改變種子表型的方法和組合物的制作方法

專利名稱：改變種子表型的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及調節植物種子的表型的方法和材料。具體而言，本發明的特點是可以用于調節種子重量的核酸和植物。
背景基因通常在生物，特別是生物的細胞的發育的過程中差異表達。可以將闡明和操控生物的暫時和空間基因表達圖譜用于開發新的和被改善的生物產品。
在大量影響生物的基因表達圖譜的調節機制中，基因甲基化的調節具有重要的作用。在許多情形中，通過特定的核苷酸序列的位點特異性的甲基化或去甲基化來調節基因的甲基化。
概述本發明包括在植物的雄性配子體特異性的細胞或雌性配子體特異性細胞中調節胞嘧啶DNA甲基轉移酶相關的核酸的轉錄和/或翻譯。當在雜交中將這樣的植物用作親本時，得到的種子具有改變的種子表型，例如增加的種子重量。因此，本發明的特點是用于產生種子的方法。在一個方面，這些方法包括允許第一植物對第二植物進行授粉。所述第一植物具有第一重組核酸構建體，其包含與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的第一核酸序列可操作連接的雄性配子體組織特異性調節元件。第二植物具有第二重組核酸構建體，其包含與有效減少胞嘧啶DNA甲基化的水平的第二核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件。在第二植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的對照植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的對照植物缺乏第二重組核酸構建體，并且被缺乏第一重組核酸構建體的相應對照植物進行授粉。與在對照植物上形成的種子的平均種子重量相比，這些種子可以具有至少10％更高(例如，10％到約50％更高)的平均種子重量。
第一植物可以是近親交配的(inbred)，雜交的，異質的種群，或人造的種群(synthetic population)。第一植物對于重組核酸構建體而言可以是雜合的，或是純合的。類似地，第二植物可以是近親交配的，雜交的，異質的種群，或人造的種群，并且對于重組核酸構建體而言可以是純合的，或是雜合的。第一和第二植物可以是雙子葉植物。第一重組核酸構建體的核酸序列可以編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，在所述甲基轉移酶中具有一定區域，所述區域具有在SEQ ID NO50中提出的共有序列。胞嘧啶DNA甲基轉移酶可以與在SEQ ID NOS28，30，34，36，38，和40中提出的擬南芥(Arabidopsis)，桃，豌豆，胡蘿卜，西紅柿，或煙草的氨基酸序列之一具有50％或更多的序列同一性。第二重組核酸構建體的第二核酸序列可以被轉錄成干擾RNA或反義核酸。
第一和第二植物可以是單子葉植物。第一重組核酸構建體的第一核酸序列可以編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，其與在SEQ ID NOS44和46中顯示的玉米或水稻胞嘧啶DNA甲基轉移酶的氨基酸序列具有50％或更大的序列同一性(例如，70％，80，90％，或95％)。
在另一方面，本發明的特點是用于產生種子的方法，所述方法包括容許第一植物給第二植物授粉的步驟。所述第一植物具有重組核酸構建體，其包含與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的第一核酸序列可操作地連接的雄性配子體組織特異性調節元件。在第二植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的第二植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量減少，所述相應的第二植物被缺乏重組核酸構建體的相應第一植物進行授粉。
在另一個方面，本發明的特點是用于產生種子的方法，其包含容許具有重組核酸構建體的植物的授粉，所述核酸構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件。授粉用缺乏重組核酸構建體的花粉進行。在所述植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物缺乏重組核酸構建體，且被缺乏重組核酸構建體的植物授粉。被授粉的植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。雌性配子體組織特異性調節元件可以是，例如，擬南芥YP0102，YP0102a或YP0285啟動子，SEQ ID NOS6，25，或22。