專利名稱：Cmv抗性相關分子標志及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及CMV(cucumber mosaic virus黃瓜花葉病毒)抗性相關分子標志及其用途，詳細講提供具有與植物體的CMV抗性性狀相關程度非常高的序列的核酸、含有上述核酸的一部分核苷酸序列的引物以及使用這些引物檢測CMV抗性植物體的方法。
背景技術：
黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus；以下稱為CMV)作為在植物病毒中宿主范圍最廣泛的植物病原病毒，給全世界的雙子葉和單子葉約900余種植物帶來很大的經濟災害。植物一旦被CMV感染，在葉、莖和果實中出現花葉癥狀。特別是染病的葉變小，變得皺皺巴巴，沿著葉脈產生病變。在果實中出現綠色濃淡不均的花葉，呈凹凸不平，商品價值下降。
另一方面，為了培育抗病性品種，不得不通過連續的逆代雜交從具有抗病性因子的其它品種中導入該因子，而在每個導入階段都必須要經過抵抗性測試后再進行選拔，從這樣的選拔階段開始如果利用與上述抗病性因子密切相關的分子標志(molecular marker)，那就太方便了。因此，與利用了分子標志的CMV診斷方法以及與通過轉化的CMV抗性品種開發有關的各種技術正在被開發。例如，在大韓民國專利申請第2000-0025699號中公布了能夠用一系列基因擴增用引物來診斷屬于黃瓜花葉病毒屬的CMV、花生矮化病毒和番茄不孕病毒的黃瓜花葉病毒診斷用引物的核苷酸序列以及利用了該引物的基因診斷和鑒定方法。大韓民國專利登錄第0293567號中公布了使在韓國國內分離的CMV膜被蛋白質的基因轉化番茄的針對CMV的抗性系統的開發方法。另外，大韓民國專利申請第1993-0029605號中記載了為了制造具有針對引起作物生病的CMV的抗性的轉化作物，攻擊CMV膜被蛋白質的基因RNA的錘頭狀核酸酶。
象上述那樣，與CMV抗性的診斷以及具有CMV抗性的植物開發有關的現有技術均以CMV膜被蛋白質的基因為對象，針對植物體固有的CMV抗性因子的技術開發的報告還沒有。
因此，一直迫切需要來自于含有CMV抗性因子的植物體系統的與上述病毒抗性有關的分子標志的開發，以及利用被開發的分子標志診斷植物體中有無CMV感染的方法的開發。
發明內容
本發明是根據上述那樣要求研究出的，本發明在于提供具有與CMV抗性性狀相關程度極高的核苷酸序列的分子標志及其用途。
為了達到上述那樣的本發明目的，本發明提供由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸。
為了達到本發明另一個目的，本發明提供含有選自序列2或序列22的核苷酸序列的一系列核苷酸序列的CMV抗性植物體檢測用引物。
為了達到本發明另一個目的，本發明提供含有上述核酸或引物的CMV抗性植物體檢測用試劑盒。
為了達到本發明另一個目的，本發明提供包括在上述核酸或引物存在的基礎上，對植物體的基因組DNA進行分析的檢測CMV抗性植物體的方法和決定上述植物體的基因型(genotype)的方法。
另外，為了達到本發明另一個目的，本發明提供通過組織培養無性繁殖的、含有由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸的CMV抗性植物體以及從該植物體收獲的種子。
以下對本發明進行詳細說明。
本發明提供與植物體的CMV抗性性狀相關程度高的分子標志(以下表示為‘CMV抗性相關分子標志’)。本發明提供的CMV抗性相關分子標志含有由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸。在上述描述中，核酸包括所有RNA、DNA和cDNA，優選DNA。本發明的分子標志是與CMV的抗性性狀密切相關的核苷酸序列，由于位于非常靠近CMV抗性基因的位置，即使使用上述核苷酸序列表現出的任意多態性，也可以把握植物體有無CMV的抗性。
另外，本發明的分子標志包括含有從上述核酸的核苷酸序列中選出的一系列核苷酸序列的CMV抗性植物體的檢測用引物。上述引物優選具有從序列2或序列22的核苷酸序列中選出的至少10個以上、更優選12個以上的一系列核苷酸序列。本發明引物可以設計成同行眾所周知的適用于各種DNA的多態性分析的RFLP(restriction fragment length polymerphism限制性片段長度多態性)、RAPD(randomly amplified polymorphic DNA隨機擴增多態DNA)、DAF(DNA amplification fingerprintingDNA擴增指紋)、AP-PCR(arbitrarilyprimed PCR隨機引物PCR)、STS(sequence tagged site序列標簽位點)、EST(expressed sequence tag表達序列標簽)、SCAR(sequence characterizedamplified regions序列特異擴增區域)、ISSR(inter-simple sequence repeatamplification簡單序列重復區間擴增)、AFLP(amplified fragment lengthpolymorphism擴增片段長度多態性)、CAPS(cleaved amplified polymorphicsequence酶切擴增多型性序列)、PCR-SSCP(single-strand conformationpolymorphism單鏈構象多態性)等(Jordan et al.，Theor.Appl.Genet.，106559-567、2003；Martins M.、R.et al.、Plant Cell Reports，2271-78、2003；Williams，J.G.K.et al.、Nucl.Acids Res.、186531-6535、1990；Michelmore，R.W.、et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.889828-9832、1991；Martins et al.、PlantCell Rep.、2271-79、2003；Orita et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862766-2770、1989)。為了進行DAF分析，可以設計使用由5-8個核苷酸構成的引物。例如，用于STS分析的引物可以設計成與RFLP標志的末端核苷酸序列一致，而用于SCAR分析的引物可以根據RAPD標志的末端核苷酸序列進行設計。另外，用于CAPS分析的引物可以設計成含有合適的限制性內切酶位點。本發明中提供的引物可以具有由序列1和從序列23至序列26構成的序列組中選出的核苷酸序列。另外，本發明的引物可以在不影響有關CMV抗性性狀的多態性檢測的范圍內進行改變(例附加、缺失、置換)。能夠對從序列2或序列22的核苷酸序列中選出的最少12個一系列核苷酸序列附加和/或置換任意核苷酸來進行改變。例如，可以具有序列27或序列28的核苷酸序列。
