PMMoV抗性辣椒屬植物的制作方法

專利名稱：：PMMoV抗性辣椒屬植物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗病植物。更具體地，本發明涉及抗辣椒輕型斑駁病毒(Peppermildmottlevirus(PMMoV))的特殊致病型的辣椒植物以及生產這種植物的方法。
背景技術：
：辣椒屬(Capsicum)(茄科或茄科植物)是一屬植物，其甜的、芳香的果實被用作為香料、蔬菜和藥物。該屬包括約40個種。大多數品種都含有辣椒堿(甲基香草基壬酰胺)，這是一種能在口腔內產生強烈燒灼感并且在醫學上可用作循環刺激劑和疼痛緩解劑的刺激性化學物。該屬植物源自中南美洲，但是由于它們可以耐受幾乎所有的氣候條件，因此全世界都盛產這種植物果實。商業上的辣椒主要是辣椒(Capsicumannuum)(鈴狀椒、牛角椒、椒、Anaheim椒)、小米椒(Capsicumfrutescens)(塔巴斯科椒)和黃燈籠辣椒(Capsicumchinense)(哈瓦那椒(Habaneropepper))。辣椒(Capsicumannuum)也叫做紅辣椒或眾香(pimento)，是草本年生物種，其果實的長度、顏色和刺激性根據栽培品種的不同而有所不同。這個物種是全世界廣泛栽培的，例如在西歐和美國(USA)。小米椒和黃燈籠辣椒都有著極為刺激性的小果實，被用于辣椒油和其他辣椒產品。因為強烈的香味必須要有相當溫暖的氣候，因此該物種主要栽培于熱帶地區以及美國的亞熱帶地區。在栽培過程中，多種煙草花葉病毒都可以破壞辣椒屬蔬菜。煙草花葉病毒屬包括代表病毒種煙草花葉病毒(TMV)、和血清相關的番茄花葉病毒(ToMV)、辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)和一些其他的植物病毒。病毒感染可以降低植物的活力，但通常不會殺死植物。例如TMV可以影響多種植物包括辣椒、番茄和茄子，造成辣椒果實的嚴重壞死，使得大多數果實都不可銷售。TMV是一種非常頑固的疾病，因為它可以在土壤中存活數年。PMMoV全面地感染所有的辣椒屬物種，包括抗TMV和ToMV的栽培品種。鈴狀椒植物中的疾病癥狀包括幼苗植物的發育障礙、葉子皺曲和黃色色斑。果實是畸形的(多瘤的和有斑駁的)并且大小上也有輕微的縮小。在1980年，分離出了TMV樣病毒(tm-3)的病毒株，其可以感染當時已知的抗PMMoV辣椒品系(Boukemaetal.，1980)。分離到的病毒株叫做TMV的P14株。在發現P14株之后，1982年發現植物物種C.chacoense中的一個品系(PI260429系)表現出對該新病毒的抗性(Boukema，1982)。之后發現植物的抗性是由L基因座上的L4等位基因賦予的(Boukema，1984)，P14株能夠克服L3等位基因所賦予的抗性，但它不能克服L4賦予的抗性。能克服L3賦予的抗性的病毒株最初叫做TMV，之后被重新分類成特殊的PMMoV致病型，該致病型被稱為致病型1.2.3。育種者常常將表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的C.chacoense品系以及其衍生的商品化的辣椒品系稱作Tm3抗性品系。許多育種公司已經將包括L4等位基因的該C.chacoense品系的遺傳物質基因滲入到它們的育種品系內，以便獲得具有商業所需特性的抗性辣椒植物。現在知道L4等位基因賦予了對多種病毒的抗性，所述病毒包括ToMV、TMV以及PMMoV致病型1、1.2、和1.2.3。L4等位基因所賦予的抗性在此后被稱作“PMMoV抗性”，不過更嚴格地說，其賦予了如上所述的更為廣泛的抗性。在1980和2004年間，對煙草花葉病毒屬的命名法已經進行了多次修改。在此所用的是保護植物新品種聯合會(UPOV)在1994年11月4日提出的辣椒(C.annuumL.)的“實施特色、均一性和穩定性的測試指南”(TG/76/7)中的命名法。在這些指南中，對辣椒煙草花葉病毒致病型的遺傳抗性是受位于同一基因座上的5個等位基因(L-，L1，L2，L3，和L4)控制的。在此明確參照上面提及的UPOV指南TG/76/7第21到22頁中的表格，其中顯示了抗各種病毒致病型的抗性和辣椒中的賦予抗性的等位基因組成之間的相關性。辣椒的純合子L3L3基因型賦予了對煙草花葉病毒(TMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、鈴狀椒花葉病毒(BePMV)、煙草輕型綠色花葉病毒(TMGMV)、Dulcamara黃色斑紋病毒(DYFV)、和辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2的抗性，而純合子L4L4基因型提供了附加的對辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性。UPOV命名法與病毒學的科學文獻中通常所采用的命名法多少有些不同。在科學文獻中，命名法通常被限定于物種名稱以及分離株的命名。僅僅描述了非常少數的致病型命名。例如國際病毒分類委員會的通用病毒數據庫中并不包括PMMoV的致病型1.2.3。還應當注意到，命名法及進展隨著時間有所變化，給定的煙草花葉病毒可能需要兩個或多個通用名，并且可能還要被如下詳細解釋的那樣進行重新分類。要明白，無論病毒分離株有任何新的命名，本發明涉及L4等位基因所賦予的植物對任何病毒株的抗性。如上所述，L基因的致病型特異性等位基因(L1、L2、L3、L4)賦予了辣椒屬對煙草花葉病毒屬的抗性，L4等位基因賦予了對PMMoV致病型1.2.3的抗性。L基因座所位于的區域處于染色體11南側的端粒上(Lefebvreetal，2002)。抗性基因通過觸發過敏反應(HR)發揮作用。當從C.chacoense基因滲入到其他辣椒屬物種時，L4等位基因所賦予的抗性的顯著的和不利的特性是新植物品系中的抗性是非孟德爾遺傳的。孟德爾分離定律認為等位基因對在配子形成過程中分離，在授粉時隨機組合。對于每種特征，二倍體生物體都遺傳了兩個等位基因，一個親本一個。如果兩個等位基因有所不同，那么一個顯性等位基因完全表達于生物體的表型上，而另一個隱性等位基因對表型沒有顯著的作用。根據常規的孟德爾遺傳學，純合顯性等位基因的植物與純合隱性等位基因的植物的雜交將產生F1，或第一個子代群，其在遺傳學上(整個群都是雜合子)以及表型上(整個群都表達顯性性狀)都是均一的。這種F1群被認為是顯性性狀是不分離的(當然F2群將出現性狀分離)。因此，當至少一個親本是性狀的純合子時，F1群不會出現顯性性狀的分離。同樣，無分離的F1的存在也確認了其中一個親本系為顯性性狀的純合子。但是，在其中滲入L4等位基因的商品化植物品系中并沒有出現這種情況。對于植物育種者而言，重要的是育種品系為純合子(純種(truebreeding))，因為育種的結果優選地應當是可預知的。例如當從兩種(純合的)近交系中產生商品化雜種時，所形成的雜合子的F1植物要優于它們的近交親本，因為雜種優勢或混種優勢的原因。植物育種者故意進行這種雜種雜交以便產生更為強壯的子代，純合的近交系是具有高經濟價值的生產系(producerlines)。在育種實踐中，習慣上通過植物品系的自體授粉以及篩選其子代的非分離性來評價植物品系是否是單個基因所賦予的顯性的抗性性狀的純合子(即單基因顯性性狀)。或者，預計為純合的顯性植物品系可以與純合的隱性品系雜交，據此分離的F1說明所測試的“顯性”親本并非是純合子。相信L4抗性等位基因是正常的單基因顯性的抗性等位基因(Boukema，1983；VanDuin，1998)。但是對于L4抗性等位基因所賦予的PMMoV抗性而言，育種者經常觀察到了關于純合品系雜交的可預測性以及這些品系的穩定性的問題。然而，預計為純合的(L4L4)的抗性植物的自我授粉一定會產生具有均一抗性表型的后代(據此確認了親本植物的純合性)；另一方面，這種純合的抗性親本植物與易感親本植物(即缺少L4等位基因的植物)的雜交常常產生包括抗性和易感植物的F1，即分離的F1。在用PMMoV致病型1.2.3接種之后，通過全身性花斑的存在可以檢測出植物的易感性。因為上面所羅列的原因，這種其中一部分F1子代植物驚奇地喪失抗性的現象對于育種者是非常不便的。育種者常常把這些不可預測的純合的親本植物稱作“分離的”植物，不過嚴格地說應當是它們的F1子代是分離的。在改良PMMoV抗性近交系的開發中，育種者最近利用傳統的植物選擇和試驗雜交已經表明他們能夠獲得產生正常的非分離的F1的純合植物(即遵循孟德爾法則)，據此將L4等位基因賦予的抗性固定于這個植物品系中。現在還不清楚他們是怎樣獲得這種植物品系的。但是，這些“非分離的”植物的主要問題是它們表現出可育性下降和生長矮小。可育性下降的重要后果是這些植物只能產生有限量的種子和/或有限量的花粉。因此，盡管這些植物是抗性的和“非分離的”，但是它們所表現出的以可育性下降和生長矮小為特征的表型對于商品化種子生長是不利的。例如種子的延遲成熟(即生長緩慢)或植物發育率的減少都可以提示生長矮小。在本申請中，這種分離的不育的矮小表型還被稱作“SNFD表型”。現在還不能解釋這些負面性狀包括生長、可育性和不育性的問題和L4等位基因從C.chacoense到其他辣椒屬物種的基因滲入之間的相關性。(參閱例如VanDuin，1998)。一直以來都發現往辣椒屬物種中基因滲入L基因的任何一種L1、L2和L3等位基因都產生了孟德爾遺傳群體，而沒有在純合子抗性植物中表現出SNFD表型。C.chacoense的L4基因滲入現在首次提出了上述問題。目前需要具有L4等位基因賦予的對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒植物，它們是“非分離的”，并顯示出正常的發育(率)以及產生合適量的種子。因此，本發明的一個目的是提供辣椒屬植物，其組合了L4等位基因賦予的對PMMoV致病型1.2.3的抗性以及商業所需特性例如良好的生長和正常的種子產生，即沒有不利的SNFD表型的特性。
發明內容通過本發明可以實現這個目的。本發明已經發現，通過減少包括L4等位基因的基因組基因滲入的規模而中斷如在上面所述的純合植物中觀察到的對PMMoV致病型1.2.3的抗性和SNFD表型之間的關聯是有可能的。具體地，通過從L4抗性等位基因中去除位于L4等位基因中的賦予PMMoV抗性部分的直接相鄰部分的遺傳信息可以實現這一點。結果是對PMMoV致病型1.2.3的抗性可以從一個植物轉移到另一個植物，而不轉移賦予SNFD表型部分，因此有可能產生具有PMMoV抗性且不表現出SNFD表型的農藝學有價值的植物。無意于受理論上的縛束，相信SNFD表型的負面的副作用特征是由L4等位基因所位于的C.chacoense染色體片段引起的，例如當C.chacoense染色體片段被插入到辣椒基因組內時，鄰近于L4等位基因中的賦予抗性部分的隱性基因引起了SNFD表型。所述基因本身與L4等位基因遺傳連鎖，并破壞了受體植物基因組的染色體組織結構。因此，僅僅在被作為完整L4等位基因的C.chacoense染色體基因滲入的純合植物中才會表達SNFD表型。現在，既然已經獲得了中斷L4等位基因所賦予的需要的和不需要的表型之間的關聯的可能性的重要發現，選出其中已經從L4等位基因中的賦予抗性部分的鄰近部位去除了SNFD表型的遺傳信息或者所述遺傳信息已經被變更到SNFD表型在純合植物中不再被組合表達的程度的植物已經成為可能。本發明的第一個部分現在提供了一種辣椒屬植物，因為在所述植物的基因組中存在有L4抗性等位基因，使得植物表現出對辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性，其中所述L4等位基因是被截短的。截短提供了縮短長度的等位基因，并形成了有可育性的以及表現出正常生長的非分離的植物，即缺少SNFD表型。通過去除或改變L4等位基因鄰近部位的造成SNFD表型的遺傳信息可以實現造成SNFD表型的遺傳信息的缺失，優選地通過L4等位基因鄰近部位的重組事件可以實現所述去除或改變。當SNFD信息只出現于等位基因的一側時，單個重組事件就足以去除該信息。當SNFD表型的遺傳信息位于抗性等位基因的兩側時，優選地改變或去除該遺傳信息的兩個部分。根據本發明的優選的實施方式，選出植物，其中已經發生了至少一次重組事件，優選地發生了11號染色體南側的L4等位基因的北側(著絲粒側)的重組事件，不過著絲粒側的截短也是可能的。對于二次重組而言，雖然重組事件并非一定都要發生于一個世代，但是連續世代的重組事件可以一起造成抗性等位基因一側或兩側的遺傳信息的最終的去除或改變。應當進行至少一個重組事件，使得能賦予抗性的遺傳信息不會被去除，據此保持L4抗性等位基因中的賦予抗性部分的存在。