可以將有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列轉錄成干擾RNA或反義RNA，并且可以具有10個核苷酸到4,500個核苷酸的長度，并且可以與來自在SEQ ID NOS29，31，33，35，37，39，41中提出的擬南芥，桃，大豆，豌豆，胡蘿卜，西紅柿或煙草的核酸序列之一，或這些序列之一的互補序列具有70％或更大的序列同一性。這些核酸序列可以具有從20個核苷酸到1000個核苷酸的長度，與來自擬南芥，桃，豌豆，胡蘿卜，西紅柿或煙草的這些相同的核酸序列，或它們的補體之一具有80％或更大的序列同一性。備選地，核酸序列可以具有10個核苷酸到4,500個核苷酸的長度并且與在SEQ ID NOS43，45，47，49提出的小麥，玉米，水稻或苔類植物核酸序列之一，或這些序列之一的互補序列具有70％或更大的序列同一性。這些核酸序列可以具有20個核苷酸到1,000個核苷酸的長度，并且可以與來自玉米，水稻，小麥或苔類植物的這些相同的核酸序列，或它們的互補序列之一具有80％或更大的序列同一性。授粉可以以來自非轉基因植物的花粉進行。
本發明還以產生種子的方法為特征，所述方法包括容許具有重組核酸構建體的植物的授粉的步驟，所述核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作地連接的雌性配子體組織特異性調節元件。授粉以缺乏重組核酸構建體的花粉進行。在該植物上發育的種子的平均種子重量比在相應的植物上發育的種子的平均種子重量減少，所述相應的植物缺乏重組核酸構建體，且被缺乏重組核酸構建體的植物進行授粉。
本發明還以用于產生種子的方法為特征，所述方法包括容許第一植物給第二植物授粉的步驟。第一植物具有重組核酸構建體，所述核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化的水平的核酸序列可操作地連接的雄性配子體組織特異性調節元件。在第二植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物被缺乏或不表達重組核酸構建體的植物授粉。第一和第二植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可以編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，所述甲基轉移酶包括本文所述的共有多肽區域。
本發明還以用于產生種子的方法為特征，所述方法包括容許在多種植物中進行授粉的步驟，所述植物包括多種第一植物。第一植物中的每種具有第一重組核酸構建體，所述核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雄性配子體組織特異性調節元件，其中在授粉后在第一植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物缺乏重組核酸構建體。所述授粉可以主要是自花授粉。多種第一植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。多種植物還可以包含多種第二植物。所述第二植物具有第二重組核酸構建體，其包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件。在授粉后在第二植物上發育的種子具有的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物缺乏重組核酸構建體。在被授粉的植物上發育的種子所具有的平均種子重量可以比在相應的植物上發育的種子的平均種子重量至少大10％，所述相應的植物缺乏重組核酸構建體。
本發明還以轉基因宿主細胞為特征，所述宿主細胞包括重組核酸構建體，所述核酸構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列。該核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件在植物雌性配子體細胞類型中賦予轉錄。該調節元件可以包括在SEQ ID NOS6到27中提出的序列之一。在另一個方面，轉基因宿主細胞可以包括重組核酸構建體，所述核酸構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化的水平的核酸序列，所述核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件在植物雄性配子體細胞類型中賦予轉錄。
