO2)3 · 7H20 3mg/L、 MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、 CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、 鹽酸硫胺素(維生素B1W. lmg/L、氰鈷胺素(維生素B12)、(ρΗ5· 5)) 進行高壓鍋滅菌來制備。
(工序1:好氧培養)
將制備的培養基880ml放入IL容量的振蕩培養瓶內后，以初始濃度為約O. 05g/ L的方式接種裸藻屬藻體的種藻體，在設定為29°C的人工氣候箱(SANYO公司制、GROWTH CABINET)內振蕩培養9天。光照射強度設為約100 μ mol/(m2 · s)，光照射時間設為24小時連續進行。向培養瓶中，供給二氧化碳氣體至其濃度為10%。
(工序2:缺氮培養)
培養9天后，將培養液分成2份，分別置換成不含氮源的培養基、含有氮源的培養基。
具體地說，從880ml的培養液分盛各420ml的培養液，分別離心分離舍棄上清液后，向一方沉淀中加入去掉氮源的改良Cramer-Myers培養基(以下,稱為氮源缺乏培養基，KH2PO41. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、 Fe2 (SO2) 3 · 7H20 3mg/L、MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/ UNa2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、鹽酸硫胺素(維生素 B1) 0. lmg/L、氰鈷胺素(維生素B12)、(ρΗ5· 5) 420ml，向另一方沉淀中，加入新的CM培養基(包含氮源)420ml， 并將沉淀混懸。
將置換成氮源缺乏培養基的培養液作為樣品1，將置換成新的CM培養基的培養液作為樣品2。
替換培養基后，在設定為29°C的人工氣候箱內進一步將樣品I與樣品2同時進行振蕩培養48小時。光照射強度設為約100 μ mol/(m2 · s)，光照射時間設為24小時連續進行。向培養瓶中，供給通入濃度為10%的二氧化碳氣體。
(工序3:厭氧處理)
進行培養基置換培養后，測定樣品I和樣品2的干燥重量(表1A)，在設定為29°C 的人工氣候箱內遮光密封培養瓶，靜置，由此將細胞置于厭氧狀態。
培養液中的裸藻屬藻體細胞的干燥重量的測定方法如下。
在干燥機內、于105°C，預先干燥30分鐘，用測定了重量的具有約I μ m的孔徑的玻璃纖維濾紙GS-25(ADVANTEC公司制)過濾培養液1ml。接著，將玻璃纖維濾紙放入設定為 105 °C的干燥機內，干燥I小時。其后，在真空干燥器內一邊進行減壓一邊進行20分鐘的脫濕、冷卻，然后用精密天平秤測定重量。將過濾前后的濾紙的重量之差作為每Iml的干燥重量。
進行厭氧處理48小時后，回收兩個樣品。使用離心分離機(K0KUSAN公司制、 H-103FN)，在常溫下，以3000rpm將回收的400ml的培養液離心分離5分鐘后，舍棄上清液， 回收沉淀的藻體。將回收的藻體冷凍后，進行冷凍干燥。
(脂質的提取)
將50ml容量的茄型燒瓶在真空干燥器內干燥約I小時，測定茄型燒瓶本身的重量。將冷凍干燥后的裸藻屬藻體粉末用抹刀等破碎，將該粉末稱量并放入50ml容量的三角培養瓶中。此時，樣品I的重量為O. 693g、樣品2的重量為O. 480g(表1B)。
接著，在各樣品中加入20ml的己燒，進彳丁混懸。為了進一步破碎粉末塊，進彳丁 30秒鐘的超聲波破碎。將自然沉淀后的上清液用巴斯德吸管轉移到50ml容量的帶蓋玻璃制離心管中，以3000rpm離心分離10分鐘,上清液通過濾紙(Advantec公司、NO. 2)進行過濾。
提取操作在更換溶劑的條件下反復進行計9次。
S卩，使用己烷將上述的提取操作反復進行3次后，將有機溶劑更換為丙酮而同樣地進行提取操作3次，最后使用將己烷與丙酮以1:1混合的溶劑進行提取操作3次。
其后，使用旋轉蒸發器(東京理化器械公司制、ROTARY VACCUUMEVAP0RAT0R)，將含有濾液的茄型燒瓶在40 50°C下進行熱水浴，使己烷、丙酮蒸發。使用少量的己烷，一邊刷洗茄型燒瓶內，一邊轉移到已秤量的茄型燒瓶內。將該操作反復進行4次后，與上述同樣地蒸發己烷。
用鋁箔蓋住茄型燒瓶，放入真空干燥器內，使剩余的己烷蒸發，并干燥30分鐘 I 小時左右。