在本發明的植物的優選的實施方式中，所述L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因組。為了評價是否去除或改變了適當的遺傳信息，本領域技術人員可以適當地利用遺傳標記物。本發明現在描述了一些可以用于標記物輔助選擇重組植物的遺傳標記物。所述用途在本領域是公知的，并且在下面有著更為詳細的描述。在一個優選的實施方式中，本發明提供了一種其中缺少造成SNFD表型的遺傳信息的植物，如缺少與L4抗性等位基因相連的至少一種標記物所提示的那樣，其中所述標記物選自由第2組標記物(E35/M49-F-90、E39/M58-F-65、E39/M51-F-380、E58/M62-F-168、E66/M54-F-600和Tm3-DRS)、第3組標記物(E60/M54-F-447)、第1/3組標記物(E63/M61-F-501、E66/M43-F-387、E66/M49-F-387、E66/M61-F-99、E67/M50-F-150、E67/M62-F-214、E70/M54-F-133、E71/M47-F-550、E74/M61-F-385)組成的組，優選地是第3組和2組標記物，更優選地是第2組標記物(E35/M49-F-90、E39/M58-F-65、E39/M51-F-380、E58/M62-F-168、E66/M54-F-600和Tm3-DRS)。在另一個優選的實施方式中，本發明提供了一種其中缺少L4抗性等位基因的植物，如缺少與L4抗性等位基因相連的至少一種標記物所提示的那樣，所述標記物選自第1組標記物(E58/M50-F-580、E39/M58-F-95、E58/M60-F-255和E54/M55-F-101)、和第1/3組標記物(E63/M61-F-501、E66/M43-F-387、E66/M49-F-387、E66/M61-F-99、E67/M50-F-150、E67/M62-F-214、E70/M54-F-133、E71/M47-F-550、E74/M61-F-385)，優選地選自第1組標記物，更優選地選自標記物E58/M50-F-580和E54/M55-F-101。上面所提及的標記物是以由“核心引物”(5′-GACTGCGTACCAATTC-3′和5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′)組成的AFLP引物為基礎，加上如引物密碼所示的三個附加的選擇性核苷酸，所述核心引物分別對應于限制性內切酶EcoRI(編碼為E)和MseI(編碼為M)的限制性位點。在http://www.keygene.com/publications/index.htm以及具體地在其中的題為“KFNomenclaturePrimerEnzymeCombinations.pdf”的文檔中可以找到引物密碼。在組合引物酶之后，記錄下所擴增片段的大小(堿基對)。例如標記物E58/M60-255說明在用引物酶組合(EcoRI+引物密碼58/MseI+引物密碼60)切割DNA后獲得的255個堿基對的擴增片段。引物密碼如下35ACA；39AGA；43ATA；47CAA；49CAG；50CAT；51CCA；54CCT；55CGA；58CGT；60CTC；61CTG；62CTT；63GAA；66GAT；67GCA；70GCT；71GGA；74GGT。引物酶組合密碼的實例E63/M61-F-501為EcoRI+GAA(＝E63)/MseI+CTG(＝M61)。源自標記物TG036(Lefebvreetal.，2002)的標記物Tm3-DRS是通過PCR引物對P118(序列5′-AATCCTTCAACTGCCATTTC-3′)和引物P119(序列5′-ATTGGGACATGAGGTGTGTA-3′)所定義出的標記物，通過用引物P118和引物P119進行PCR以及之后用Tru1I(限制性位點TTAA)消化PCR產物可以檢測出該標記物。近350個堿基對的擴增片段的存在說明存在L4等位基因。如下面更為詳細描述的那樣，也可以用提供具有截短的L4等位基因的說法來描述提供其中缺失或去除了造成SNFD表型的遺傳信息的植物。與這種截短相關的部分可以相似地應用于如上所述的遺傳信息的去除或改變。在本發明的另一個優選的實施方式中，植物是辣椒種的植物。仍在本發明的植物的另一個優選的實施方式中，植物是L4抗性等位基因的純合子，純合植物優選地是近交植物。在另一個部分，本發明提供了因為在所述植物的基因組中存在L4抗性等位基因而表現出對辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物，其中所述L4等位基因是截短的，以及其中所述截短包括去除距離端粒和/或著絲粒側約為0.001到10cM遺傳距離的核苷酸序列，優選地去除距離等位基因的著絲粒側約為0.001到10cM遺傳距離的核苷酸序列。如上所述的優選的實施方式也適用于本發明的這個部分的植物。所觀察到的包括核心TM-3抗性基因的第1組標記物和第3組標記物之間的重組頻率等價于約2cM距離。所觀察到的第1組標記物和第2組標記物之間的重組頻率也等價于約2cM距離。因為缺少重組，不能測定出在此所給出的標記物組內的任一標記物之間的距離。因此，在此所述的截短優選地代表距離位于任一第1組標記物的位置上的著絲粒側(第2組)或端粒側(第3組)的任一標記物的不到2cM距離內的遺傳缺失。在另一個部分，本發明提供了表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的雜種辣椒植物，其是通過雜交本發明的純合的(優選地是近交的)植物和另一種表現出商業所需特性的純合的(優選地是近交的)辣椒植物獲得的。仍在另一個部分，本發明提供了包括截短的L4抗性等位基因的分離的核酸序列，其中所述截短的L4抗性等位基因包括能夠在辣椒屬植物中表達并據此賦予所述植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性的遺傳信息，其中所述等位基因中不含賦予SNFD表型的遺傳信息。在這種分離的核酸序列的優選的實施方式中，賦予抗性的遺傳信息包括至少一種選自包括標記物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580的組，優選地選自由標記物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580組成的組，更有優選地選自由標記物E54/M55-F-101和E58/M50-F-580組成的組中的標記物。賦予抗性的遺傳信息還包括賦予SNFD表型的遺傳信息以及包括沒有含有所述抗性等位基因中的至少一種選自由第2組標記物和第3組標記物組成的組中的標記物，優選地是第2組標記物。在最優選的實施方式中，本發明的分離的核酸序列中所包括的L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因組。在另一個部分，本發明提供了制備表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的方法，包括步驟a)提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒屬受體植物或其部分，和b)往所述受體植物或其部分或其子代植物中引入包括截短的L4抗性等位基因的基因組區，其中所述等位基因包括能夠在所述植物或植物部分或子代植物中表達并據此賦予所述植物或植物部分或子代植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性的遺傳信息，其中所述等位基因中的賦予SNFD表型的遺傳信息至少缺失到不表達SNFD表型的程度。通過提供包括截短的L4抗性等位基因的基因組區例如具有如在此所述的L4抗性等位基因的截短形式的重組供體植物形式或者包括作為插入物的所述基因組區的載體形式都可以提前進行步驟b)。本發明的方法所用的包括截短的L4抗性等位基因的基因組區包括大小上比造成植物具有SNFD表型的L4等位基因更小的L4抗性等位基因。縮小L4抗性等位基因的大小，但是該大小的縮小不會影響到賦予對PMMoV致病型1.2.3.的抗性的遺傳信息。通過在源自受體植物和抗PMMoV致病型1.2.3的包括L4抗性等位基因的辣椒屬供體植物的雜交的子代植物的基因組中的基因滲入可以實施用于實現非常合適的引入包括截短的L4抗性等位基因的基因組區的方法。基因滲入的過程對于本領域技術人員是熟知的，通常包括通過種間雜種與其一個親本的重復回交將一個物種的一種或多種基因引入到另一物種的基因池內。本領域技術人員容易明白，基因滲入并非是往植物的基因組種引入L4抗性等位基因或包括L4抗性等位基因的基因組區的唯一方式。其他方法可以包括例如應用轉基因技術例如單倍體細胞融合、植物轉化等。因此通過體外培養技術、通過原生質體融合、通過轉化或通過雙單倍體技術也可以實施所述基因組區的引入。這些技術常常并非都是實施于完整植物，也可以實施于植物部分，通常是所述植物的繁殖物質例如單個細胞的組織培養物或原生質體。因此，為了獲得本發明的植物，這些方法可以任選地包括將所述植物部分產生辣椒植物的附加步驟。通常這個步驟包括再生來自經異源DNA轉化的植物部分或組織的植物或所述植物的繁殖物質或兩者，以及任選地包括生物學復制所述植物或繁殖物質或兩者。本發明的其中通過基因滲入方法將截短的L4抗性等位基因引入到辣椒植物的受體植物內的方法優選地產生了具有其基因組中被基因滲入包括截短的L4抗性等位基因的基因組區的子代植物。因為獲得具有截短的L4抗性等位基因的子代植物的方法包括重組，優選地在實施任何基于子代植物的表型或基因型的選擇之前產生了分離群。因此，所產生的并在其基因組中具有截短的L4抗性基因的子代植物優選地是分離群的植物，例如通過從上面所提及的雜交中獲得的F1植物的自花傳粉或者通過從所述雜交中獲得的F1植物與另一種辣椒植物的雜交所產生的分離群的植物。在本發明的方法中，優選地引入來自C.chacoense基因組的基因組區，以及在這種方法中所用的受體植物優選地是辣椒植物。盡管現在已經描述了產生本發明的植物的方法的基本元件，本發明的方法還可以包括附加的步驟。在優選的實施方式中，本發明的方法還包括步驟c)選擇抗PMMoV致病型1.2.3的植物或其抗PMMoV致病型1.2.3的子代植物；和d)選擇沒有表達SNFD表型的抗性植物或抗性子代植物。用基于表型測定的方法可以實施選擇抗PMMoV致病型1.2.3的植物或子代植物的步驟，例如通過施用抗性生物檢測，例如通過給植物的葉子接種PMMoV致病型1.2.3的懸浮液并評價感染的出現情況。但是，在優選的實施方式中，選擇PMMoV致病型1.2.3抗性植物的步驟包括篩選所述植物或子代植物的基因組中是否存在至少一種指示所述植物中存在L4等位基因中的賦予抗性部分的選自包括1組或第1/3組標記物中的L4抗性等位基因的標記物的過程。第1組的合適標記物包括標記物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580，優選地確定出存在至少一種選自由標記物E54/M55-F-101和E58/M50-F-580組成的組中的標記物。適用于評價存在抗性性狀的第1/3組的標記物包括本領域人員已經確定出的抗性植物中所存在的那些標記物。1/3組的標記物包括指示L4抗性等位基因的標記物以及指示等位基因中的賦予SNFD表型的標記物。因此，一些第1/3組標記物指示去除了L4抗性等位基因中的賦予SNFD表型部分的合適的截短，其與第3組標記物類似，而其他的第1/3組標記物指示存在核心的抗性基因或調節序列，因此其與第1組標記物類似。從所述的抗PMMoV致病型1.2.3的植物中選擇不表達SNFD表型的植物或子代植物的步驟(上述的步驟d)構成了本發明所述的標記物輔助性育種方法的核心。對不表達SNFD表型的抗性植物或子代植物的選擇優選地包括篩選抗性植物或子代植物的基因組中的截短的L4抗性等位基因是否存在至少一種選自由第2組標記物和第3組標記物組成的組中的L4抗性等位基因的標記物(也任選地選自第1/3組標記物，優選地選自第2組標記物)，以及選擇其中作為截短指示的不存在至少一種所述標記物的植物或子代植物。在另一個部分，本發明提供了用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬近交植物的方法，包括實施如上所述的產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的方法，以及還實施了步驟e)所選植物的自花傳粉；f)播種從所述自我傳粉中獲得的種子，并由所述種子產生植物；g)從步驟f)的植物中鑒定出表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性以及具有商業所需特性的植物；和h)重復e)至g)，直到產生了表現出PMMoV致病型1.2.3抗性以及具有商業所需特性的近交辣椒植物。