本發明還以轉基因植物為特征，所述植物包括重組核酸構建體，所述構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列。該核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件在雌性配子體細胞類型中賦予轉錄。調節元件可以包括在SEQ ID NOS6到27中提出的序列之一。一個或多個調節元件可以賦予在與卵細胞，合子和胚胎相關的極性細胞核和中央細胞中的優先轉錄。所述植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可以被轉錄成干擾RNA或反義RNA。該核酸序列可以具有10個核苷酸到4,500個核苷酸的長度并且與在SEQ ID NOS29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49中提出的核酸序列之一，或這些序列之一的互補序列具有70％或更多的序列同一性。例如，這些核酸可以具有20個核苷酸到1,000個核苷酸的長度，并且與這些核酸序列，或它們的互補序列之一具有80％或更多的序列同一性。
本發明還以轉基因植物為特征，所述轉基因植物包括重組核酸構建體，所述核酸構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列，所述核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件在雄性配子體細胞類型中賦予轉錄。
本發明還以生產的制品(article)為特征，所述制品包括包裝物質和在包裝物質中的兩種或更多類型的種子。在一些實施方案中，由第一類型的種子培養的植物在雄性配子體細胞中過量表達胞嘧啶DNA甲基轉移酶。由來自第二類型的種子培養的植物可以或不可以具有重組核酸構建體，其在雌性配子體細胞中抑制胞嘧啶DNA甲基轉移酶的表達。在其它實施方案中，由第一類型的種子培養的植物缺乏重組核酸，其導致胞嘧啶DNA甲基轉移酶在雄性配子體細胞中的過量表達，并且由來自第二類型的種子培養的植物具有重組核酸構建體，其抑制胞嘧啶DNA甲基轉移酶在雌性配子體細胞中的表達。
本發明的一個或多個實施方案的細節將在下面的附圖和描述中進行闡明。除非另外指出，用于本文的所有的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。盡管類似的方法和材料或本文所述的那些的等價物可以用在本發明的實踐或檢驗中，下面描述適合的方法和材料。將本文提及的所有的出版物，專利申請，專利和其它的參考文獻全文并入本文作為參考。為避免沖突，本說明書，包括定義將進行控制。此外，所述材料，方法和實施例僅是舉例說明性的，而不意欲進行限制。從描述和圖以及從權利要求，本發明的其它特點，目標和優勢將變得顯而易見。
附圖描述


圖1顯示擬南芥的Met1基因組DNA序列。下劃線的核苷酸表示用于制備實施例1的反義核酸構建體的基因組序列的部分。
圖2是在胞嘧啶DNA甲基轉移酶中的某些特點的概略示意。
在各個圖中的相同的標記符號指示相同的元件。
詳細描述在一個方面，本發明提供調節植物中種子表型的方法。調節種子表型包括在生物諸如玉米(Zea mays)或大豆(Glycine max)的雄性配子體特異性細胞或雌性配子體特異性細胞中轉錄和/或翻譯胞嘧啶DNA甲基轉移酶相關的核酸。因此，在一些實施方案中，胞嘧啶DNA甲基轉移酶可以在植物的雄性配子體細胞中進行表達，并且來自這樣的植物的花粉可以用于產生具有增加的種子重量的種子。在其它的實施方案中，內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的轉錄或翻譯在植物的雄性配子體細胞中被抑制，來自這樣的植物的花粉可以用于產生種子重量減少的種子。
在其它的實施方案中，胞嘧啶DNA甲基轉移酶可以在植物的雌性配子體細胞中進行表達，并且在授粉后，可以形成種子重量減少的種子。在其它的實施方案中，內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的轉錄或翻譯在植物的雌性配子體細胞中被抑制，并且在授粉后，可以形成種子重量增加的種子。
通過在雄性配子體細胞中的過量表達或在雌性配子體細胞中的表達不足來調節種子的表型在雄性配子體細胞中的過量表達在第一個方面，本發明包括容許第一植物給第二植物授粉由此在第二植物上產生種子。該第一植物包含重組核酸構建體，其包括編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽的核酸，所述核酸可操作地與一個或多個調節元件連接，所述調節元件在雄性配子體細胞或組織中賦予表達。通過在特異性雄性配子體細胞類型中表達甲基轉移酶多肽，可能的是在第一植物中調節基因表達(例如，通過使在正常情況下具有轉錄活性的基因失活)和當第一植物用于給第二植物授粉時獲得一種或多種有益的種子表型。
適合于用在本發明中的胞嘧啶DNA甲基轉移酶可以通過評價甲基轉移酶的基因中的失去功能型的突變體的表型進行特征鑒定。這些突變體顯示在配子體組織中的胞嘧啶殘基的總體甲基化不足。此外，盡管重復序列的甲基化不足可以更適中，這些突變體顯示在基因組的單拷貝和重復序列中的總體胞嘧啶甲基化的減少。這些突變體的存在指示野生型負體(counterpart)是適合于用在本文所述的方法和組合物中的胞嘧啶DNA甲基轉移酶。