本發明的分子標志對于CMV抗性植物體的檢測非常有用。因此，本發明提供包括在上述核酸或上述引物存在下對植物體的基因組DNA進行分析的CMV抗性植物體的檢測方法。上述方法并不受此限制，可以使用如RFLP(restriction fragment length polymerphism)、RAPD(randomly amplifiedpolymorphic DNA)、DAF(DNA amplification fingerprinting)、AP-PCR(arbitrarily primed PCR)、STS(sequence tagged site)、EST(expressed sequencetag)、SCAR(sequence characterized amplified regions)、ISSR(inter-simplesequence repeat amplicafition)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)、PCR-SSCP(single-strandconformation polymorphism)等那樣的同行都眾所周知的各種DNA多態性分析來進行分析。(Jordan et al.，Theor.Appl.Genet.，106559-567、2003；MartinsM.、R.et al.、Plant Cell Reports，2271-78、2003；Williams，J.G.K.et al.、Nucl.Acids Res.、186531-6535、1990；Michelmore，R.W.、et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.889828-9832、1991；Martins et al.、Plant Cell Rep.、2271-79、2003；Oritaet al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862766-2770、1989)。最好是使用RFLP、RAPD或CAPS分析。
具體來說，上述的方法可以通過包括下述步驟的CAPS分析來進行。
(a)以從CMV抗性植物體和CMV易感性植物體得到的各基因組DNA作為模板，使用含有從序列2或序列22的核苷酸序列中選出的一系列堿基的引物來進行PCR的步驟；(b)將PCR產物用限制性內切酶進行酶切的步驟；(c)將被酶切的DNA片段加到瓊脂糖凝膠上進行電泳的步驟；以及(d)對電泳結束后的凝膠的DNA帶型進行比較的步驟。
上述(a)步驟的引物最好選自由序列23至序列28構成的群組。最好是使用從由序列23/24；序列23/25；序列23/26；以及序列27/28構成的群組中選出的引物組合。另外，上述(b)步驟的限制性內切酶只要是存在于序列2或序列22的核苷酸序列內的限制性內切酶，可以無限制地使用，優選使用XbaI或EcoR I。
另外，上述方法可以通過包括下面步驟的RAPD分析進行(a)以從CMV抗性植物體和CMV易感性植物體得到的各基因組DNA作為模板，利用可擴增序列2記載的核苷酸序列的引物進行PCR的步驟；(b)將PCR產物加到瓊脂糖凝膠上進行電泳的步驟；以及(c)對電泳結束后的凝膠的DNA帶型進行比較的步驟。
上述(a)步驟的引物為了擴增序列2記載的核酸，可以具有同行能夠設計的所有的核苷酸序列，優選具有序列1記載的核苷酸序列。
因此，上述方法可以通過包括下面步驟的RFLP分析進行(a)將從CMV抗性植物體和CMV易感性植物體得到的各基因組DNA用適當的限制性內切酶進行酶切的步驟；(b)將被酶切的DNA片段在瓊脂糖凝膠上進行電泳的步驟；(c)使凝膠上的DNA轉移到尼龍膜上的步驟；(d)以具有序列2記載的核苷酸序列的核酸作為探針進行Southern blot的步驟；以及(e)暴露于X-ray膠片上，對DNA帶型進行比較的步驟。
可用于上述方法的限制性內切酶只要是同行眾所周知的限制性內切酶，可以無限制地使用，優選使用誘發DNA的多態性的限制性內切酶。更優選使用選自由EcoR I、EcoR V和Xba I組成的群組中的酶。
另外，本發明的分子標志可用于決定CMV抗性植物體的基因型(genotype)。因此，本發明提供包括在本發明的核酸或引物存在下，對植物體基因組DNA進行分析的決定CMV抗性植物體的基因型的方法。上述方法可以通過同行眾所周知的各種DNA多態性分析進行。具體的方法如上所述。
可適用于本發明方法的植物體沒有特別限制，包括黃瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、煙草、矮牽牛花、棉花和薔薇。
另外，本發明提供包含含有由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸或從上述核酸的核苷酸序列中選出的一系列核苷酸序列的引物的CMV抗性植物體檢測用試劑盒。在上述試劑盒中還添加含有對于利用上述核酸或引物進行CMV抗性植物體檢測所必需的實驗過程(例PCR、Southern blot等)以及結果確認所必需的各種試劑、例如、PCR反應混合物、限制性內切酶、瓊脂糖、混合和/或電泳所必需的緩沖溶液等。
另外，本發明提供包含與植物體的CMV抗性性狀密切相關的分子標志的由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸的CMV的抗性植物體。上述CMV抗性植物體指的是對CMV表現出抗性性狀的植物體。上述植物體沒有限制，包括黃瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、煙草、矮牽牛花、棉花和薔薇。最好是辣椒。另外，對于本發明提供的CMV抗性植物體包括植物的器官、組織、細胞、種子以及愈傷組織。本發明同時對CMV抗性植物體的CMV抗性有無遺傳進行了調查，結果查明上述CMV抗性是由顯性的單一基因決定的。
本發明的CMV抗性植物體可使用同行眾所周知的一般的組織培養方法進行無性繁殖。例如、可以使用通過器官發生的微細增殖法(對沒有形成了的器官的葉、葉柄、莖節、子葉、子葉軸等組織進行培養，在上述組織的表面誘導新的芽的方法)或利用通過誘導愈傷組織的再分化方法等進行無性繁殖。另外，本發明提供從上述CMV抗性植物體獲得的含有由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸的種子。
圖1是表示利用操縱子引物(OPC-04至OPC-08和OPC-10)，使用黃瓜花葉病毒抗性DNA庫(pool)(R)和易感性DNA庫(S)作為模板進行RAPD分析的結果的照片。