測定從裸藻屬藻體粉末提取脂質后的茄型燒瓶的重量，減去最初測定的茄型燒瓶本身的重量，而計算出脂質重量(表1C)。
需要說明的是，利用本提取方法來提取的脂質的絕大部分由蠟酯構成。
本實驗的結果，就最終的粗脂質的提取量而言，用氮源缺乏培養基培養的樣品I 為O. 188g，用含有氮源的CM培養基培養的樣品2為O. 157g，用氮源缺乏培養基培養的樣品的粗脂質的收量多O. 031g(表1C)。
另外，就相對于厭氧處理前的干燥重量的粗脂質的含有率而言，用氮源缺乏培養基培養的樣品I為23%，用含有氮源的CM培養基培養的樣品2為16%，用氮源缺乏培養基培養的樣品的脂質含有率也高7% (表1C/A)。
進而，樣品I在厭氧處理的前后細胞重量減少約O. 120g，在樣品2中細胞重量也減少了 O. 507g(表1B)。剛剛厭氧處理后的樣品2的培養液變為茶色，進行顯微鏡觀察的結果，死亡的細胞多，生存的細胞的大小也變小。另一方面，樣品I在剛剛厭氧處理后也呈現與培養時同樣的綠色，進行顯微鏡觀察的結果，幾乎沒有死亡的細胞，細胞的大小也與厭氧處理前沒有變化。由以上的結果可知，如果用不含氮源的培養基進行厭氧處理，則與含有氮源的培養基相比細胞的生存率大幅改善。
將結果總結于表I。
[表 I]
AB.CCxA厭氧處理前干燥重量 (g /'400ml)厭氧處理后干燥重量 (g / 4 O Oml)粗脂質提取量 (g / 4 0 0ml'}脂質含有率 ■%；樣品I (氮源缺乏培養基)O. 8 13O. 6 9 3O18 82 3樣品2 (CM 培養基)O 9 8 7O. 4 8 0O, I 5 7I b
由以上結果可知，與用含氮源的培養基培養的實驗區相比，在被置于氮饑餓狀態的實驗區中，不僅最終的脂質的收量增加，而且厭氧處理前后的細胞的生存率也顯著改善。
(關于蠟酯的分離精制)
接著，對于從裸藻屬藻體提取蠟酯并精制的步驟的一實施例進行說明。
本實施方式中，使用粉末化的裸藻屬藻體，提取貯藏于裸藻屬藻體體內的蠟酯并精制(工序2)。
(材料)
裸藻屬藻體粉末I Okg己烷60L乙醚ILWakogel C-300300g
1.提取及過濾
(I)秤量裸藻屬藻體Ikg,混懸于2. 5L己燒中
(2)用攪拌機劇烈攪拌
30 秒鐘 X3 次
(3)在室溫下放置10分鐘，使裸藻屬藻體粉末自然沉淀
(4)將上清液用濾紙抽濾
(5)將沉淀物轉移到布氏漏斗中，擠出附著于沉淀物的油成分
(6)將(4)的濾液和(5)的回收液轉移到茄型燒瓶中，用旋轉蒸發儀濃縮(濃縮條件溫度50°C 土 10°C、減壓度IOOmmHg 150mmHg)。以下將該濃縮液記作“濃縮樣品”。
2.分離精制(工序3)
(I)向玻璃柱(I 00φ)內填充30厘米左右(填充約300g)的用己烷混懸的Wakogel C-300
(2)流過I個柱容積的己烷使柱平衡
(3)將約500g左右的濃縮樣品投入柱內
(4)用洗脫溶劑從保持在柱上的濃縮樣品分離蠟成分，其中所述洗脫溶劑使用如下3種溶劑
a.己烷乙醚=100 0(以下，記作“洗脫溶劑a”)
b.己烷乙醚=95 5 (以下，記作“洗脫溶劑b”)
c.己烷乙醚=90 10 (以下，記作“洗脫溶劑c”)
(5)通過對分離的蠟成分進行酸水解來進行第2精制(工序4)。
結果
示出利用上述方法來實施的蠟酯的提取結果。
(I)由裸藻屬藻體IOKg提取到約3L左右的蠟成分。
根據最終的回收率可認為，通過一次的己烷提取能夠將蠟成分幾乎全部回收。
(2)進行過濾時，過濾性不良，因此在濾紙上散撒硅藻土后進行過濾。
(3)進行濃縮時，如果在30°C左右進行濃縮，則因揮發熱而濃縮液冷卻，從表面開始蠟成分的粘性變高，因突沸 而噴出到蒸發器內。為了避免該現象，如果在50°C左右進行濃縮，則蠟成分的粘性下降，能夠避免因突沸噴出到蒸發器內。
(4)流過I個柱容積的己烷使柱平衡后，將約500g左右的濃縮樣品投入柱內，但 280g左右未得到保持，而直接洗脫下來。因此，流過2個柱容積的洗脫溶劑a，將未保持的成分洗脫而濃縮。
(5)然后，流過3個柱容積的洗脫溶劑b，進行洗脫及濃縮，結果可知，蠟成分與黃色的色素一起被洗脫下來。
(6)接著，為了完全洗脫蠟成分，流過3個柱容積的洗脫溶劑C，進行洗脫及洗脫。
此時，能夠回收約240g(300mL)左右的蠟成分。
另外，雖然能夠分離出葉綠素成分，但若干色素雖然濃度很低但殘留下來。
考察
根據上述的結果，用于保持240g左右的蠟成分所需的柱容量為約2L(約Ikg)，洗脫所需的溶劑的量為9個柱容積(約18L)。