許多胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽適合于用在本文所述的方法中。一個這樣的多肽是由擬南芥Met1基因編碼的多肽。編碼擬南芥Met1 DNA胞嘧啶甲基轉移酶的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO29中。擬南芥MET1的Genbank接受號是AT5G49160。此外，具有顯示在SEQ ID NO44中的氨基酸序列的玉米胞嘧啶DNA甲基轉移酶，和具有顯示在SEQ ID NO46中的氨基酸序列的水稻胞嘧啶DNA甲基轉移酶也是有用的。
生物表

可以以多種方式來鑒定其它適合的胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽。例如，可以通過從純性幼苗中制備核提取物并用半甲基化的(CpI)n底物和放射性標記的S-腺苷-甲硫氨酸溫育來自抽提物的溶解的蛋白來篩選候選甲基轉移酶以鑒定具有胞嘧啶DNA甲基轉移酶活性的多肽。見，例如，Kakutani等，Nucleic Acids Res.9312406-12411(1995)。可以通過用TaqI消化總基因組DNA并用放射性標記消化物中的5′末端胞嘧啶來測量基因組中的總胞嘧啶甲基化水平。接著，將標記的DNA消化成單核苷酸并使用薄層色譜法來估計甲基化和未甲基化胞嘧啶的量。見，例如Kakutani，等.，Nucleic Acids Res.9312406-12411(1995)。可以從在被HpaII或MspI消化的基因組DNA的DNA印跡中觀察到的消化圖譜來估計單拷貝和重復序列的甲基化。見，Jeddeloh等，Plant J.9579-586(1996)和Finnegan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938449-8454(1996)。適合的胞嘧啶DNA甲基轉移酶具有相應的失去功能的突變體，其顯示在配子體組織中的胞嘧啶殘基的總的甲基化不足，在基因組的單拷貝序列中的總胞嘧啶甲基化中的減少，和重復序列的更適中的甲基化不足。針對已知甲基轉移酶的抗體的共免疫沉淀測定也可以用于鑒定候選多肽。鑒定候選多肽的另一種方式是通過甲基轉移酶突變體的功能性互補。
還可以通過分析核苷酸和多肽序列的對比來鑒定適合的甲基轉移酶的候選物。例如，進行在核苷酸或多肽序列的數據庫上的查詢可以鑒定胞嘧啶DNA甲基轉移酶的直向同源物。序列分析可以包括使用已知甲基轉移酶氨基酸序列的非豐余數據庫的BLAST或PSI-BLAST分析。在具有大于40％序列同一性的數據庫中的那些蛋白質是用于進一步評價作為甲基轉移酶的適合性的候選物。如果需要，可以進行對這些候選物的人工檢查從而縮小待進一步評價的候選物的數量。可以通過選擇似乎具有被懷疑出現在甲基轉移酶中的結構域的那些候選物來進行人工檢查。適合的候選物包括SEQ ID NOS42和48。
可以如下確定相對于另一個“靶”核酸或氨基酸序列的任何主題核酸或氨基酸序列(例如，擬南芥胞嘧啶DNA甲基轉移酶，或玉米胞嘧啶DNA甲基轉移酶)的百分比同一性。首先，可以使用來自包含BLASTN和BLASTP的BLASTZ的卓越版(例如，2.0.14版)中的BLAST2序列(B12seq)程序來對主題核酸或氨基酸序列進行比較和對比。可以在<www.fr.com/blast>或www.ncbi.nlm.nih.Gov獲得BLASTZ的卓越版。解釋怎樣使用BLASTZ，和具體地B12seq程序的指導可以見于BLASTZ隨附的“自述文件”。該程序還可以在Karlin等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.872264；Karlin等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.905873；和Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.253389中進行詳細描述。
使用BLASTN(用于比較核酸序列)或BLASTP(用于比較氨基酸序列)的算法的任一，B12seq進行在主題序列和靶序列之間的比較。典型地，當進行氨基酸序列的對比時，使用BLOSUM62計分矩陣(scoring matrix)的缺省參數，11的缺口存在罰分(gap existence cost)，和1的延伸罰分(extensioncost)，3的字長(word size)，10的預期值(expect value)，1的每個殘基罰分和0.85的λ比率。輸出文件包括在靶序列和主題序列之間的同源性對比區域。一旦進行對比，通過計算來自靶序列的連續的核苷酸或氨基酸殘基的數量(即，排除缺口)來確定長度，所述靶序列與主題序列的對比開始自任意匹配的位點并結束在任何其它的匹配位點。匹配的位點是其中相同的核苷酸或氨基酸殘基出現在靶序列和主題序列兩者中的任一位點。可以將一個或多個殘基的缺口插入靶序列或主題序列從而使在結構保守的結構域之間的序列比對最大化(例如，α-螺旋，β-折疊和環)。