圖2a和圖2b是表示使用OPC-07的引物(序列1)，對抗性植物體(R0)及其F1(R1)、易感性植物體(S0)及其F2(S1)、抗性F2和易感性的F2進行RAPD分析的結果的照片。
圖3是以通過OPC-07的引物進行擴增的DNA片段(序列2)作為探針進行RFLP分析的結果。
R抗性植物體S易感性植物體圖4是表示利用序列23和序列24的引物進行CAPS分析的結果的照片。
圖5是表示使用序列23和序列25的引物組合進行CAPS分析的結果的照片。
A用EcoR I進行酶切的情況B用Xba I進行酶切的情況圖6是表示使用序列23和序列26的引物組合進行CAPS分析的結果的照片。
圖7是表示使用序列27和序列28的引物組合進行CAPS分析的結果的照片。
具體實施例方式
以下、通過實施例對本發明進行詳細說明。
但是下面的實施例是本發明的例示，本發明的內容并不限定于實施例。
以下、通過實施例對本發明進行更詳細說明。然而，下面的實施例只是用于說明本發明的例子，本發明的技術方案并不限定于本實施例。
<實施例1>
用于CMV抗性辣椒植物體的移入以及分子標志開發的雜交品種的作成和CMV抗性的遺傳樣式研究將CMV接種到多樣的辣椒植物體，篩選抗性植物體。結果確認艾盧金(elgiencho lien)草系統中的一個植物體為CMV抗性。將被選擇的植物體命名為‘FP11’。為了檢測被選擇的FP11的CMV抗性有無遺傳，做成自受粉品種以及雜交品種。上述雜交品種是使FP11與作為易感性系統的FP14雜交做成的。播種雜交的F1種子，使其自受粉，制作F2品種，再使各個F2植物體自受粉，制作F3品種。以F2和F3品種作為對象進行CMV抗性檢測，結果表明CMV抗性在F2品種以3∶1的比率被遺傳，在F3世代中分離到的同型(homo)和異型(hetero)的比率是1∶2。由此確認CMV抗性由顯性的單一基因決定的。
<實施例2>
從植物體分離DNADNA提取通過改變的Prince等方法(Prince，J.P.，et al.，HortScience32；937-939，1997)進行。利用液氮磨碎在-80℃保管的辣椒葉，與25ml的DNA提取緩沖液(7M尿素、0.35M氯化鈉、0.05M Tris-HCl pH8.0、0.02MEDTA、0.25％N-十二烷基肌氨酸鈉、5％苯酚、0.2％硫酸氫鈉)混合。然后加入0.75ml的20％SDS，于65℃下每10分搖晃一下，培養30分鐘。
將氯仿異戊醇(24∶1)溶液一直填充到50ml管的端部，攪拌15分鐘。將混合液于5,000rpm下離心分離15分鐘，利用粗棉布(cheesecloth)將收得的上清液移到新的50mM管。然后向上述管中添加同一體積的異丙醇，混合后、使DNA浸漬一小時。利用U字狀的巴斯德吸管，收集沉淀的DNA，加入到1.5ml的微量管中，添加70％的乙醇，使DNA再浸漬。于室溫下干燥30-40分鐘。向上述干燥的DNA顆粒中添加600-700μl的TE緩沖液(10mM TrisCl、1mM EDTA)，于65℃下培養1小時。重復進行3次離心分離過程。然后將DNA移至1.5ml的管中，添加RNase(100μg/ml)，除去RNA。利用熒光儀測定純化的DNA的最終濃度。
<實施例3>
CMV抗性相關RAPD的引物的篩選為了篩選與CMV抗性性狀相關的DNA分子標志，使用RAPD(Williams、J.G.K.et al.、Nucl.Acids Res.18、6531-6535、1990)和BSA(Bulked SegregantAnalysis)方法(Michelmore、R.W.et al.、Proc.Nat.Acad.Sci.、889828-9832、1991)。以從上述實施例1的F2品種獲得的CMV抗性檢測結果為基礎，制作抗性F2植物體10個體的DNA庫(pool)和易感性F2植物體10個體的DNA庫，將用庫制作的DNA濃度調整到20ng/μl，以此為模板進行PCR。此時，為了制作RAPD引物，以Operon RAPD 10-mer試劑盒(Operon、Alameda、CA、USA)中的從系列A至系列T的約400個引物為對象挑選能很好地進行PCR反應的引物147個，使用被挑選的引物，探索在抗性DNA庫和敏感性DNA庫之間特異性不同的擴增帶。
PCR反應組成物是通過將1X PCR緩沖液、60ng的模板DNA、dNTP0.3mM、引物0.6pM、3.5mM MgCl2、0.6Unit Taq DNA聚會酶(Takara、日本)混合，將總體積調整到25μl。PCR擴增首先在94℃下使模板DNA變性4分鐘，然后以在94℃下1分鐘、36℃下1分30秒鐘和72℃下1分50秒鐘為一個循環，反復進行總計45次循環，最后在72℃下反應5分鐘，結束反應。結果如圖1看到的那樣，在利用OPC-07引物(序列1)的PCR中，只在1個抗性庫(pool)中挑選出了特異表現的分子標志。
為了研究上述分子標志與CMV抗性性狀之間的關系密切到什么樣程度，對抗性植物體和易感性植物體以及它們的F1世代、還有抗性F2的183個體以及易感性F2的64個體再進行RAPD分析。結果如圖2a和圖2b所看到的那樣，確認上述分子標志可100％共分離(co-segregation)。
<實施例4>
RAPD分子標志的克隆和核苷酸序列決定從凝膠中分離·純化利用具有序列1給出的核苷酸序列的OPC-07引物(10mer)擴增的DNA，克隆到pGEM-T載體(Promega公司)。將克隆的質粒通過電沖擊方法導入大腸菌DH10B，從含有抗生素的培養基挑選轉化體。從挑選的轉化體分離重組質粒，對插入到上述質粒內的DNA的核苷酸序列進行分析。決定的核苷酸序列如序列2所示。
<實施例5>
向CAPS分子標志的轉換以及用于進行逆向PCR的Southern blot的實施準備抗性植物體和易感性植物體的基因組DNA，用DNA限制性內切酶EcoRV、HindIII、XbaI和EcoRI酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳。使DNA轉移到尼龍膜上，以實施例4中擴增的CMV抗性特異的DNA(序列2)作為探針，進行Southern blot。其結果如圖3所示。就像圖3看到的那樣，對EcoRI、XbaI、EcoRV表現出多態性，對HindIII沒有表現出多態性。以上述RFLP分析結果作為基礎，在逆向PCR和CAPS分子標志轉換中使用EcoRI、XbaI和EcoRV限制性內切酶。
<實施例6>
CMV抗性基因的附近DNA核苷酸序列的決定以實施例5的結果(圖3)為基礎，利用實施例4分析的RAPD的分子標志的核苷酸序列的一部分制作引物。制作的引物的核苷酸序列如下面表1所示。
表1逆向PCR中使用的引物