本發明上下文中的商業所需特性可以涉及任一特性例如果實特性，如改善外觀、更高的種子產率、提高可育性、更高的果實產率、更大的或更小的果實、或改善果實顏色或味道；或者例如特性如改善莖強度、改善莖系統、改善應激抗性、改善疾病抗性等。在實踐中，商業所需特性可以是使得植物比野生型植物具有更高商業價值的特性。在另一個部分，本發明提供了通過上述的本發明的任一方法獲得的表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物或近交植物。在其他部分，本發明涉及本發明植物的子代、植物部分例如葉子、莖、根、根尖、根莖、秧、果實等或本發明的植物部分例如細胞、原生質體、愈合組織、細胞團、(體細胞)胚、花藥、葉柄、花粉、胚珠、花、培養細胞、種子等等。這些部分可以適用于繁殖，優選地通過(器官)組織培養，或者這些部分可以適用于消費例如果實。在另一個部分，本發明提供了通過生長本發明的辣椒植物產生的辣椒種子。在另一個部分，本發明提供了通過雜交本發明的方法獲得的本發明的近交辣椒植物和優選地表現出商業所需特性的近交辣椒植物獲得的表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的雜種辣椒植物或其部分。圖1顯示了指示不同組(第1、2、3、1/3組)標記物的、與實施例1中所示的表1中羅列的每個組中所具有的與該基因座標記物相連的L4基因座的微圖譜。圖2顯示了其中指示了單個標記物的相同的微圖譜。圖3提供了關于在此所用的標記物的詳細信息，具體地是核苷酸序列信息和標記物長度。標記物長度是通過利用從編號P1260429的C.chacoense中分離到的基因組DNA作為模板DNA以及所示的引物實施PCR反應擴增到的DNA片段的堿基對的近似長度。具體實施例方式定義在此提供的標題并不是對通過整體引用本說明書所能夠得到的本發明的各個方面或實施方式加以限制。因此，通過整體地引用本說明書更充分地定義了在下面所定義的術語。術語“L4抗性等位基因”或“L4等位基因”在此表示辣椒屬物種的L4基因的致病型特異性抗性等位基因，它為這些植物提供了對番茄花葉病毒(ToMV)和辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1、1.2和1.2.3的抗性，如Boukema(1984)首次所述的那樣，所述基因是L基因座的一部分。L基因座所位于的區域位于11號染色體南側的端粒上。無截短形式的L4等位基因與標記物Tm3-DRS相關。L4等位基因因此表示如下所述的核苷酸序列，例如源自編號PI260429的C.chacoense的核苷酸序列，所述核苷酸序列與在此所定義的一種或多種第2組標記物(E35/M49-F-90、E39/M58-F-65、E39/M51-F-380、E58/M62-F-168、E66/M54-F-600和Tm3-DRS)和一種或多種第3組或第1/3組標記物(E60-M54-F-447、E63/M61-F-501、E66/M43-F-387、E66/M49-F-387、E66/M61-F-99、E67/M50-F-150、E67/M62-F-214、E70/M54-F-133、E71/M47-F-550、E74/M61-F-385)相毗鄰，且所述核苷酸序列賦予對PMMoV致病型1.2.3的抗性。術語“辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3”在此表示能克服L3等位基因所賦予的抗性的感染辣椒的輕型斑駁病毒的病毒株。在文獻中，常常用術語PMMoV抗性株表示這些病毒株。要明白ICTV所認證的縮寫詞PMMoV和PMMV都可以用于表示辣椒輕型斑駁病毒。在文獻中可以遇到的PMMoV的同義詞是煙草花葉病毒的Samsun潛伏株(SL-TMV)、辣椒花葉病毒和辣椒屬花葉病毒。因為病毒分類的快速發展，一些最初被分類為辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV，ICTV十進制編碼71.0.1.0.007)的病毒株(主要是最初的Dutch病毒株(Tobiasetal.，1982))現在被重新分類成紅辣椒輕型斑駁病毒(PaMMV，ICTV十進制編碼71.0.1.0.006)。術語“辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3”在此因此也包括能克服辣椒植物中L3等位基因所賦予的抗性的PaMMV株。術語“辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3”所示的病毒的實例在此包括，但不限于下面的病毒株TMV的分離株P14(Boukema，1982；Tobiasetal.，1982；Rast，1988)、PMMoV-1所示的意大利株(Wetteretal.，1984；Rodriguez-Cerezoetal.，1989；Velascoetal.，2002；Berzal-Herranzetal.，1995；Garcia-Luqueetal.，1993)、PMMoV-S所示的西班牙株(Tenlladoetal.，1997；Velascoetal.，2002；Tenlladoetal.，1996；Berzal-Herranzetal.，1995；Garcia-Luqueetal.，1993；Alonsoetal.，1991；Avila-Rinconetal.，1989；Rodriguez-Cerezoetal.，1989.)、PMMoV-J和PMMoV-Ij所示的日本株(Tsudaetal.，1998；Hagiwaraetal.，2002；Kiritaetal.，1997)、PMMV-k所示的韓國株(Limetal.，1997)、和PaMMV(Garcia-Luqueetal.，1993；RuizdelPinoetal.，2003；Gilardietal.，2004)。描述辣椒輕型斑駁病毒和紅辣椒輕型斑駁病毒的權威參考文獻是i.a.Brunt，A.A.，Crabtree，K.，Dallwitz，M.J.，Gibbs，A.J.，Watson，L.andZurcher，E.J.(eds.)(1996onwards).″PlantVirusesOnlineDescriptionsandListsfromtheVIDEDatabase.Version16thJanuary1997.″和國際病毒分類學委員會的通用病毒數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/index.htm)。“截短的等位基因”在此被定義為遺傳距離的大小比完整等位基因更小的等位基因。例如通過缺少至少一種相連的標記物和/或缺少可識別的表型(在本申請中為SNFD表型)可以顯示出大小的縮小。術語“等位基因”在此表示基因的任何一種或多種可選擇的形式，所有等位基因都與至少一種性狀或特性相關。在二倍體細胞中，給定基因的兩個等位基因占據了一對同源染色體上的相應基因座。因為本發明涉及QTL，即可以包括一種或多種基因或調節序列的基因組區，因此在某些時候用“單倍型”而不是“等位基因”是更為準確的，但是，在那些時候，術語“等位基因”應當被理解成包含術語“單倍型”。當等位基因表達相似的表型時，它們被認為是相同的等位基因。序列差異是有可能的，但并不是重要的，只要它們不影響表型。“基因組區”在此被定義為核苷酸序列，優選地是DNA序列，其可以包括具有不同的基因組功能的序列例如基因和調節元件區。基因組區可以是核苷酸構建體，也可以包含于載體內。同樣地，在雜交所述植物之后，通過染色體重組可以將基因組區從一種植物轉移到另一種植物。基因組區理論上可以包括源自一種或多種物種的遺傳物質。“基因”在此被定義為由DNA序列構成的遺傳單位，所述DNA序列占據了染色體上的特異位置并且含有生物體的特殊特性或性狀的遺傳指令。“基因座”在此被定義為遺傳圖譜上的位置，其是給定物種的染色體上的給定的基因位置。術語“雜合子的”在此表示當不同的等位基因位于同源染色體上的相應位置時所存在的遺傳狀態。術語“純合的”在此表示當相同的等位基因位于同源染色體上的相應位置時所存在的遺傳狀態。純合性在此被定義為在單個植物的自我傳粉之后沒有分離，或者在與易感株雜交之后，F1沒有出現分離現象。術語“雜種”在此表示兩種遺傳學上不像的個體之間雜交的任何子代(Riegeretal.，1968)。術語“近交”在此表示基本上純合的單體或品系。在本申請中，“重組事件”被理解為(減數分裂)交換。術語“基因滲入”、“被基因滲入的”和“基因滲入的”在此表示通過雜交這些物種將一個物種、品種或栽培品種的基因移動到另一個物種、品種或栽培品種的基因組內的方法。該雜交可以是天然的或人為的。任選地通過與輪回親本的回交可以實現該方法，在這種情況中，基因滲入表示通過種間雜種與其中一個親本的重復回交將一個物種的基因滲入到另一物種的基因庫內。基因滲入也可以被描述為被穩定地整合到受體植物的基因組中的異源的遺傳物質。“遺傳加工”、“轉化”和“遺傳修飾”在此都是將任何種類的遺傳信息轉移到靶植物的DNA(通常但不一定是另一種生物體的染色體DNA或基因組)內的同義詞。遺傳加工是將異源遺傳物質穩定地整合到受體植物的基因組內的方法，其可以包括用包括異源DNA的DNA重組體轉化植物的細胞或組織的方法，異源DNA包括編碼基因或其等位基因變體的外來核苷酸序列以及選自能夠使得異源DNA穩定整合到植物細胞或組織內并且能夠使得在植物細胞或植物組織中表達外來核苷酸序列的調節元件中的調節元件。術語“分離的標記物”在此表示利用任一技術獲得的標記物，例如限制性內切酶多態性(RFLP)標記物、擴增片段長度多態性(AFLP)標記物、單核苷酸多態性(SNP)標記物、微衛星標記物、序列特征性擴增重復(SCAR)標記物或同工酶標記物或在此所述的標記物的組合，所述標記物定義出了特異的遺傳學的染色體位置，并且檢測出了兩個等位基因之間的多態性。在此所提供的作為代表性標記物的第1、2、3組和第1/3組標記物(具體地是AFLP標記物)是由雙鏈或單鏈核苷酸序列組成的，所述雙鏈或單鏈核苷酸序列是通過用辣椒屬基因組DNA作為模板，用圖3所示的第一和第二引物的引物序列作為一對擴增引物，實施核酸擴增反應而獲得的，以便使得由辣椒特異性核苷酸序列或其互補序列組成的雙鏈或單鏈核苷酸序列的每一側為所述引物序列或其互補序列。術語“辣椒特異性核苷酸序列”在此表示當利用編號PI260429的C.chacoense的基因組DNA作為模板DNA時所獲得的序列，并表示與所述序列的相似性至少為90％、優選為95％、更優選為97％、甚至更優選為超過98％的序列。術語“限制性內切酶片段長度多態性”或“RFLP”在此表示經特異的限制性內切酶切割的單個片段在DNA片段大小方面的變異。造成RFLP的多態性片段用作為遺傳連鎖圖譜上的標記物。術語“群”在此表示共享有共同遺傳學來源的、遺傳學上同源的或異源的植物的集合。術語“品種”或“栽培品種”在此表示一組可以從相同物種的其他品種中鑒定出的結構特征和性能方面相似的植物。術語“品種”在此與1972年11月10日、1978年10月23日、以及1991年3月19日在日內瓦修改過的1961年12月2日的保護植物新品種的國際公約(UPOV協定)中的相應定義具有相同的含義。因此，“品種”表示最低已知級別的單個植物類別內的植物分組，不論是否完全滿足給育種者授權的條件，i)通過表達給定基因型或基因型的組合所形成的特性可以定義出分組；ii)通過表達至少一種所述特性可以從任一其他的植物分組中區分出該分組；以及iii)所述分組在其可被不變更地繁殖的適用性方面可以被認為是一個單元。術語“辣椒”或“辣椒屬”在此表示辣椒屬的任何種、品種、栽培品種或群。在一個方面，本發明提供了表現出對辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物。本發明的辣椒屬植物可以是辣椒屬的任一物種，其包括但不限于辣椒、C.baccatum、C.cardenasei、C.chacoense、黃燈籠辣椒、C.eximium、小米椒、C.microcarpum、小辣椒(C.minimum)、C.pendulum、C.praetermissum和C.pubescens。本發明的植物優選地是開白花的辣椒屬物種，優選地是辣椒、小米椒、黃燈籠辣椒、或C.chacoense植物，更優選地是辣椒、小米椒或黃燈籠辣椒植物，仍更優選地是辣椒或小米椒植物，最優選地是辣椒。在一個甚至更為優選的實施方式中，本發明提供了具有農藝學上或商業所需特性的辣椒植物。術語“辣椒(C.annuum)”在此表示辣椒屬的辣椒植物，其中植物的基因組包括作為遺傳背景的辣椒基因組。