通過計算在特定長度內的匹配位點的數目，將該數目除以長度，并將得到的值乘以100來確定特定長度內的百分比同一性。例如，如果(i)將500個氨基酸靶序列與主題氨基酸序列進行比較，(ii)B12seq程序呈現來自與主題序列的區域對比的靶序列的200個氨基酸，其中該200個氨基酸區域的第一和最后一個氨基酸是匹配的，和(iii)在那些200個對比氨基酸中匹配的數目是180，那么該500個氨基酸的靶序列包含200的長度和在該長度內的90％的序列同一性(即，180÷200×100＝90)。在一些實施方案中，適合的胞嘧啶DNA甲基轉移酶的氨基酸序列與擬南芥Met1胞嘧啶DNA甲基轉移酶的氨基酸序列具有大于40％(例如，＞80％，＞70％，＞60％，＞50％或＞40％)的序列同一性。在其它的實施方案中，適合的胞嘧啶DNA甲基轉移酶的氨基酸序列與在SEQ ID NO44中顯示的玉米胞嘧啶DNA甲基轉移酶或在SEQ ID NO46中顯示的水稻胞嘧啶DNA甲基轉移酶的氨基酸序列具有大于40％的序列同一性(例如，＞80％，＞70％，＞60％，＞50％或＞40％)。在其它的實施方案中，適合的胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽的氨基酸序列具有1500-1600個氨基酸的總長度(例如，1520-1565，1522-1564，1522，1525，1534，1545，1554，1559，1564，或1566；多肽的區域的長度在350-390個氨基酸(例如，350-375，350-380，360-380，370-375，或365-375或372)，并且與在SEQ ID NO50中提出的氨基酸序列具有大于40％的序列同一性(例如，＞80％，＞70％，＞60％，＞50％或＞40％)。
將理解的是與主題序列對比的核酸或氨基酸靶序列可以導致許多不同的長度，其中每個長度具有其本身的百分比同一性。還將理解的是適合的核酸的長度可以取決于意欲的用途，例如作為全長編碼序列，作為反義序列，或RNAi序列。注意的是，可以將百分比同一性值四舍五入為最接近的十分之一。例如將78.11，78.12，78.13，和78.14四舍五入為78.1，而將78.15，78.16，78.17，78.18，和78.19四舍五入為78.2。還要注意的是長度值將總是整數。
在模板，或主題物，多肽中的保守區域的鑒定可以促進同源性多肽序列分析。可以通過將區域定位于模板多肽的原始氨基酸序列來鑒定保守區域，其是重復序列，形成一些次級結構(例如，螺旋和β折疊)，建立帶正電荷或負電荷的結構域，或代表蛋白質基序或結構域。見，例如，描述多種蛋白質基序和結構域的共有序列的Pfam網點在http://www.sanger.ac.uk/Pfam/和http://genome.wustl.edu/Pfam/。被包括在Pfam數據庫的信息的描述見于Sonnhammer等，1998，Nucl.Acids Res.26320-322；Sonnhammer等，1997，Proteins 28405-420；和Bateman等，1999，Nucl.Acids Res.27260-262。從該Pfam數據庫，蛋白質基序和結構域的共有序列可以與模板多肽序列進行對比從而確定保守區域。
還可以通過對比來自緊密相關的植物種類的相同的或相關多肽的序列來確定保守區域。緊密相關的植物種類優選地來自相同的家族。或者，使用來自都是單子葉植物或都是雙子葉植物的植物種類的序列來進行對比。在一些實施方案中，來自兩種不同的植物種類的序列的對比是足夠的。例如，可以將來自油菜(canola)和擬南芥的序列用于鑒定一個或多個保守區域。
典型地，顯示至少約35％的氨基酸序列同一性的多肽對于鑒定保守的區域是有用的。相關蛋白質的保守區域有時顯示至少40％的氨基酸序列同一性(例如，至少50％，至少60％；或至少70％，至少80％，或至少90％的氨基酸序列同一性)。在一些實施方案中，靶多肽和模板多肽的保守區域顯示至少92，94，96，98，或99％的氨基酸序列同一性。氨基酸序列同一性可以從氨基酸和核苷酸序列中進行推斷。
技術人員將認識到在編碼序列中改變，添加，或缺失單個氨基酸或小百分比的氨基酸的對多肽的單個置換，缺失或添加是“保守修飾的變體”，其中所述改變導致了以化學上類似的氨基酸對氨基酸的置換。提供功能上類似的氨基酸的保守性置換表是本領域眾所周知的。下面的6個基團每個都包含彼此進行保守性置換的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
(見，例如，Creighton，Proteins(1984))。