使用上述表1給出的引物，根據抗性植物體中同行眾所周知的方法(Sambrook J.and D.W.Russel.2001.Molecular Cloning.3rd ed.、Cold SpringHarbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York.)進行逆向PCR。
首先，將用HindIII酶切的基因組DNA進行T7DNA連接酶(ligase)處理，使其接合成環形，以此作為模板，使用序列5和序列6的引物組合，進行PCR。使用序列4和序列9的引物組合對PCR產物通過嵌套式(Nested)PCR再進行擴增。結果得到約900bp大小的PCR產物。對上述PCR產物的核苷酸序列通過引物移步(primer walking)方法進行分析。將上述核苷酸序列與序列2的核苷酸序列連接，得到在兩個末端含有HindIII位點的1.8kb的核苷酸序列。然后以上述1.8kb大小的核苷酸序列作為基礎，制作序列10和序列11的引物。使用上述序列10和序列11的引物組合，以經EcoRV酶切的、接合成環形的基因組DNA作為模板再進行一次逆向PCR。將PCR產物的核苷酸序列與上述1.8kb大小的核苷酸序列連接，得到在兩個末端含有EcoRV位點的3.4kb大小的核苷酸序列。再通過同一方法用XbaI酶切，以接合成環形的基因組DNA作為模板，使用序列13和序列14的引物，進行逆向PCR。對PCR產物的核苷酸序列進行分析，將該序列與上述3.4kb大小的核苷酸序列連接。結果決定了含有序列2核苷酸序列的約5.6kb大小的核苷酸序列。該核苷酸序列如序列22所示。
<實施例7>
向CAPS分子標志的轉換研究上述序列22核苷酸序列中眾所周知的DNA核苷酸序列的限制性內切酶的位點，對抗性植物體和易感性植物體的基因組DNA的限制性內切酶位點進行比較，選在二個基因組DNA之間表現出多態性的限制性內切酶的XbaI(T′CTAG_A)、EcoRI(G′AATT_C)以及EcoRV(GATATC)作為CAPS中使用的限制性內切酶，制作帶有位點的引物，以便能夠擴增適當長度的限制性酶切圖的DNA片段。即，制作4個由序列22的核苷酸序列中選出的一系列核苷酸序列構成的引物(參照下面的表2)。
表2用于確認CMV抗性的CAPS分子標志開發用引物
利用序列23與24、序列23與25以及序列23與26的組合引物，使用從抗性植物體和易感性植物體、以及它們的F2品種提取的DNA作為模板，通過PCR進行擴增。PCR于94℃下使模板DNA變性1分鐘，以94℃1分；58℃1分；以及72℃2分作為一個循環，反復進行總計35次循環后，于72℃下再反應10分結束PCR。然后對擴增的DNA從用實施例6選出的限制性內切酶(EcoRI、XbaI、EcoRV)進行酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，確認是否能區分開基因型、即同型(RR)和異型(Rr)型。
圖4給出了利用序列23與24的引物組合進行PCR的結果。PCR擴增的DNA片段的大小是1.0kb。將擴增的DNA片段用XbaI進行酶切，結果可以確認易感性與抗性親本帶的圖不同。另外，確認該帶圖與在實施例1中測定F3病抗性后予測的F2植物體的遺傳型共分離。
圖5給出了利用序列23與25的引物組合進行PCR的結果。PCR擴增的DNA片段的大小是1,477bp。將擴增的DNA片段分別用EcoRI(A)和XbaI(B)進行酶切，結果可以觀察到易感性與抗性親本帶的圖不同。另外，確認該帶圖與在實施例1中的抗病性的結果共分離。
圖6給出了利用序列23與26的引物組合進行PCR的結果。PCR擴增的DNA片段的大小是1,846bp。將擴增的DNA片段分別用EcoRI進行酶切，結果可以觀察到易感性與抗性親本帶的圖不同。另外，確認該帶圖與在實施例1中的抗病性的結果共分離。
上述結果等表示通過引物制作序列22給出的核苷酸序列中的任意的一系列核苷酸序列，進行PCR，將由該結果得到的PCR產物用存在于序列22內的限制性內切酶進行酶切時，可以區分有無CMV抗性基因存在以及其狀態(遺傳型)、即能夠區分是否是同型或異型。即，序列22給出的核苷酸序列非常靠近CMV抗性基因，即使使用上述核苷酸序列等表現出的任意多態性，也可以在把握有無存在CMV抗性基因中使用。
<實施例8>
可轉換為CAPS分子標志的一系列的最少核苷酸序列數的決定為了決定在實施例6中決定的序列22核苷酸序列中可轉換為CAPS分子標志的最少的一系列核苷酸序列的數，進行了以下實驗。因此，分別將序列23(Forward[SCC07S3]5′-GTAGTAGGGTACGGACTCATA-3′)的核苷酸序列變換為序列27(Forward[SCC07S3-change]5′-gGTAGTAGGGTACG-3′)核苷酸序列，以及將序列25(Reverse[CR1541-3]5′-GGAGTTTCATCATATGAAGCC-3′)的核苷酸序列變換為序列28(Reverse[CR1541-3-change]5′-gGGAGTTTCATCAgc-3′)的核苷酸序列(小寫字母表示可任意附加/置換)。使用上述變換的序列27和序列28的引物進行PCR。PCR首先使模板DNA于94℃下變性1分鐘，以94℃1分；50、52、54、56或58℃1分；以及72℃2分作為一次循環，反復進行總計40次循環后，于72℃下反應10分鐘，結束反應。擴增的DNA片段的大小為1,477bp。然后將擴增的DNA用EcoRI酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，結果就像圖7所示那樣，觀察到易感性和抗性親本帶的圖形不同，確認該帶圖形也與實施例1中的抗病性結果共分離。
由上述結果可以確認使從序列22的核苷酸序列選出的最少12個一系列核苷酸序列變形的引物也可用于檢測CMV抗性用的CAPS標志中。
產業上利用的可能性如上所述，本發明通過提供具有與CMV抗性性狀相關程度極高的基因核苷酸序列的分子標志，可以做到無鑒別錯誤地有效鑒別CMV抗性植物體。另外，本發明的分子標志以及利用該標志的檢測方法可以不直接將CMV接種到植物體，而迅速、且正確地檢測到CMV抗性植物體，另外還具有能夠決定CMV抗性植物體的遺傳型的長處。
序列表<110>FNP有限公司<120>CMV抗性相關分子標志及其用途<130>OP04-1077<150>KR 2003-75272<151>2003-10-27<160>28<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RAPD引物(OPC-07)<400>1gtcccgacga 10<210>2<211>1027<212>DNA<213>辣椒<400>2gacataatgt gtgactatga gtagtagggt acggactcat agggccaata gtatggatgg 60cttgtgacat tgcccagaca acaagtcatg gtgacaactc gtartcagtc ttarcgagtc120ttcatgtaac ccgtagcgac taggcggtag atttttagct tacatttaag gcatcttact180aatttctctc tttcccaaca aaataccccc gacatataac acattgggga ccctattttc240ataactttaa caatcaatga cacctchtaa cccccttaaa ytccccactc aaaggcaaga300