這種植物基本上都具有辣椒基因組，其中作為重組、轉化或任何其他方法的結果，其已經整合了其他物種的DNA。本領域技術人員要明白，兩種植物物種之間的育種將形成具有兩個親本的特性和遺傳物質的植物，因此使得物種之間的分界線變得模糊。這些植物在此都被稱作辣椒植物。1952年美國南加州首次在辣椒中報道了煙草花葉病毒屬的辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)(McKinney，1952)。癥狀包括輕微的萎黃和發育障礙，特別是如果植物是在幼苗時被感染的。果實可以是小的、變形的、斑駁的以及可以具有壞死性凹窩，因此使得它們無法銷售。PMMoV是通過植物之間的緊密接觸、通過種子表面上的病毒體、以及通過嫁接傳播的。在多個國家都報道了該病毒(阿根廷、澳大利亞、加拿大、丹麥、法國、匈牙利、冰島、意大利、日本、韓國、荷蘭、西班牙、英國和美國)。通過使用抗性栽培品種極好地實現了疾病控制。已經報道了能夠克服L4等位基因所賦予的抗性的新病毒株(Antignusetal.，2000)。本發明的植物中的對辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性是因為植物基因組中存在L4抗性等位基因。本發明的植物基因組中的賦予對PMMoV致病型1.2.3的抗性的L4抗性等位基因可以源自任何來源。根據本發明的優選的實施方式，L4抗性等位基因源自C.chacoense，更優選地源自編號PI260429和SA185的C.chacoense(Boukema，1983)。本發明的植物能夠將PMMoV抗性轉移給子代，并且可以是L4抗性等位基因的雜合子，但是優選地是L4抗性基因的純合子。作為L4抗性等位基因純合的本發明的植物沒有表現出可育性下降和/或生長矮小。當植物沒有表現出可育性下降和/或生長矮小時，推斷植物缺少足夠多的引起SNFD表型的遺傳信息，或者該遺傳信息已經被充分地滅活。造成SNFD表型的遺傳信息的缺少至少到不表達SNFD表型的程度。本發明人通過AFLP已經確定出在L4等位基因的鄰近部位存在著不同的遺傳標記物，并且已經發現根據標記物之間或標記物和L4等位基因之間的重組，這些標記物可以被分成不同的組(見實施例中的表1)。圖1顯示與L4基因座相連的不同組標記物的位置。第1組標記物被認為處于與L4等位基因本身最為接近的位置，使得在PMMoV致病型1.2.3的生物檢測中沒有觀察到指示存在L4等位基因的標記物和抗性標記之間的重組。第2組和第3組標記物分別位于第1組標記物的每一側。第4個組是由位于橫跨第1組和第3組的區域內的標記物組成的，該組標記物在此被叫做第1/3組標記物。第1/3組內的標記物是不同的，其中到目前為止每種這些標記物都不能被放置于第1組或第3組內，因此在給定標記物和第1組標記物之間、給定標記物和第3組標記物之間都沒有觀察到重組。因為在第1/3組和第2組標記物之間觀察到了重組，因此這兩組中的標記物的遺傳位置是明顯不同的，這些標記物的確切位置是第1組或第3組。迄今為止，在每一組內部都沒有觀察到重組。圖1的圖譜朝向染色體剩余部分的定位是使得第2組標記物位于11號染色體南側的著絲粒側以及第3組標記物位于端粒側(朝向末端)。即分離群PY的等位基因的主要部分位于11號染色體的標記物TG036的下方，如Lefebvreetal.，2002中的圖1所示的辣椒的種間共同連鎖圖譜所展示的那樣，本申請在此引用了該圖。發現在具有抗性的和L4等位基因純合的以及缺少第2組、第3組或第1/3組中的任一標記物(特別是第2組中的標記物)的植物沒有表現出SNFD表型。因此，可以用其他基因型的同源NDA取代與L4等位基因正常連接的特定的基因組區，且不影響抗性，還會強烈地影響到生長和可育性，以及將抗性性狀遺傳給子代植物的行為。例如通過傳統雜交(植物雜交)技術的方式可以獲得沒有SNFD表型的植物。但是，條件是施用正確的選擇標準。根據本發明，現在已經定義出了合適的選擇標準，即L4抗性等位基因鄰近部位的遺傳信息的完全或部分缺失或失活。根據本發明，在重組中缺失或抑制了多少抗性等位基因周圍的遺傳信息或者賦予SNFD表型的基因被何種方式滅活都是無關緊要的，只要植物和其子代沒有SNFD表型。為了發現其中已經在L4等位基因和引起SNFD表型的基因之間發生了重組的植物、分離群或這些群的子代，在實踐中是通過篩選具有重組表型即PMMoV致病型1.2.3抗性的純合子以及聯合非SNFD表型的植物。盡管以這種方式發現合適的重組體是有可能的，但是有很多原因導致發現農藝學上有價值的重組體是復雜的。如前所述，純合子可表現出SNFD表型。但是，發現如果這些純合子與易感植物(即不含有L4等位基因)雜交，F1可表現出抗性以及沒有SNFD。這是因為L4抗性等位基因是顯性的，而造成SNFD表型的基因是隱性的。具有單拷貝的C.chacoense染色體片段的植物的子代因此將組合有抗性和正常(無SNFD)的表型。但是，它們的F1子代將出現抗性表型的分離，因此這些植物不能在商業上應用，因為商業的辣椒屬品種必須滿足對遺傳均一性的嚴格要求，以便能進行循環。盡管可以出現上述的困難，但是以傳統的方式選擇其中缺少SNFD表型的遺傳信息的所需植物顯然是非常有可能的。但是，這種方式的選擇的確需要相當大量的分離群或大量用于鑒定的雜交。因此，利用分離生物學工具選擇合適的植物將是更為有效的。一種有效的技術是如Vosetal.，1995所述的AFLP技術。當應用于本發明時，本技術是基于對DNA標記物的基因定位，所述DNA標記物在遺傳學上與L4等位基因相連接，之后可以用相當簡單的方式確定出在雜交試驗的子代的L4等位基因的鄰近位置上是否發生了重組事件。通過使用分子標記物可以顯著地增加選擇具有L4等位基因以及無SNFD表型的組合的純合性的植物的效率。當缺少L4相連的標記物時，(因此)已經發生了L4等位基因和標記物之間的交換。通過選擇與等位基因有著不同的遺傳距離的標記物，可以確定出重組的位置，因此使得可以確定出等位基因的鄰近位置是否或多或少都有所消失。因此，其中沒有一種或多種相連的標記物的子代至少缺少一段不利的等位基因的鄰近部分，并因此具有比平均機會更多的存在其中沒有造成SNFD表型的遺傳信息的具有L4等位基因的染色體的機會。對等位基因的鄰近部位的遺傳標記物的基因定位是一種分子生物學
技術領域：
的技術人員非常容易實施的方法，例如在Lefebvre和Chevre，1995；Michelmore，1995；Winter和Kahl，1995中描述了相關的技術。在Vosetal.(見上)中可以找到關于AFLP技術的綜合信息。在本發明的實施方式中，本發明的其中存在純合子狀態的抗性等位基因以及不表達SNFD表型的植物可以適用于將PMMoVP1.2.3抗性轉移到其他的農藝學上有價值的辣椒屬類型內。因此，通過雜交純合植物(優選地是近交系)和另一種辣椒植物可以產生雜種辣椒植物。抗或不抗PMMoVP1.2.3的其他辣椒植物優選地是純合植物，甚至更優選地是近交系。在本發明的實施方式中，本發明的其中存在純合子狀態的抗性等位基因以及不表達SNFD表型的植物也可以用于將PMMoVP1.2.3抗性固定到其他的農藝學上有價值的辣椒屬類型內。例如利用通過標準的回交方法(見例如BriggsandKnowles，1967)、隨后通過植物自花授粉至少兩代以及選擇具有抗性等位基因的純合子且不表達SNFD表型的植物的方式可以實現所述固定。在選擇方法的特殊步驟中，使用異花授粉。但是，在被用作雌性親本的植物中，要預防需要自體授粉的自花授粉植物的異花授粉。通過人為地去除繁殖器官的雄性部分可以實現這一點。這可以通過物理去除或通過化學試劑和/或對花施用水的方式可以來實現。所有這些去除了或使得繁殖器官的雄性部分無功能的方法在本領域是公知的。通過引起雜交的雌性親本產生種子，收集F1或回交種子以及播種種子獲得新的植物可以獲得雜交的子代。F1植物可以被自花授粉產生F2代或者與回交方案中的輪回親本進行回交。回交植物還可以與(輪回)親本雜交，以便提高后代植物的農藝學價值，或者回交植物可以自花授粉產生L4等位基因純合的且不表達SNFD表型的植物。在本申請中，結合辣椒闡述了本發明。對于本領域技術人員顯而易見的是本發明的原理同樣適用于辣椒屬的其他物種，以及更常見地適用于其中可以引入L4等位基因而被賦予PMMoV抗性的茄科植物。理論上，本發明的各個部分都可以涉及受PMMoV感染的所有植物，本發明的理論同樣適用于PMMoV宿主范圍內的任何植物物種。在此上下文中，對PMMoV宿主范圍進行了特定的引用，如官方引述為“Brunt，A.A.，Crabtree，K.，Dallwitz，M.J.，Gibbs，A.J.，Watson，L.andZurcher，E.J.(eds.)(1996onwards).′PlantVirusesOnlineDescriptionsandListsfromtheVIDEDatabase.Version20thAugust1996.′URLhttp://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/”的網絡文獻中所述的那樣，但是在http://image.fs.uidaho.edu/vide/refs.htm中也可以找到PMMoV的宿主范圍。在此上下文中，也應當引用Dallwitz，1980andDallwitzetal.，1993。對辣椒的參照不應當被視為對本發明的限制。除了辣椒屬植物本身以及其適用于消費的部分例如果實外，本發明還包括適用于繁殖的植物部分。如上所述，本發明并不限于辣椒植物的植物部分，而是涉及PMMoV的宿主范圍內的任何植物的部分。適用于繁殖的部分實例是器官組織例如種子、葉子、莖、根、秧等、原生質體、體細胞胚、花藥、葉柄、培養細胞等。不僅可以以傳統方式還可以通過植物部分的組織培養技術方式培育或繁殖本發明的植物。用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的本發明的方法包括提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒屬的合適受體植物的步驟。用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的本發明的方法還包括將例如供體植物中的L4抗性等位基因引入到所述受體植物中的步驟，其中L4抗性等位基因賦予所述受體植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性。用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的本發明的方法還包括從所述抗性植物中產生分離群的步驟。用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的本發明的方法還包括產生所述分離群的基本上每種植物的子代的步驟。通過容許所述植物產生種子、例如通過雜交或自交所述植物以及所述種子產生新植物可以產生子代或后代。同樣地，用其他合適的技術可以獲得子代。這些可選擇方案在植物育種領域是相當常見的。用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的本發明的方法包括從至少一種所述子代中選出其基因組內存在L4抗性等位基因以及其基因組內的造成SNFD表型的遺傳信息至少缺失到不表達SNFD表型的程度的植物。本發明的植物基因組中的L4抗性等位基因的存在可以是任何原因(天然或人為原因)的結果，以及可以例如是基因滲入、遺傳加工(轉化)或原生質體融合的結果。利用本領域已知的技術可以完成往無抗性的或具有低水平的PMMoV抗性的受體植物中基因滲入供體植物的一種或多種編碼L4抗性的基因。例如，任選地聯合分子篩選方法例如利用標記物，用傳統育種技術可以將一種或多種編碼PMMoV抗性的基因即L4等位基因基因滲入到無抗性的受體辣椒植物或具有低水平的PMMoV抗性的植物內。傳統育種技術可以適用于將供體植物的一種或多種編碼PMMoV抗性的基因基因滲入到無抗性的或具有低水平PMMoV抗性的受體植物內。這些方法包括物種、品種或栽培品種的傳統雜交，只要這些物種、品種或栽培品種可以相互雜交。當計劃的供體和受體只能有限程度地相互雜交時，可以使用橋接物種。在一種傳統育種方法(稱作譜系育種)中，表現出對PMMoV的抗性以及含有編碼PMMoV抗性的L4等位基因的第一種辣椒植物與無PMMoV抗性或具有低水平的PMMoV抗性以及表現出農藝學上或商業所需特性例如但不限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等的第二種辣椒植物雜交。然后所形成植物群(即F1)被容許自花授粉并收獲種子(F2種子)。