用于適合的胞嘧啶甲基轉移酶的區域的共有序列顯示于序列表中。將某些符號用在共有序列中從而代表在某些氨基酸殘基上的適合的置換并且從而表示在某些位點上的可接受的長度改變+＝″帶正電荷的″例如，H，K，Ra＝″脂族的″例如I，L，V，Mt＝″小的″例如T，G，Ar＝″芳香族的″例如F，Y，Wn＝″帶負電荷的″例如E，Dp＝″極性的″例如N，Q<#-#>＝氨基酸的專用#，任意類型(X，Y)＝一個氨基酸殘基，X或Y在某些情形中，適合的甲基轉移酶可以在多肽的共有功能結構域和/或保守區域的基礎上進行合成，所述多肽是同源的甲基轉移酶。可以通過如上所述的同源性多肽序列分析來鑒定共有結構域和保守區域。用作胞嘧啶DNA甲基轉移酶的這些合成性多肽的適宜性可以在基于它們對基因組甲基化狀態作用的基礎上，或通過在序列表中顯示的玉米，水稻，或擬南芥胞嘧啶DNA甲基轉移酶的功能性互補來進行評價。
結構域是在多肽中連續的氨基酸的類群，其可以用于鑒定蛋白質家族和/或蛋白質的部分。這些結構域具有“指紋圖譜”或“特征”，其可以包含保守的(1)一級序列，(2)次級結構，和/或(3)三維構象。通常，每個結構域都與保守的一級序列或序列基序相關。通常，這些保守的一級序列基序與特異性的體外和/或體內的活性相關。結構域可以是任何長度，包括完整的待轉錄的多核苷酸。可以用于鑒定直向同源的胞嘧啶DNA甲基轉移酶的結構域的實例包括，而不限于，甲基轉移酶活性結構域，“真核生物”結構域，TS結構域，BAH結構域，富半胱氨酸的結構域，GK重復結構域，和PC重復結構域。見，圖2。
在第一植物中的重組核酸構建體包含一個或多個與編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶的序列可操作連接的調節元件。調節元件可以包括啟動子序列，增強子序列，應答元件，蛋白質識別位點，調節核酸序列表達的可誘導元件，啟動子控制元件，蛋白質結合序列，5′和3′UTRs，轉錄起始位點，終止序列，聚腺苷酸化序列，在氨基酸編碼序列諸如分泌信號中的內含子和某些序列，和蛋白酶裂解位點。用于本文時，“可操作的連接”指以關于容許或促進核酸轉錄和/或翻譯的這樣的方式來相對于核酸將調節元件定位于構建體中。將被包括的元件的選擇取決于一些因素，包括，但不限于，復制效率，選擇性，可誘導性，需要的表達水平，和細胞或組織特異性。
典型地，啟動子位于待轉錄的序列的5′，和鄰近該序列的轉錄起始位點的位置。啟動子在編碼序列的第一外顯子的上游和多個轉錄起始位點的第一個的上游。在某些實施方案中，將啟動子位于編碼序列的第一外顯子的ATG上游約3,000個核苷酸的位置。在其它實施方案中，啟動子位于多個轉錄起始位點的第一個的上游約2,000個核苷酸處。本發明的啟動子包括下面定義的至少一個核心啟動子。此外，啟動子還可以包括至少一個控制元件諸如上游元件。這些元件包括UTRs和任選地，其它的影響多核苷酸轉錄的DNA序列諸如合成的上游元件。
5′未翻譯的區域(UTR)被轉錄，但是未被翻譯，并且位于轉錄物的起始位點和翻譯起始密碼子之間并且包括+1核苷酸。3′UTR可以位于在翻譯終止密碼子和轉錄物末端之間的地方。UTRs可以具有特定的功能諸如增加的mRNA信息穩定性或翻譯弱化作用。3′UTRs的實例包括，但不限于，聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列。
在這些實施方案中，可以使用在雄性配子體細胞中優先驅動轉錄的調節元件，所述細胞例如小孢子母細胞，或小孢子，包括營養細胞和在營養細胞中的分裂和形成精子細胞的細胞。然而，優選的是在成熟的花粉核中沒有觀察到轉錄。此外，在授精后在胚胎或胚乳中來自調節元件的轉錄不是理想的。因此，優選在授精后快速減少在胚乳組織中的轉錄。適合的雄性生殖組織特異性啟動子是擬南芥YP0180啟動子(SEQ ID NO8)。
細胞類型或組織特異型啟動子有時被觀察到驅動除靶組織之外的組織中的可操作連接的序列的表達。因此，用于本文時，細胞類型或組織特異型啟動子是在靶組織中驅動優先表達的啟動子，但是還可以導致在其它細胞類型或組織中的一些表達。鑒定和表征植物基因組DNA中的調節元件的方法包括，例如，在下面的參考文獻中描述的那些Jordano，等，PlantCell，1855-866(1989)；Bustos，等，Plant Cell，1839-854(1989)；Green，等，EMBO J.，74035-4044(1988)；Meier，等，Plant Cell，3309-316(1991)；和Zhang，等，Plant Physio.，1101069-1079(1996)。
在雌性配子體細胞中的表達不足在另一個方面，本發明提供通過在雌性配子發生過程中減少基因組胞嘧啶甲基化的程度來調節植物中的種子表型的方法。在該方面，在雜交中被用作雌性的植物包含核酸構建體，所述核酸構建體包含雌性配子體組織特異性調節元件，所述調節元件與有效減少總體胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作地連接。用缺乏核酸序列的花粉對植物進行授粉，并且在該植物上形成的種子具有的平均種子重量與在相應的植物上形成的種子的平均種子重量比較，重量增加，所述相應的植物缺乏所述核酸序列。