ctagggtttc aagaaattgg tcatctaggg ctctacgagt gatttcttct tcaaatttct360tggggattaa ggcatgtatc tctatcccta aacttttttt tcattatgta attaattggt420ttattattca catggttttg atgttgggtt tagcatgatg ggttgagtgt tttggatgta480atttgtttaa atgcttttcc cttgcttatt atggaataat tttatttgaa ttgatgatta540gtaaaatcat ttgggtgctt gggaatggtg aatgaaatag ggggtacaag gattccctaa600atttgtaaac aatggaaata ggggttcaag gatcacccaa ataattggat ttttgaataa660ttggattttt gtattgaaat tgataagaac ctcaacacac ttgcataatt ggttytagaa720tgtgattaat taattttcta ggcctacttt cttaraatta rcgcattgca taagaggata780acatayaaga atgatcttaa aaacgttgtg aggtacaagg attcacctaa gtgaatgatt840tttcttgaaa accttgtgcg gtacaaggat tctccaaagt gtatgataaa tggagtttgg900gtgtacaagg attcttccaa gtaatggatt aattgaattt ctagtaagat ttagtcagta960tgacgatgcc acttcataat gccttactta tgtttcagac tatctttcga attcttcttt 1020tgggcta 1027<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CRSCC07a引物<400>3gtcccgacga tagcccaaaa g21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVR65引物<400>4ttggccctat gagtccgtac 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR用CRINVR125引物<400>5actgactacg agttgtcacc 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CRINVF629引物<400>6taggggttca aggatcaccc 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CRINVR796引物<400>7
tatcctctta tgcaatgcgc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CRINVR840引物<400>8aatccttgta cctcacaacg 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CRINVF975引物<400>9cgatgccact tcataatgcc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用Inv 1030514 R引物<400>10gacttgggca ctacactgga 20<210>11<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用Inv 1030514 F引物<400>11acataggcgt gtgctctgga 20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CR 1541-3引物<400>12ggagtttcat catatgaagc c21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用InvXbTopF1010引物<400>13ggttcaagga tcacccaaat aa 22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用InvXbTopR107引物
<400>14ttcaccttag tccccaaacc ta 22<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用EV Inver F2引物<400>15aacccaagcc tattttagcc 20<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用EV-INV-XbaI引物<400>16ggtaataggg ttcaccttag tc 22<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CRINVF5095引物<400>17ctttgagcca aagaatggaa 20<210>18<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用CRINVR4776引物<400>18tttggtaatg accggagacc 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用INVER0827R引物<400>19atagcagagg agcaccctac 20<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用INVER0827F1引物<400>20ggtacaagga ttccccaaag tg 22<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆向PCR用INVER0827F2引物