篩選由F2種子產生的F2植物的PMMoV抗性。可以用多種不同的方法篩選群。首先，用在此也稱作抗性生物檢測的傳統的病理疾病篩選法篩選群。PMMoV的這種生物檢測在本領域是已知的。具體地，可以在孵育箱或溫室中用PMMoV攻擊單個植物或其部分，并對所形成的每種植物的抗性或易感表型進行計分(score)。作為示例但不作為限制，可以如下在溫室中篩選植物在通常適用于辣椒植物培育的以及本領域技術人員已知的生長條件下，例如自天為22℃以及夜間為20℃的溫度以及在正常的夏季日照條件下，在溫室中由F2種子產生辣椒植物。F2植物例如也可以生長于還含有對照植物例如一種或多種抗性植物以及一種或多種易感植物的花盆(tray)內。受感染的葉子可以作為接種物，其可以是冷凍儲存的。通過用水碾磨受感染的葉子(例如用100ml水碾磨1g冷凍葉)以及添加碳化硅(碳化硅)可以制備出包括測試病毒的接種物。通過用海綿往植物的第一真葉的表面(例如最小3.5×2cm)上涂擦接種物可以實現對測試植物的接種。在第一次觀察之后，可以去除肉眼可判斷為易感的植物(看得見的癥狀是全身花斑)。在1周后的第二次觀察期間，可以計算出易感的抗性植物的數目。對于葉子測試，可以將葉子(距離植物頂部4-5cm)放置于含有濕濾紙的花盆內，并將葉子放置于濾紙的頂部。往花盆(Tray)中加入易感的和抗性的對照植物，用塑料包裹花盆，并將花盆置于16小時/天光照方案中、20℃下。如上所述，可以用海綿進行接種，在6-8天后進行評價。或者，可以聯合分子篩選方法實施傳統育種方法。這些方法一般被稱作標記物輔助性選擇或標記物輔助性育種，并包括利用一種或多種分子標記物鑒定出那些含有一種或多種編碼所需性狀的基因(即L4等位基因或其截短形式)的子代植物。基因組的遺傳組成可以預測出植物的表型，以及長度的生物檢測不再是必需的。也可以用標記物輔助性選擇驗證從生物檢測篩選中獲得的結果。然后可以選出表現出PMMoV抗性表型的F2雜種植物，所述植物含有編碼PMMoV抗性所需的基因以及那些附加的商業所需特性所需的基因，并且所述植物可以被自體授粉數代，以便容許辣椒植物成為逐漸近交的。這種育種和選擇的結果是產生了具有遺傳上同品系的與PMMoV抗性相關的基因以及與商業相關性狀有關的其他基因的植物品系。本發明現在提供了產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的方法，包括步驟a)提供第一種對PMMoV致病型1.2.3或其部分易感的辣椒屬植物；b)提供第二種因為在所述植物的基因組中存在L4抗性等位基因而表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物；c)雜交第一種和第二種植物，產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的子代植物；和d)進一步篩選所述抗性子代植物的基因組中是否存在截短的L4抗性等位基因，其中所述等位基因包括賦予所述子代植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性的遺傳信息，以及其中所述等位基因中的賦予SNFD表型的遺傳信息至少缺少到不表達SNFD表型的程度。在本發明的優選實施方式中，通過評價是否缺失至少一種L4抗性等位基因的標記物進行步驟d)中的篩選，所述標記物選自由如圖3所示的第2組標記物、第1/3組標記物和第3組標記物組成的組，優選地是如圖3所示的第2組標記物。根據本發明的方法，所選的商業所需特性包括缺少SNFD表型，說明與無PMMoV致病型1.2.3抗性的商業辣椒屬品種相比較，所述植物是非分離的、可育的并表現出正常的生長。用任一合適的方法可以鑒定出植物中的這些特性。例如，通過肉眼觀察生長性狀可以鑒定出正常的生長特性，其中沒有矮小生長表示正常生長。通過肉眼觀察種子和/或花粉的數量可以評價可育性。通過評價對如上所述的雜交(抗性對易感株)的F1種子的抗性篩選的測試結果可以評價非分離的表型。或者，通過篩選植物是否缺少特異標記物可以評價是否缺少SNFD表型。在本發明的植物和方法的特別優選的實施方式中，缺少一種或多種第2組標記物。因此，在一個優選的實施方式中，用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的本發明的方法包括從至少一種抗性植物的分離群的子代中選擇出其基因組中存在在此所述的一種或多種(優選的全部的)第1組標記物以及其基因組中沒有在此所述的一種或多種第2組標記物的植物的步驟。在本發明的植物的另一個實施方式中，缺少一種或多種如在此所述的第3組標記物。仍在本發明的植物的另一個實施方式中，缺少一種或多種如在此所述的第1/3組標記物。在此上下文中，一種或多種第1/3組標記物的缺失應當被理解為僅僅沒有那些位于造成對PMMoV致病型1.2.3的抗性的基因組區內的標記物，因為這些遺傳信息的缺失就不會形成因為在植物的基因組內存在L4抗性等位基因而表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的植物。因此，一種或多種第1/3組標記物的缺失優選地只涉及那些位于對應于第3組標記物的區域的標記物，優選地不涉及第1組標記物的區域。在最優選的實施方式中，L4等位基因是被截短的，使得一種或多種第2組標記物是缺失的。在這種情況中，截短是著絲粒側的，而在第3組標記物截短的情況中，截短是端粒側的。在另一個最優選的實施方式中，所述截短使得TG036(Lefebvreetal.，2002；Ben-Chaimetal，2001)標記物(第2組標記物的一種成分)是缺失的。通過往植物內引入包括L4等位基因的截短形式的C.chacoense基因滲入(在此稱作截短的L4等位基因)因此可以實現具有L4等位基因的植物中的SNFD表型的缺失。本領域技術人員可以容易地確定出截短的程度。例如，通過或者經轉基因方法或經重組和選擇的方法部分或完全去除其中任一包括2組、3組和第1/3組標記物的基因滲入區域可以實現合適水平的截短，只要當去除包括第1/3組標記物的區域時，只去除那些不具有造成對PMMoV致病型1.2.3的抗性的信息的區域部分。優選地，所述截短涉及包括第2組標記物的包括L4等位基因的C.chacoense基因滲入區域的部分或完全去除。因此，或者通過轉基因方法或者通過重組和選擇的方法去除包括一種或多種第2組標記物的區域將形成不再表達SNFD表型的植物。最優選地，該截短將造成TG036標記物的去除(Lefebvreetal.，2002；Ben-Chaimetal，2001)。截短水平也可以被定義為遺傳距離。通過相同染色體上的基因座之間的交換頻率可以測定出遺傳距離。兩個基因座離得越遠，它們之間發生交換的可能性就越大。相反地，如果兩個基因座彼此非常接近，它們之間就不太可能發生交換。用在此所定義的各種標記物組中的標記物可以指示出基因座。通常1厘摩(cM)等于基因座(標記物)之間的1％重組。造成一種或多種2組、3組和/或1/3組的標記物缺失的截短水平優選地可以是0.001-10cM，更優選地是0.01-10cM。或者，指示存在基因滲入(例如一種或多種第1組標記物)以及被截短的標記物之間的遺傳距離可以優選地是0.001-10cM，更優選地是0.01-10cM。利用重復選擇和回交技術也可以開發出新的優秀的PMMoV抗性的近交辣椒植物品系。在這個方法中，通過雜交輪回親本和第一個供體植物(其不同于輪回親本，在此稱作“非輪回親本”)可以將L4抗性基因滲入到靶受體植物(叫做輪回親本)內。輪回親本是無抗性的或具有低水平的PMMoV抗性以及具有商業所需特性例如但不限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等、以及其中沒有SNFD表型的植物。回交方法被廣泛地應用于將“供體親本”的基因雜交到具有高農藝學價值的遺傳背景內。通常通過3到5次回交以及隨后的例如2到3次自花授粉可以實現顯性基因往農藝學可接受的表型內的基因滲入，其中在所有步驟中都執行了對農藝學價值的選擇。非輪回親本表現出PMMoV抗性并含有L4抗性等位基因。非輪回親本或供體親本可以是任一植物品種或近交系，其可以與輪回親本或靶向受體植物雜交可孕的。將輪回親本和非輪回親本之間雜交產生的子代與輪回親本回交。然后篩選所形成的植物群。可以用多種不同的方式篩選群。首先，用如在此先前所述的傳統病理篩選法篩選群。其次，利用一種或多種在此前所述的分子標記物進行標記物輔助性選擇，以便鑒定出含有L4抗性等位基因以及其中缺少一種或多種與SNFD表型相關的標記物的那些子代。或者，可以用標記物輔助性選擇驗證從抗性生物檢測篩選中獲得的結果。一旦進行了適當的選擇，就重復所述過程。與輪回親本回交以及選擇PMMoV抗性及缺少SNFD表型(或者與之相關的標記物)的過程被重復了近5代或更多代。該過程所形成的子代是L4等位基因的雜合子。然后末次回交的子代被自花授粉，以便提供包括賦予PMMoV抗性的L4等位基因以及缺少SNFD表型的純合的純種的育種子代。在附加的雜交中，可以用在此所述的L4等位基因純合的以及不表達SNFD表型的PMMoV抗性近交辣椒品系產生PMMoV抗性的雜種植物。例如，第一種PMMoV抗性近交辣椒植物可以與具有商業所需性狀例如但不限于疾病抗性、昆蟲抗性、所需的果實特性等的第二種近交辣椒植物雜交。第二種近交辣椒品系可以抗或者不抗PMMoV。在本發明中所用的選擇方法可以包括提供植物的核酸樣品，優選地是DNA，例如可以利用本領域熟知的核酸分離方法可以獲得所述核酸樣品，并測試所述核酸序列中是否含有標記物。在此所定義的標記物是AFLP標記物，通過實施依據其命名的AFLP反應或者同樣地通過實施擴增反應例如PCR可以檢測出所述AFLP標記物，所述PCR是利用一組或多組標記物特異性引物，其反應條件是其中所述引物可以與它們的特異模板退火，所述引物能夠產生特異的擴增產物。然后，特異的擴增產物的存在指示在模板序列中存在著標記物，而缺少擴增產物指示缺少標記物。為了驗證L4基因滲入(L4等位基因)的存在，檢測核酸樣品中的一種或多種(優選地是所有的)第1組標記物，更優選地是在此所述的E58/M50-F-580標記物和/或E54/M55-F-101標記物。為了驗證被適當截短的等位基因的存在，在此所述的一種或多種第2組標記物優選地是缺失的。一些AFLP標記物也可以被轉化成標記序列的位點標記物，其容許快速并便利地篩選雜交子代(Werneretal.，2001)。或者，一種篩選植物基因組中是否存在L4標記物的方法可以包括將植物的核酸樣品與探針接觸，所述探針可以與染色體區上的包括一種或多種標記物序列的靶向多核苷酸序列選擇性地結合，其中探針在其中探針與靶向多核苷酸序列選擇性結合形成穩定的雜交復合物的條件下與樣品接觸；以及包括檢測是否存在雜交復合物，據此篩選出植物中是否存在所述標記物。在此前所述的方法中所用的標記物輔助性選擇例如可以是逐步進行的，其中在超過一個世代中選擇L4等位基因的存在以及SNFD表型的缺失。可以在測試并選擇其他的商業所需性狀例如疾病抗性、昆蟲抗性、所需果實特性等之前、同時或之后進行對L4等位基因賦予的抗性的標記物輔助性選擇。同樣，對PMMoV抗性或SNFD表型缺失的評價次序并不是特別受限的。應當了解可以在選擇PMMoV抗性植物之前或者甚至同時進行對包括賦予SNFD表型的遺傳信息的植物的排除(優選地是標記物輔助性排除)。從其自然的周圍環境中分離出L4等位基因的物質來源是例如來自C.chacoense編號PI260429或SA185(Boukema，1983)的植物，所述L4等位基因因此只含有賦予L4抗性的遺傳信息以及不含賦予SNFD表型的遺傳信息。從PlantGeneticResources(PGR)clusteroftheCentreforGeneticResources，theNetherlands(CGN)，Wageningen，TheNetherlands中可以得到這些編號。通過從抗PMMoV致病型1.2.3的植物中分離出DNA以及從所述DNA中分離出L4抗性等位基因例如可以產生包括本發明的截短的L4抗性等位基因的分離的核酸序列。通過例如用合適的正向和反向引物擴增包括所述L4等位基因的賦予PMMoV抗性部分的遺傳區域例如可以實現這種分離。合適的引物例如是那些用于第2組標記物的定義的引物以及用于第3組標記物的定義的標記物。通過利用或開發出退火于C.chacoense基因組上的距離第1組標記物的位置不那么遠例如更近的位置上的其他引物可以縮小擴增片段的大小。通過這種方法，可以使得L4等位基因不含有賦予SNFD表型的遺傳信息。本領域技術人員注意到所述核酸中必須存在各種調節元件，因為所述核酸需要在辣椒屬植物中進行表達，據此賦予所述植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性。