在該方面，重組核酸構建體可以結合抑制或阻止內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的轉錄和/或翻譯的序列。例如，可以使用反義序列。適合的反義序列包括反義核酸，所述反義核酸覆蓋編碼擬南芥Met1的氨基酸764到1535的基因的部分，或編碼氨基酸644到1535的基因的部分，或編碼氨基酸485到1535的基因的部分。這些反義核酸分別是約2.3kb，2.7kb，和3.2kb。
此外，在某種意義上，包含內源基因的整個或部分拷貝的構建體可以導致內源基因表達的抑制。因此，所述構建體可以結合編碼已經出現在植物中的甲基轉移酶的基因的另外的拷貝，或部分拷貝，即，具有與內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的有義編碼序列相似或相同的序列的DNA，但是所述DNA被轉錄成未被多腺苷酸化的mRNA，缺乏5′帽結構，或包含不可剪接的內含子。在另一個備選中，該構建體可以結合編碼核酶的序列。
在另一個備選中，該構建體可以包括被轉錄成干擾RNA的序列。見，例如，美國專利6,753,139；美國專利出版物20040053876；和美國專利出版物20030175783。這樣的RNA可以是與另一個RNA退火以形成干擾RNA的RNA。這樣的RNA還可以是可以與其本身退火的RNA，例如，具有莖-環結構的雙鏈RNA。雙鏈RNA的莖部分的一條鏈包括與內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的有義編碼序列相似或相同的序列，并且該序列的長度是約10個核苷酸到約4,500個核苷酸。在一些實施方案中，莖部分與編碼序列的5′UTR序列相似或相同。在一些實施方案中，莖部分與編碼序列的3′UTR序列相似或相同。與有義編碼序列，5′UTR，或3′UTR相似或相同的該序列的長度是10個核苷酸到500個核苷酸，15個核苷酸到300個核苷酸，20個核苷酸到100個核苷酸，或25個核苷酸到100個核苷酸。在一些實施方案中，與有義編碼序列，5′UTR或3′UTR相似或相同的序列的長度可以是25個核苷酸到500個核苷酸，25個核苷酸到300個核苷酸，25個核苷酸到1,000個核苷酸，100個核苷酸到2,000個核苷酸，300個核苷酸到2,500個核苷酸，200個核苷酸到500個核苷酸，1,000個核苷酸到3,000個核苷酸，或200個核苷酸到1,000個核苷酸。雙鏈RNA的莖部分的另一條鏈包括內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的反義序列，可以具有與相應的莖部分的互補鏈的長度相比，更短，相同或更長的長度。雙鏈RNA的環部分可以是10個核苷酸到5,000個核苷酸，例如15個核苷酸到1,000個核苷酸，20個核苷酸到500個核苷酸，或25個核苷酸到200個核苷酸。RNA的環部分可以包括內含子。見，例如WO 99/53050。
為了獲得雌性配子體特異性表達，使用在雌性配子體組織中優先驅動轉錄的調節元件，諸如胚囊啟動子。大多數適合的調節元件是在極核或中央細胞，或在極核的前體中，但是不在卵細胞或卵細胞的前體中優先驅動轉錄的調節元件。其轉錄模式從極核延伸到早期胚乳組織發育的調節元件也是可接受的，盡管最優選在授精后快速減少在胚乳組織中轉錄的調節元件。不優選在合子中或發育中的胚胎中的表達。
可以是適合的雌性生殖組織啟動子包括來自下列基因的那些玉米MAC1(見，Sheridan(1996)Genetics，1421009-1020)；玉米Cat3(見，GenBank號L05934；Abler(1993)Plant Mol.Biol.，2210131-1038)；擬南芥viviparous-1(見，Genbank號U93215)；擬南芥atmycl(見，Urao(1996)PlantMol.Biol.，32571-57；Conceicao(1994)Plant，5493-505)。
其它的雌性配子體組織啟動子包括來自下列基因的那些擬南芥Fie(GenBank號AF129516)；擬南芥Mea；和擬南芥Fis2(GenBank號AF096096)；胚珠BEL1(Reiser(1995)Cell，83735-742；Ray(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，915761-5765；GenBank號U39944)；和擬南芥DMC1(見，GenBank號U76670)。
示范性的雌性配子體組織特異性啟動子包括下列擬南芥啟動子YP0039(SEQ ID NO10)，YP0101(SEQ ID NO11)，YP0102(SEQ ID NO6)，YP0110(SEQ ID NO9)，YP0117(SEQ ID NO7)，YP0119(SEQ ID NO12)，YP0137(SEQ ID NO13)，DME啟動子(SEQ ID NO15)，YP0285(SEQ ID NO22)和YP0212(SEQ ID NO14).