<400>21gatttagtca gtatgacgat gccac25<210>22<211>5591<212>DNA<213>辣椒<400>22tctagaacta gccagttcat gaggctcaat cctctgacct ttactagctc taaggtttag 60gaggatcctc aaaggttcat gtatgagata gaaaaaacat ttagagtgat acatgctttc120gactctgaag gtgtataatt ttcaaaatat cagctgaagg atgtggtata tcaatggtat180gagaagtagg agcagttgag gggggatgat gctgagttag tcatatggga tatttttcta240gtacctttct tgattatttc tttcctcagg agataaggaa agcaaatgct gaggagttta300tgaataactt gataagggtt tgatccaccc tagtatttct ctgtagggtg ctcctctgct360atttatttgt tagaaagatg gttcccttta gatgtgtata gattatcgct agttgaataa420ggtgactatg aagaaaaagt accctctccc taagattgat gatttattca tccagcttca480gggtgcaaag tacttttcta aaattaatct ctgttaaggt tattattagt tgaaaattag540ggatgtggat atccctaagg ctacttttca aacccagtgt ggtcattatg agtttttggt600gatgtcctat ggtttgacta atgctccggt ggcaatcaag gatcttatga acatagtatt660ctgttagttc ctggatttat ttgttattgt gttaatagat gatattttgg tatattctaa720gagcgaggct gatcacgccg atcatctcca tatagtattg caaactttta aagatcaact780gttgtacgcc aaattttcta agtgtgaatt atggttgaat gtggtgacct tccttggtta840tattatttct agtgagggga ttatggtgga tccacaaaaa ttttatgcgg tgaagaagtg900gcctaaaacc atgattccaa ccaatattta gagtttttgg gtttagttag atattatagg960aggtttgtgg agagtttctc atcaattgat gctctattta ttaagttaac tcagaaaaaa 1020
ggtatggttt ctatggtcca atgcttgtca gggtagcttt gataagttga aggataagtt1080gactttggat atgatcttga ccctacccga aggttttaat gtttttttaa ttttgatgca1140tcccgtgtag gacttggttg tgttttgatg tagaaacaat agggttctgg cctatgcttc1200taggaaattg aaagttcatg aaatgaatta tgcgacacat aacttagaat tattagttgt1260ggtattttca ttgaagctta ggtatcgtta tttgtatggg ttcatgttga tatatgtttt1320gatcataaga ttctgtagta tgtgttcacc cagaaggagt tgaatctcag gcaaaggaca1380tggcttgagt ttctcaaagg ctatgacatt agtctccatt acaacccagg taaatctaac1440atggttgttg gtattcttag taggttgtcc atgggaagat tataaaatat ggatgaggaa1500aaatgagatt tggtgaagta tattcaccga tttggtaacc ttggagttcg tcttttggat1560tctgaggatg gaggtatggt tgttcaagag gtggtgaagt catctcttag tgttgaagta1620aaagcgaaac atgtcttgga tcctatctta atgcaaatca aagatgatgt gggtcaacag1680aaggttatgg ccttcaagat tggtagtaat ggtattttaa ggtaccaagg tagattgtgt1740gttaccgatg ttaatgggtt atgagaatga attttggttg aagctcatga gtcgtgattt1800atggctcatc ttggtttgac gaagatgtac catgattcga aggagattta ttggttgaat1860aatatgaaga gagatgtggc aaattttgtt gctatgttca tggtttgcca acaagtgaag1920gtggggaacc taaggcctgg tggattctat cgctcgtgtg gaagtgagag gtaatcagta1980tggattttgt ttccagtctt ccacggtctc gtagtaaatt ttatttgatt tgggtcatca2040ttgataggat gtctaagtct actcacttct tgccagtgag gactaataat tcatgggagg2100actacgcgaa gtttttcatt caggatatca tcaagttgca tggtgcttta gtttctatta2160tatctgatcg aggtactcag ttctcgtcta acttttagtg attatttcat gtaggtttgg2220ggactaaggt gaaccctatt accattttcc acccacagaa agatgtacaa gcagagagga2280ctattcagac tttggatagt atgctaaagg tatttgtgat taacttttgt ggtatttggg2340tttaccatat gcctctctta ctgtttgtgt ataataacaa ctattattct agcattcaga2400