通過利用本領域公知的標準DNA分離方法提供辣椒植物的基因組DNA樣品也可以分離出例如L4等位基因或L4基因。為了回收大的DNA片段，對分離物質量的要求是相當高的，即基本上避免了基因組DNA的嚴重降解。如果采用了用于獲得大分子量(HMW)DNA制劑的分離技術，通常可以獲得足夠長的DNA。HMWDNA是在制備期間避免物理剪切力的情況下所獲得的DNA。從辣椒屬植物組織中制備出HMWDNA例如可以包括利用細胞壁水解分離出原生質體，并將原生質體包埋于瓊脂糖內。另一種可選用的方法是從植物的細胞核中制備出HMWDNA。對多種植物物種都已經成功地進行了巨堿基DNA的分離，并且這些方法現在都常常被應用于提供適用于構建細菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)克隆載體中的大的插入DNA文庫的巨堿基DNA。一旦分離到基因組DNA，例如通過利用PCR擴增反應所用的限制性內切酶就可以處理所述DNA，或者可以用在此所提供的任何標記物序列克隆或探針化所述DNA。本發明還預期利用本領域已知的技術將這些分離的和純化的基因(或等位基因)插入到辣椒或其他植物內，以便提供表現出抗PMMoV感染的轉基因植物。植物轉化包括構建能在植物細胞內發揮作用的表達載體。在本發明中，這種載體包括包括基因的DNA，所述基因是在調節元件例如啟動子的控制之下或與之可操縱地連接的編碼PMMoV抗性的基因。表達載體可以含有一種或多種這樣可操縱地連接的基因/調節元件組合，只要組合物中所含的至少一種基因能編碼PMMoV抗性。載體可以是質粒形式，利用本領域已知的轉化方法(例如土壤桿菌轉化系統)可以單獨使用或與其他質粒聯合使用所述質粒，以提供抗PMMoV的轉基因植物。表達載體可以包括至少一種與調節元件(例如啟動子)可操縱地連接的遺傳標記物，以便容許通過陰性選擇(通過抑制不含選擇標記物基因的細胞的產生)或者通過陽性選擇(通過篩選遺傳標記物所編碼的產物)回收含有標記物的轉化細胞。許多常用的植物轉化的選擇標記物基因是本領域已知的，包括例如編碼代謝性地解毒選擇性的化學試劑(可以是抗生素或除草劑)的酶的基因，或者編碼對抑制劑不敏感的變更了的靶點的基因。一些陽性選擇方法在本領域是已知的，例如甘露糖選擇。或者，可以用無標記物轉化獲得沒有所提及的標記物基因的植物，所述技術在本領域是已知的。一種用于將表達載體引入到植物內的方法是基于土壤桿菌的天然轉化系統(見例如Horschetal.，1985)。根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)和發根土壤桿菌(A.Rhizogenes)都是遺傳轉化植物細胞的植物致病性的土壤細菌。根癌土壤桿菌和發根土壤桿菌的Ti和Ri質粒分別攜帶有造成植物的遺傳轉化的基因(見例如Kado，1991)。往植物組織中引入表達載體的方法包括用根癌土壤桿菌直接感染植物細胞或與植物細胞共同培養(Horschetal.，1985)。GruberandCrosby，1993和Moloneyetal.，1989提供了對土壤桿菌載體系統以及用于土壤桿菌介導的基因轉移的方法的描述，也見于美國專利5,591,616。在Gruber和Crosby，1993中可以找到對植物表達載體和報告子基因以及轉化方案的綜合描述以及對土壤桿菌載體系統以及用于土壤桿菌介導的基因轉移的方法的描述。例如Mikietal.，1993和Phillipsetal.，1988提供了培養植物組織的常用方法。分子克隆技術以及合適表達載體的專業參考手冊是Sambrook，J.，E.F.Fritsch，andT.Maniatis.MolecularCloningaLaboratoryManual(3rd.edition).ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，N.Y.，2000。另一種用于將表達載體引入到植物內的方法是基于微粒介導的轉化，其中微粒表面上攜帶有DNA。用biolistic裝置將表達載體引入到植物組織內，所述裝置可以將微粒加速到300到600m/s的速度，這足以穿透植物細胞壁和細胞膜(見，Sanfordetal.，1987，1993；Sanford，1988，1990；Kleinetal.，1988，1992)。另一種用于將DNA引入到植物內的方法是通過對靶細胞的超聲處理(見，Zhangetal.，1991)。或者，脂質體或質體融合也已經被用于往植物內引入表達載體(見，例如Deshayesetal.，1985和Christouetal.，1987)。也已經報道了利用氯化鈣沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鳥氨酸將DNA直接攝入到原生質體內的方法(見，例如Hainetal.，1985和Draperetal.，1982)。也已經描述了對原生質體和整個細胞和組織的電穿孔(D′Halluinetal.，1992和Laursenetal.，1994)。在轉化辣椒靶組織之后，利用本領域目前公知的再生和選擇方法，上面所述的選擇標記物基因的表達容許對轉化細胞、組織和/或植物的優先選擇。可以用上述的轉化方法產生轉基因辣椒植物或其他植物物種例如但不限于茄科物種。如前面所定義的那樣，本發明的各個部分理論上可以涉及受PMMoV感染的所有植物，因此可以產生在PMMoV宿主范圍內的任何植物物種的本發明的轉基因植物。然后這種轉基因植物可以與另一種(未轉化的或轉化的)植物雜交，以便提供抗PMMoV感染的辣椒或其他植物物種的轉基因雜種。或者，已經被在此所述的轉化技術遺傳加工成含有編碼PMMoV抗性的外來的(異源的或純合的)基因的轉基因辣椒或其他植物物種中的外來的(外源的)PMMoV抗性基因可以被本領域公知的傳統育種技術(例如回交技術)轉移到另一種植物內。例如，如前面所討論的，可以用回交將含有編碼PMMoV抗性的外來的(異源的)基因以及不含有造成SNFD表型的遺傳信息的轉基因的PMMoV抗性近交辣椒或其他植物品系中的PMMoV抗性基因基因滲入到無抗性的辣椒植物或不含有該基因的其他農作物內，或者可以用回交將含有編碼PMMoV抗性的外來基因的轉基因的雜種PMMoV抗性辣椒植物或其他植物中的PMMoV抗性基因基因滲入到不含該基因的植物品系內。在另一個實施方式中，可以用原生質體融合產生優秀的新的PMMoV抗性植物。更具體地，可以從表現出抗PMMoV感染以及不含造成SNFD表型的遺傳信息的辣椒植物或其他植物品系中獲得第一個原生質體。可以從含有商業所需特性例如但不限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等的第二種辣椒或其他植物品種中獲得第二個原生質體。然后用本領域已知的傳統原生質體融合方法融合原生質體。例如，通過采用聚乙二醇(PEG)溶液促進膜的融合可以完成原生質體融合。在Sundbergetal.，1986所述的用于產生種間雜種或其修飾物的條件下可以實現這種體細胞雜交。但是，本領域技術人員要知道可以用不同于利用聚乙二醇(PEG)的其他方法完成原生質體融合。例如，利用KoopandSpangenberg，1989所述的電場誘導融合技術可以融合原生質體。另外，用葡聚糖和聚乙烯醇可以完成原生質體融合。在Glebaetal.，1984和DoddsandRoberts，1995中可以找到用于原生質體融合的其他方法。現在將以舉例說明的方式給出本發明的實施例，這并非是對本發明的限制。實施例產生兩種近交親本系，稱作Sylvia雄性親本(S&G品種“Cuby”的近交系)和Manito雌性親本(S&G品種“Tasty”的近交系)。品種Sylvia和Manito的PMMoV抗性最初都是分離的。通過植物選擇以及測試雜交，有可能將抗性固定于兩種變體內。但是，注意到，兩種品種的雄性親本都具有例如不穩定的雄性可育性/差的可育性和矮小生長的性狀。這些實施例中所用的PMMoV致病型1.2.3都是具有與Boukema，1982所提及的分離株P14相似的特性的病毒分離株。在下面的實施例中，各種試驗中所用的病毒分離株都來自PTG(ProefstationvoorTuinbouwonderGlas)，nowPPO，inNaaldwijk，TheNetherlands，并被機械化地傳代繁殖。實施例1相同品種內的抗性和易感辣椒植物中的L4抗性標記物通過Keygene(Wageningen，TheNetherlands)產生L4基因座的連鎖圖譜。L基因座所被基因定位的區域位于11號染色體南側的端粒上(Lefebvreetal.，2002)。該基因座周圍的標記物可以分成4組。圖1顯示出了與L4基因座相連的不同的組的位置。每組都含有多個標記物，每組內都沒有發現重組。連鎖圖譜朝向染色體的剩余部分的定位還不清楚。表1顯示了每組內的標記物。表1相應各組內的標記物的概述在與上面所述的相當相似的生物檢測中測試分離品種Manito和Sylcia的F1植物以及抗性親本系。花盆(tray)包括35株測試植物，包括一個易感對照和一個抗性對照。基本上如上所述的進行莖和葉測試生物檢測。表2顯示了生物檢測的結果。表2對品種Sylvia和Manito以及它們的抗性親本系的生物檢測的結果從表2所述的生物檢測中，隨機選出分離品種Manito和Sylvia的F1植物中的3株抗性和3株易感植物，以及隨機地選出它們的相應的抗性雄性親本的5株植物。用表1所示的與L4基因座相連的4種標記物進一步分析所選的植物。在進行測試的同時，并沒有鑒定表1中所列的所有標記物。通過測試各種標記物的存在分析每種品種中的3株抗性和3株易感植物。分析了5株來自相應的抗性親本的植物。表3列出了標記物分析的結果。表3所選植物的生物檢測中的標記物計分(顯性，見正文)編號對應于標記物測試中的測試編號；R抗性；S易感；+存在；-缺乏。如表3中所見的那樣，與L4等位基因相關的所有標記物都存在于在生物檢測(R)中表現出抗性表型的F1植物內。但是，在易感植物內，不存在L4標記物。在生物檢測中，Manito的抗性父本(第29-33)和Sylvia的抗性親本(第40-44)都沒有表現出分離性，所有與L4等位基因相連的標記物都存在于這些植物內。因為標記物只被計分為存在或缺失(顯性)，因此還不能推斷出基因滲入片段的存在是否是純合的或雜合的。推斷出L4基因滲入的缺失引起了F1中的易感性。附加的測試還發現不存在對L4抗性遺傳性的母系效應。實施例2開發非分離的Sylvia品種為了開發出非分離的Sylvia品種，抗性親本系(4578品系)的單個植物與易感親本的植物雜交。在所形成的單個F1群中評價L4抗性分離的發生情況。結果列于表4內。通過4578-8號植物的自花傳粉獲得了6636品系。6636品系的單個植物被列出多次，因為這些植物作為雄性品系被用于不同的(但相關的)易感的雌性品系。4578品系的植物都沒有形成完全抗性的F1。但是通過4578品系的自花傳粉(參見6636品系)，有可能發現100％被轉移了抗性基因的植物品系。在10個實例中有4例形成了完全抗性的F1。源自6636-4的F1的分離顯示出了不同于其他植物品系的分離模式。如圖4所示，分離的F1群(2R/3S-3R/2S)中的抗性植物的數目有所不同。當結合分離的F1群中的抗性和易感植物的數目時，預計分離將是更為可靠的。因為所有F1群都使用了相同的抗性來源，因此不穩定的(分離的)抗性的原因是相同的。表8顯示了在表4中所提及的三種雜交(4578、6636雜交1和6636雜交2)的匯總(compiled)結果；兩種6636雜交是兩種不同的易感親本與相同的抗性植物雜交的結果。表4源自單個植物的Sylvia的F1分離。也測試了用于產生表1中的F1群的6636品系的單個植物的自花傳粉的PMMoV抗性。所有自花傳粉的植物品系都顯示出完全的抗性。結果列于表5中。表5親本系的自花傳粉的結果從該試驗中，L4等位基因的不需要的特性變成清楚的，可以推斷出造成非分離的后代的單個植物的自花傳粉驗證了純合性，而單個抗性植物與易感植物的雜交造成了分離的F1后代并驗證了雜合性。實施例3非分離的Manito品種的開發用如實施例2所述的相似方法開發非分離的Manito品系。抗性親本系的植物與易感親本的植物單個地雜交，并評價單個F1群的分離性。結果列于表6。在雜交之前去除了所有表現出低可育性(SNFD表型)的植物，這些植物作為“未測試的”列于表6內。最初在0025-5植物中沒有觀察到低可育性，但是之后其表現出存在低可育性。表6源自各植物(首先篩選的)的Manito的F1分離。僅僅0025-5植物形成了非分離的雜種。在60個品系中總共有14個品系都表現出了低可育性(SNFD表型)。該表中的F1群的分離性也被匯總于表8。為了增加造成非分離的F1的抗性植物的數目，進行了第二個測試。在雜交之前沒有去除表現出低可育性的植物。