可知，在蠟成分為2. 5kg的情況下，所需的柱容量為約24L(約12kg)，洗脫所需的溶劑的量為約200L左右。
如上所述，通過在分離后，進行水解，從而蠟酯的碳鏈變短，揮發性增加，作為燃料的價值升高。
并且，該蠟酯可以有效使用作為生物燃料。
裸藻屬藻體在健康食品等中也使用，如此，其是容易獲得的微生物，并且能夠大量培養。
通過從這樣的微生物、即裸藻屬藻體回收優質的蠟酯，能夠穩定地供給清潔的能量。
需要說明的是，本例中，雖然用有機溶劑進行提取，但提取方法并不限于此，例如， 也可以使 用這樣的方法用水分離、使用二氧化碳流體的方法、壓榨等物理方法。
權利要求
1.一種富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，其包括第I工序將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養；第2工序將培養有所述微藻類的裸藻屬藻體的培養基設為氮饑餓狀態后進一步進行培養；以及第3工序將細胞保持在厭氧狀態下。
2.根據權利要求1所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，其特征在于，所述氮饑餓狀態通過將所述培養基置換成氮源缺乏培養基來創建。
3.根據權利要求1所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，其特征在于，所述第I工序中，在將所述微藻類的裸藻屬藻體用不含氮源的培養基開始好氧培養的同時，適宜地調節流加量而加入氮源，進行持續且好氧的培養，當細胞濃度達到一定水平時停止氮源的流加，所述第2工序中，置于氮饑餓狀態下進一步進行培養。
4.根據權利要求1或權利要求3所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，其特征在于，所述第I工序中，通過通入二氧化碳氣體，而賦予混有二氧化碳源的氧氣源。
5.根據權利要求4所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，其特征在于，所述二氧化碳氣體為從發電廠排放的二氧化碳氣體。
6.根據權利要求1所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，其特征在于，所述第3工序中，利用選自通入不活潑氣體、靜置處理、借助離心分離的濃縮中的至少一種方法，進行厭氧處理。
7.一種蠟酯的制造方法，其特征在于，使用利用權利要求1 6中任一項所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法所生產的富含蠟酯的裸藻屬藻體，并實施如下工序用有機溶劑提取油組份而得到提取液，將該該提取液濃縮而得到蠟成分的工序；利用柱從所述蠟成分中分離蠟酯而進行第I精制的工序。
8.根據權利要求7所述的蠟酯的制造方法，其特征在于，所述濃縮在50°C±10°C的范圍內實施。
9.根據權利要求7所述的蠟酯的制造方法，其特征在于，實施如下的工序作為后續工序對通過所述進行第I精制的工序而得到的所述蠟酯進行水解而進行第2精制的工序。
10.根據權利要求7所述的蠟酯的制造方法，其特征在于，所述進行第I精制的工序中， 使用己烷或將醚以10體積％以下混合后的己烷和醚的混合溶劑作為適用于所述柱的洗脫溶劑。
全文摘要
本發明提供富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法及蠟酯制造方法，所述裸藻屬藻體的生產方法通過利用光合作用以二氧化碳為碳源將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養后，在氮饑餓狀態下進一步進行培養，從而增加每一個細胞的裸藻淀粉蓄積量，然后置于厭氧狀態下，由此能夠生產富含蠟酯的裸藻屬藻體。本發明涉及富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產方法，其包括第1工序，將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養；第2工序，將培養基設為氮饑餓狀態后進一步進行培養；第3工序，將細胞保持在厭氧狀態下。
文檔編號C12N1/12GK103003413SQ201180035039
公開日2013年3月27日 申請日期2011年7月13日 優先權日2010年7月20日
發明者嵐田亮, 莎拉巴妮·米特拉 申請人:優瑞納股份有限公司