tgccccgttt gaggctttgg atggtaggag atgtcgttct cctattgggt ggttcaaatt2460tggtaagact agattggtca gcctggactt tgttcatgaa gctatagata aggtgaaggt2520gattagggat attcttaata ccacccaatg tcaccaaaat tcctatgtag acgtgaggca2580aagagagtta gagtttgatg ttggcaatta ggtgctcttg aaaatatccc ccatgaagga2640tgtgatatga tttgggaaga agcggaagct cagtcctcgt tatgtttgct cgtacttgaa2700ccttaggaga gtgggttatg ttgtttatga tttggatttg cctcgtagtt tgggttccat2760tcacctggag ttccacgtgt tgatgttgaa gaagtgcatg ggtgatcctt ccttgattgt2820ccttttgggg agtgttggta tttcatattc cttgtcttat gaggtattcc tgattgagat2880tttggatagg aaagtctatc atttgaggaa taaggatgtg gcttcgatga atgttctatt2940gaggaatcat aaggttgaag aagctacttg ggaagctaaa gaggacatga agtccaaata3000tccattcttg ttccctattc cggatagttg ctctcaagtt atgtgttttc cttaacatat3060ttgtattttg actttgttaa aggaaagtgt ggttgtgttt tgtgttaaat catacaaatg3120gatgctctgt ctcattattc agggacgaat aatcctacgg gggggggggg gggaatgtaa3180cacctcagat ttttggtcct tggaaaattt tttgactttt gaacttacag cctatgcaat3240gactcatctc acgagtcgta aggtgttgtc ttggcaggtc gtaggacccc aatcatagga3300tgaccagtaa agctttttca tgatactggc ttggtgatga cttgcacccc actagttgta3360aagattcatt acgagtcgta atatccagat catagggtgt ccaatgaaat ttgtcttttc3420tactctcttg attaaactag acataatgag tctaatacac tcttaacaag tcattgtgtg3480cctttcctgg caaatccagt gtagtgccca agtcattctt ccttgactat aactgaaccc3540gacgagacat aatgtgtgac tatgagtagt agggtacgga ctcatagggc caatagtatg3600gatggcttgt gacattgccc agacaacaag tcatggtgac aactcgtagt cagtcttagc3660gagtcttcat gtaacccgta gcgactaggc ggtagatttt tagcttacat ttaaggcatc3720
ttactaattt ctctctttcc caacaaaata cccccgacat ataacacatt ggggacccta3780ttttcataac tttaacaatc aatgacacct cttaaccccc ttaaattccc cactcaaagg3840caagactagg gtttcaagaa attggtcatc tagggctcta cgagtgattt cttcttcaaa3900tttcttgggg attaaggcat gtatctctat ccctaaactt ttttttcatt atgtaattaa3960ttggtttatt attcacatgg ttttgatgtt gggtttagca tgatgggttg agtgttttgg4020atgtaatttg tttaaatgct tttcccttgc ttattatgga ataattttat ttgaattgat4080gattagtaaa atcatttggg tgcttgggaa tggtgaatga aataggggta caaggattcc4140ctaaatttgt aaacaatgga aataggggtt caaggatcac ccaaataatt ggatttttga4200ataattggat ttttgtattg aaattgataa gaacctcaac acacttgcat aattggttct4260agaatgtgat taattaattt tctaggccta ctttcttaga attagcgcat tgcataagag4320gataacatac aagaatgatc ttaaaaacgt tgtgaggtac aaggattcac ctaagtgaat4380gatttttctt gaaaaccttg tgcggtacaa ggattcccca aagtgtatga taaatggagt4440ttgggtgtac aaggattctt ccaagtaatg gattaattga atttctagta agatttagtc4500agtatgacga tgccacttca taatgcctta cttatgtttc agactatctt tcgaattctt4560cttttgggct atcgtcgggg gcatgtccaa actttgattg atttttggtt ctatttagag4620gatttgtgga tttctatgga ttgggatggt attattgatg catagaactt tccctatttt4680gaatttctct atcttgttat atttttgaaa ttcatccact actagctgtg ttgtgttcta4740tttggctagg caaaaaaggg tggtctccgg tcattaccaa acttgggaga cccttcatgg4800ccaggccctg gtttgggtca tgatattttc aacctcaaac aaaaatccat tctgaccatg4860agcacgattg attccacatc tttcatttga atattaatga tctttcaact ctagcaacac4920caattaagat acaaacatag gcgtgtgctc tggagagctc ctgaggttta ttttttagtg4980catacttatt tgtcattttt ccttaataca tctttttaaa tctataatgg cttcatatga5040tgaaactcca caagctatgg ataacaatgc ttcaaacaca atcttagcca taattgaatc5100