結果列于表7內，分離性也被匯總于表8。50個品系中總共有12個品系(25％)形成了完全抗性的F1群。表7源自單個植物(第二次篩選)的Manito的F1分離表8實施例2和3中的分離的F1的匯總結果在所有情況中都相似的一點是抗性植物要比易感植物更多。4578和6636-雜交1代的分離率接近于1∶1，符合抗性親本為雜合子的單基因模型。在6636-雜交2和2825-2834中，分離接近于9∶7。9∶7分離源自F2群。通過雜交兩種純合系(抗性不分離的品系)，不可能得到F1中的9∶7分離。更可能的是，也存在1∶1分離。0021-0026的分離不同于其他情況，其最符合3∶1分離。根據可育性選擇植物以及雜交之前去除了低可育性植物的事實可能造成了這種差異。實施例4對所觀察到的L4等位基因非孟德爾遺傳的連鎖累贅(linkagedrag)解釋引言對于用于表8中的雜交的植物，對其可育性和矮小生長(SNFD表型)進行記分(score)。所有造成非分離的F1的植物都表現出低可育性。這說明低可育性和非分離相關聯。表7中所示的結果顯示，約25％的植物形成了非分離的雜種。在表6中，25％植物表現出低可育性并且在評價F1之前被去除。當低可育性植物被認為是好的賦予抗性的親本時，那么表6和表7之間的結果是相當的。在此提到的源自這些非分離的植物的近交系的確都表現出矮小生長。從中可以推斷出，負面性狀(不穩定的抗性、低可育性、矮小生長)與L4等位基因緊密連鎖或具有多效性。歸納并測試了在實施例1到3中觀察到的F1分離的性質的可能解釋。測試了致死性基因與易感等位基因連鎖或者致死性基因與抗性等位基因連鎖的可能性，但是否定了這種可能性。也否定了基因沉默、需要第二種用于表達L4等位基因或者需要第二種用于轉移L4等位基因的可能性。另外，沒有找到存在轉座子或印記(imprinting)(種子發育期間的特殊條件所造成的基因沉默)的證據。此外，在詳細地推敲測試方案之后，除外了抗性性狀為非單基因的可能性。隨后測試了C.chacoense基因滲入片段是否造成了辣椒染色體的染色體折疊的問題。不規則的折疊將形成不平衡的染色體，造成純合子(L4L4)植物的減數分裂方面的問題。在染色體配對過程中，其中一條染色體可以被損壞，造成等位基因的缺失，稱作“-”等位基因。這反過來會造成抗性的丟失。結合在分離F1的易感植物中沒有發現標記物，染色體的破壞是最有可能的。如果存在純合的缺失等位基因是致死性的，那么L4-基因型的自花傳粉的確將在生物檢測中形成完全抗性系。按此方式也能衍生出非分離的F1，當L4-基因型與易感系雜交時，F1將按1∶1比例分離。在L4-基因型的自花傳粉之后，能發現具有純合的L4基因型(L4L4)的植物，但是預計這些植物將會遇到減數分裂方面的問題。然后，這就可以解釋當在生物檢測中進行測試時，該品系為完全抗性的(即所有測試植物都是抗性的植物)，但是仍發現當與易感親本雜交時形成了分離的F1群的原因。這也可以解釋為什么在易感的F1群植物中沒有找到標記物的原因。這個解釋預測形成非分離的F1的L4L4基因型是染色體折疊的重排結果。在該重排的折疊情況中，染色體配對不會造成染色體臂的斷裂。但是，造成低可育性和減慢生長(矮小植物)的植物內的其他過程是最可能被破壞的。已知只有少數花粉源自這些植物。也只有少數種子被報道源自這些植物品系。從上面的試驗中，因此可以推斷出包括L4等位基因的C.chacoense的基因組片段太大并造成了分離的F1群。因此，縮小該片段的大小可以解決整個問題。試驗方案在多個辣椒品系中都評價了L4基因座的各種標記物的存在。首先，評價兩種抗性辣椒品系M-873和M-3751的基因滲入片段的大小。已知這些品系都形成了非分離的F1以及正常的可育性。通過篩選位于L4等位基因側面的標記物可以比較片段和S&G近交系(Manito的父本)中所存在的基因滲入的大小。標記物的位置見表2。結果列于表9。測試植物品系中的與L4基因座相連的4種標記物，朝向L4等位基因的標記物的位置顯示于表1。表9中所列的標記物被標記為純合存在、雜合存在或缺失。也羅列了抗性親本系的可育性以及F1的抗性。通過將花粉的量標記為“有限量花粉”(-，差的可育性)、“中等量花粉”(+/-，中等可育性)、和“與非抗性的、可育對照植物相似的花粉量”(+，好的可育性)可以肉眼評價可育性。M-873和M-3751品系的抗性來自DeRuiterSeeds，Bergschenhoek，TheNetherlands的辣椒培育品系。篩選具有好的和中等的可育性的M-873和M-3751品系植物是否存在或不存在標記物。所有實例中的平均可育性比Manito品系父本的可育性更好。其他品系都是培育品系，對其的選擇是根據可育性或者是因為它們形成了非分離的雜種。表9對一些辣椒品系中的C.chacoense基因滲入的評價。++標記物純合存在，有抗性；-標記物純合缺失，易感的；+/-標記物雜合存在，有抗性；+標記物存在，未測試等位基因差異；？未測試。結果說明在M-873和M-3751品系中存在著更小的基因滲入片段。不含第2組標記物(E39/M58-F-65)。通過評價這些品系的譜系，發現兩品系共享有共同的vp-nr91Pa0424，F3T137310。8972，8609和8613品系的植物都給出了雜合子的記分(score)，盡管在生物檢測中其都被計為完全抗性。進行了與8972品系的雜交，結果列于表10。表10源自標記為表9的雜合的8972品系的F1群的結果。從8972品系中獲得的F1群的結果是在預期之內的。為了進一步地鑒定出重組，分析分離品系是否存在L4基因座標記物。根據F3分離(其最接近于3∶1)選擇品系。收集每個F3群的植物，因為在從F1到F2的自花傳粉期間應當可以發生重組。在已經發生重組的情況中，F3群應當是重組的純合子。所選定的品系列于表11。表11重組鑒定所選定的品系對這些植物的標記物分析的結果列于表12。如表1所示的指出了L4基因座的標記物。標記物標記“+”表示存在標記物，標記物標記“-”表示不存在。表12所選定的L4抗性和非SNFD表型品系的標記物標記可以推論出，在所選定的含有L4抗性等位基因的標記物(第1組標記物)且不含有包括第2組標記物的位置的遺傳物質的品系中沒有發現新的重組。發現這些品系是有抗性的，而且沒有觀察到SNFD表型。因此，推論出導致包括第2組、或第2組和第3組的標記物位置的遺傳物質丟失的重組造成了SNFD表型的喪失。參考文獻AlonsoE，Garcia-LuqueI，delaCruzA，WickeB，Avila-RinconMJ，SerraMT，CastresanaC，Diaz-RuizJR(1991)NucleotidesequenceofthegenomicRNAofpeppermildmottlevirus，aresistance-breakingtobamovirusinpepper.JGenVirol.722875-84.AntignusY，LachmanO，PearlsmanM(2000)ANewStrainofPepperMildMottleVirus(PMMV)OvercomingResistanceConferredbyL4Alleles，Phytoparasitica28(3)282-283.Avila-RinconMJ，FerreroML，AlonsoE，Garcia-LuqueI，Diaz-RuizJR(1989)Nucleotidesequencesof5′and3′non-codingregionsofpeppermildmottlevirusstrainSRNA.JGenVirol.703025-31.Ben-ChaimA，GrubeRC，LapidotM，JahnM，ParanI(2001)IdentificationofquantitativetraitlociassociatedwithresistancetocucumbermosaicvirusinCapsicumannuum.TheoreticalandAppliedGenetics102(8)1213-1220.Berzal-HerranzA，delaCruzA，TenlladoF，Diaz-RuizJR，LopezL，SanzAI，VaqueroC，SerraMT，Garcia-LuqueI(1995)ThecapsicumL3gene-mediatedresistanceagainstthetobamovirusesiselicitedbythecoatprotein.Virology，209498-505.BoukemaIW，JansensK，HofmanK(1980)StrainsofTMVandgenesforresistanceinCapsicumSynopsisofthe4thmeetingoftheEucarpiaCapsicumWorkingGroup，p.44-48.BoukemaIW(1982)ResistancetoanewstrainofTMVinCapsicumchacoenseHunz.CapsicumNewsletter149-51.BoukemaIW(1983)ResearchonthelocationofthegeneforresistancetoTMVinCapsicumchacoenseHunz.andmalesterilityinprogeniesfromthecrossC.chacoensexC.annuumL.ProceedingsVthMeetingCapsicumandEggplantWorkingGroupofEucarpia，4-7July，Plovdiv，Bulgariap.84-87.BoukemaIW(1984)ResistancetoTMVinCapsicumchacoenseHunz.isgovernedbyanalleleoftheL-locus.CapsicumNewsletter347-48.BriggsFN，KnowlesPF(1967)IntroductiontoPlantBreeding.ReinholdPublishingCorporation.U.S.A.ChristouP，MurphyJE，andSwainWF(1987)Stabletransformationofsoybeanbyelectroporationandrootformationfromtransformedcallus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA843962-3966.DallwitzMJ(1980)Ageneralsystemforcodingtaxonomicdescriptions.Taxon2941-46DallwitzMJ，PaineTA，ZurcherEJ(1993)User′sGuidetotheDELTASystemageneralsystemforprocessingtaxonomicdescriptions.4thedition.136pp.