cttgagccaa agaatggaaa gcttggaaag ctacttaaca aggaggatgt aaaacttgga5160aggccgttta gattccacca actcaacccc tcaaacctat aatgcttata ctagtggaca5220tactcaaaat atttccgcta cgatattcct agaaaccctc caccaaatgt acattcctca5280accacaaacc catgaaccca tcacacaaac cactacttat ccacaaaatt taaatctcat5340tagcccacta caacctcaat tcaaccaaga agaccacaaa accaagaacc agccatctaa5400ttaccctaaa ataaaggact accccaagct ccacttaagc aaaatccact aacccaagcc5460tattttagcc aaaataaaca catccaagtt gaagatataa aggaagaggg atctcaagga5520gaaaatgaag tgatggatga ggtggttgat aattattgaa ttgaaatatt taatatgtgc5580aagatatcga t 5591<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SCC07S3引物<400>23gtagtagggt acggactcat a21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SCC07a引物<400>24gtcccgacga tagcccaaaa g21
<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CR1541-3引物<400>25ggagtttcat catatgaagc c21<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FP5416R引物<400>26agtggagctt ggggtagtcc 20<210>27<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SCC07S3-轉化 引物<400>27ggtagtaggg tacgg 15<210>28<211>15<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>CR1541-3-轉化 引物<400>28gggagtttca tcagc 1權利要求
1.一種核酸，其特征在于，由序列2或序列22的核苷酸序列構成。
2.CMV抗性植物體檢測用引物，其特征在于，含有從序列2或序列22的核苷酸序列中選出的一系列核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的引物，其特征在于，上述引物具有從由序列1和序列23至序列28構成的群組中選出的核苷酸序列。
4.一種CMV抗性植物體檢測用試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述核酸或權利要求2所述引物。
5.一種CMV抗性植物體的檢測方法，其特征在于，在權利要求1所述核酸或權利要求2所述引物存在下，對植物體基因組DNA進行分析。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，上述分析通過從由RFLP(限制性片段長度多態性)、RAPD(隨機擴增多態DNA)、DAF(DNA擴增指紋)、AP-PCR(隨機引物PCR)、STS(序列標簽位點)、EST(表達序列標簽)、SCAR(序列特異擴增區域)、ISSR(簡單序列重復區間擴增)、AFLP(擴增片段長度多態性)、CAPS(酶切擴增多型性序列)和PCR-SSCP(單鏈構象多態性)組成的群組中選出的任意一個方法進行。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，上述植物體選自由黃瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、煙草、矮牽牛花、棉花和薔薇構成的群組。
8.一種決定CMV抗性植物體的基因型的方法，其特征在于，在權利要求1所述核酸或權利要求2所述引物存在下，對植物體基因組DNA進行分析。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，上述分析通過從由RFLP(限制性片段長度多態性)、RAPD(隨機擴增多態DNA)、DAF(DNA擴增指紋)、AP-PCR(隨機引物PCR)、STS(序列標簽位點)、EST(表達序列標簽)、SCAR(序列特異擴增區域)、ISSR(簡單序列重復區間擴增)、AFLP(擴增片段長度多態性)、CAPS(酶切擴增多型性序列)和PCR-SSCP(單鏈構象多態性)組成的群組中選出的任意一個方法進行。
10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，上述植物體選自由黃瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、煙草、矮牽牛花、棉花和薔薇構成的群組。
11.一種CMV抗性植物體，其特征在于，含有通過組織培養無性繁殖的由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸。
12.如權利要求11所述的CMV抗性植物體，其特征在于，上述植物體選自由黃瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、煙草、矮牽牛花、棉花和薔薇構成的群組。
13.一種種子，其特征在于，由權利要求11或12所述的CMV抗性植物體獲得，且含有由序列2或序列22的核苷酸序列構成的核酸。
全文摘要
本發明涉及與CMV(cucumber mosaic virus)抗性有關的分子標志及其用途，更具體講，提供一種與植物體的CMV抗性的性狀相關程度極高的序列的核酸、含有上述核酸的一部分的核苷酸序列的引物以及利用它們檢測CMV抗性植物體的方法。本發明的分子標志具有可以不將CMV直接接種在植物體也可迅速、正確檢測CMV抗性植物體，甚至能夠決定CMV抗性植物體的遺傳型的長處。
文檔編號A01H1/00GK1886521SQ200480035401
公開日2006年12月27日 申請日期2004年10月27日 優先權日2003年10月27日
發明者金信濟, 黃周光, 金君保, 金 秀 申請人:Fnp有限公司