(CSIRODivisionofEntomologyCanberra)DeshayesA，Herrera-EstrellaL，CaboeheM(1985)Liposome-mediatedtransformationoftobaccomesophyllprotoplastsbyanEscherichiacoliplasmid.EMBOJ.42731-2737.D′HalluinK，BonneE，BossutM，DeBeuckeleerM，LeemansJ(1992)Plant.Cell41495-1505.DoddsJHandRobertsLW(1995)ExperimentsinPlantTissueCulture.3rdEd.CambridgeUniversityPress.DraperJ，DaveyMR，FreemanJP，CockingECandCoxBJ(1982)TiplasmidhomologoussequencespresentintissuesfromAgrobacteriumplasmid-transformedPetuniaprotoplasts.PlantandCellPhysiol.23，451-458.Garcia-LuqueI，FerreroML，RodriquezJM，AlonsoE，delaCruzA，SanzAI，VaqueroC，SerraMT，Diaz-RuizJR(1993)Thenucleotidesequenceofthecoatproteingenesand3′non-codingregionsoftworesistance-breakingtobamovirusesinpeppershowsthattheyaredifferentviruses.ArchVirol.131(1-2)75-88.GilardiP，Gareia-LuqueI，SerraMT(2004)ThecoatproteinoftobamovirusactsaselicitorofbothL2andL4gene-mediatedresistanceinCapsicum.JGenVirol.852077-85.GlebaIU，SytnikKM，ShoemanR(1984)ProtoplastFusion，GeneticEngineeringinHigherPlants.Berlin；NewYorkSpringer-Verlag，1984.GruberMY，CrosbyWL(1993)VectorsforPlantTransformation.InGlickBRandThompsonJE(Eds.)MethodsinPlantMolecularBiology&Biotechnology，CRCPress，pp.89-119.HagiwaraK，IchikiTU，OgawaY，OmuraT，TsudaS(2002)Asingleaminoacidsubstitutionin126-kDaproteinofPeppermildmottlevirusassociateswithsymptomattenuationinpepper；thecomplerenucleotidesequenceofanattenuatedstrain，C-1421.ArchVirol.147(4)833-40.HainR，StabelP，CzernilofskyAP，SteinblissHH，Herrera-EstrellaL，SchellJ(1985)Uptake，integration，expressionandgenetictransmissionofaselectablechimaericgenetoplantprotoplasts.Mol.Gen.Genet.199161-168.HorschRB，FryJE，HoffmanNL，EichholtsD，RogersSG，FraleyRT(1985)Asimplemethodfortransferringgenesintoplants.Science2271229-1231.KadoCI(1991)Molecularmechanismsofcrowngalltumorigenesis.Crit.Rev.PlantSci.101-32.KiritaM，AkutsuK，WatanabeY，TsudaS(1997)NucleotidesequenceoftheJapaneseisolateofpepper[Capsicumannuum]mildmottletobamovirus(TMV-P)RNA.Ann.Phytopathol.Soc.Jpn.63373-376.KleinTM，GradzielT，FrommME，SanfordJC(1988).Factorsinfluencinggenedeliveryintozeamayscellsbyhighvelocitymicroprcjectiles.Biotechnology6559-563.KleinTM，ArentzenR，LewisPA，andFitzpatrick-McElligottS(1992)Transformationofmicrobes，plantsandanimalsbyparticlebombardment.Bio/Technology10286-291.KoopH-UandSpangenbergG(1989)Electricfieldinducedfusionandcellreconstitutionwithpreselectedsingleprotopl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表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性，其通過將權利要求1到9中任一項的植物與表現出商業所需特性的純合的、優選近交的辣椒植物進行雜交而獲得。11.一種分離的核酸序列，其包括截短的L4抗性等位基因，其中所述截短的L4抗性等位基因包括能夠在辣椒屬植物中表達并由此賦予所述植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性的遺傳信息，且其中所述等位基因中沒有賦予SNFD表型的遺傳信息。12.權利要求11的分離的核酸序列，其中所述賦予抗性的遺傳信息包括至少一種選自包括標記物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580的組中的標記物，優選地包括至少一種選自標記物E54/M55-F-101和E58/M50-F-580中的標記物，且其中所述賦予SNFD表型的遺傳信息包括至少一種選自由如圖3所示的第2組標記物和第3組標記物組成的組中的L4抗性等位基因標記物，優選地選自第2組標記物。13.權利要求11或12的分離的核酸序列，其中所述L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因組。14.一種用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的方法，包括步驟a)提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒屬受體植物或其部分；b)提供辣椒屬供體植物，所述供體植物由于其基因組中存在L4抗性等位基因而表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性；c)將所述受體和供體植物雜交，產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的子代植物；d)篩選抗性子代植物的基因組中是否存在截短的L4抗性等位基因，其中所述等位基因包括賦予所述子代植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性的遺傳信息，且其中所述等位基因缺少賦予SNFD表型的遺傳信息，其缺少的程度至少使得SNFD表型不表達；并選出具有截短的L4抗性等位基因的子代植物。15.權利要求14的方法，其中通過篩選所述子代植物的基因組中是否缺少至少一種L4抗性等位基因標記物而進行步驟d)中的篩選，所述至少一種L4抗性等位基因標記物選自如圖3所示的第2組標記物、第1/3組標記物和第3組標記物組成的組中，優選地選自如圖3所示的第2組標記物。16.權利要求14或15的方法，其中通過篩選所述子代植物的基因組是否存在至少一種L4抗性等位基因標記物而進行步驟d)中的篩選，所述至少一種L4抗性等位基因標記物選自包括標記物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580的組中，優選地選自標記物E54/M55-F-101和E58/M50-F-580。17.權利要求14到16中任一項的方法，其中所述步驟c)包括進行抗性生物檢測。18.權利要求14到17中任一項的方法，其中所述子代植物是通過在步驟c)中雜交而得到的F1植物的自花傳粉、或者通過將所述雜交而得到的F1植物與另一種辣椒植物進行雜交而產生的分離群的植物。19.一種用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的方法，包括步驟a)提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒屬受體植物或其部分；和b)往所述受體植物或其部分或其子代植物的基因組中引入包括截短的L4抗性等位基因的基因組區，其中所述等位基因包括能夠在所述植物或植物部分或子代植物中表達并由此賦予所述植物或植物部分或子代植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性的遺傳信息，且其中所述等位基因缺少賦予SNFD表型的遺傳信息，其缺少的程度至少使得SNFD表型不表達；且其中通過體外培養技術、原生質體融合、轉化或雙單倍體技術而引入所述基因組區。20.權利要求19的方法，還包括使得所述植物部分生長成辣椒植物的步驟。21.權利要求19或20的方法，其中所述方法還包括步驟c)選擇PMMoV致病型1.2.3抗性植物或子代植物，和d)選擇不表達SNFD表型的抗性植物或子代植物。22.權利要求21的方法，其中步驟c)包括篩選所述植物或子代植物的基因組是否存在至少一種L4抗性等位基因標記物，所述至少一種L4抗性等位基因標記物選自包括標記物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580的組中，優選地選自標記物E54/M55-F-101和E58/M50-F-580。23.權利要求21的方法，其中所述步驟c)包括進行抗性生物檢測。24.權利要求21到23中任一項的方法，其中所述步驟d)包括篩選所述抗性植物或子代植物的基因組的截短的L4抗性等位基因中是否存在至少一種L4抗性等位基因標記物，所述至少一種L4抗性等位基因標記物選自由第2組標記物和第3組標記物組成的組中，優選地選自第2組標記物；并選出其中缺失至少一種所述標記物的植物或子代植物。25.一種用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬的近交植物的方法，包括進行權利要求14到24中任一項的方法，并進一步包括步驟e)所選植物的自我傳粉；f)播種通過所述自我傳粉而得到的種子，并使所述種子生長成植物；g)鑒定來自步驟f)的表現出PMMoV致病型1.2.3抗性并具有商業所需特性的植物，和h)重復步驟e)至g)，直到產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性并具有商業所需特性的近交辣椒植物。26.權利要求14到25中任一項的方法，其中所述供體植物是C.chacoense植物或其中所述截短的L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因組。27.權利要求14到26中任一項的方法，其中所述受體植物是辣椒植物。28.一種表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物，其是通過權利要求14到27中任一項的方法而獲得的。29.權利要求28的植物，其中所述植物是近交植物。30.權利要求1到10、28或29中任一項的植物的子代。31.適合于繁殖的權利要求1到10、28或29中任一項的植物的部分或衍生物，優選地是通過選自由葉、莖、根、秧、果實等、原生質體、體細胞胚、花藥、葉柄、培養細胞、種子等組成的組中的器官組織而繁殖。32.適用于消費的權利要求1到10、28或29中任一項的植物的部分或衍生物，例如果實。33.通過生長權利要求1到10、29或29中任一項的辣椒植物所產生的辣椒種子。34.表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的雜種辣椒植物或其部分，其是通過將權利要求29的植物與表現出商業所需特性的純合的、優選地近交的辣椒植物進行雜交而得到的。全文摘要本發明涉及一種辣椒屬(Capsicumgenus)植物，其中植物因為在所述植物的基因組中存在L4抗性等位基因而表現出對辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性，其中所述植物的基因組中的負責SNFD表型的遺傳信息至少缺失到或被抑制到不表達SNFD表型的程度。本發明還涉及一種用于產生表現出對PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒屬植物的方法，包括步驟a)提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒屬受體植物或其部分；b)往所述受體植物或其部分或其子代植物的基因組中引入包括截短的L4抗性等位基因的基因組區，其中所述等位基因包括能夠在所述植物或植物部分或子代植物中表達并據此賦予所述植物或植物部分或子代植物對PMMoV致病型1.2.3的抗性的遺傳信息，以及其中所述等位基因中的賦予SNFD表型的遺傳信息至少缺失到不表達SNFD表型的程度。文檔編號C12Q1/68GK101068464SQ20058004150公開日2007年11月7日申請日期2005年9月30日優先權日2004年10月1日發明者A·P·阿勒斯瑪,R·J·M·霍夫斯泰德,D·弗雷烏格丹希爾申請人:德魯伊特種子研發有限公司