可以用在單子葉植物，諸如水稻中的啟動子包括下列啟動子Y678g10p3(SEQ ID NO20)，p756a09p3(SEQ ID NO21)，Y790g04p3(SEQ ID NO23)，p780a10p3(SEQ ID NO24)，Y730e07p3(SEQ ID NO26)，Y760g09p3(SEQ ID NO27)，p530c10p3(SEQ ID NO19)，p524d05p3，(SEQ ID NO18)p523d11p3(SEQ ID NO17)和p472e10p3(SEQ ID NO16)。
種子表型顯示如上所述的被調節的基因表達的生物可以在授粉后用于產生種子。這些種子相對于缺乏或不表達甲基轉移酶多肽的生物而言，可以具有表型改變。例如，這些被調節的基因表達可以改變下列種子表型中的一種或多種種子產量，種子組成，胚乳發育，胚胎發育，子葉發育，種子大小，種子發育時間，幼苗生長速率，或種子能育性。典型地，在成熟的種子上，以干重基礎來測量表型諸如種子產量，種子組成，種子大小和種子重量。
當來自顯示這樣的表達的植物的花粉被用作雜交中的傳粉者時，在雄性配子體細胞類型中的胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽的表達可以導致平均種子重量增加約10％到約50％，例如，約10％到約40％，或約10％到約30％，或約10％或約20％，或約15％到約30％，或約15％到約25％。類似地，當內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽的表達在雌性配子體細胞類型中被抑制，并且這樣的植物在雜交中被用作雌性時，觀察到約相同量級的平均種子重量的增加。
典型地，認為植物相對于相應的對照植物的表型諸如種子重量的差異在p≤0.05時具有統計學上的意義，其中進行了適當的參數或非參數統計，例如卡方檢驗，student’s t檢驗，Mann-Whitney檢驗，或F檢驗。在一些實施方案中，在p＜0.01，p＜0.005，或p＜0.001時，差異才具有統計學意義。例如，在來自轉基因測試植物的種子的種子重量與來自非轉基因對照植物的種子的種子重量比較的統計學上的顯著差異顯示在該測試植物中存在的重組核酸改變了種子重量。
將理解的是，在雜交中的親本都具有胞嘧啶DNA甲基轉移酶的被調節的表達，并且由此獲得了與其中僅有一個親本植物具有被調節的甲基轉移酶表達的雜交相比，種子表型更大的改變。因此，首先，傳粉者植物可以在雄性配子體細胞中顯示胞嘧啶DNA甲基轉移酶的過量表達。第二，具種子的植物可以具有在雌性配子體細胞中被抑制的內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的轉錄或翻譯。在由第一植物授粉后，在第二植物上形成的種子具有與相應的第一和第二植物相比，增加的種子重量，所述相應的第一和第二植物分別不顯示胞嘧啶DNA甲基轉移酶的過量表達或抑制。這些種子的實例是雌性玉米植物與雄性玉米植物雜交的后代，所述雌性玉米植物含有重組核酸構建體，所述構建體包括與胞嘧啶DNA甲基轉移酶序列可操作連接的YP0102a啟動子，其通過RNAi機制減少甲基轉移酶的活性的量，所述雄性玉米植物包含重組核酸構建體，所述構建體包括與全長的胞嘧啶DNA甲基轉移酶編碼序列可操作連接的雄性配子體啟動子，其導致甲基轉移酶的過量表達。
通過在雄性配子體細胞中表達不足或在雌性配子體細胞中的過量表達來調節種子表型在雄性配子體細胞中的表達不足在另一個方面中，本發明提供用于產生植物種子的方法，所述植物種子具有一種或多種改變的種子表型。所述方法包括容許第一植物給第二植物授粉的步驟。第一植物包含重組核酸構建體，所述重組構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的一個或多個雄性配子體組織特異性調節元件。在授粉后，在第二植物上發育的種子具有的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量減少，所述相應的植物由缺乏該核酸序列的植物授粉。本文描述了適合的雄性配子體細胞特異性調節元件。本文還描述了有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸，并且該核酸包括反義序列，干擾RNA序列和核酶序列。
在雌性配子體細胞中的過量表達在另一個方面，用于產生種子的方法可以包括容許包含重組核酸構建體的植物的授粉，所述核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件。用于授粉的花粉缺乏這樣的核酸序列。在這樣的植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量減少，所述相應的植物缺乏或不表達該核酸序列。本文描述了適合的雌性配子體細胞特異性調節元件。本文還描述了有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸，并且該核酸包括本文所述的胞嘧啶DNA甲基轉移酶的編碼序列。
種子表型顯示如上所述的被調節的基因表達的生物可以在授粉后用于產生種子。這些種子相對于缺乏或不表達甲基轉移酶多肽的生物而言，可以具有表型改變。例如，這些被調節的基因表達可以改變下列種子表型中的一種或多種種子產量，種子組成，胚乳發育，胚胎發育，子葉發育，種子大小，種子發育時間，或種子能育性。典型地，在成熟的種子上，以干重基礎來測量表型諸如種子產量，種子組成，種子大小和種子重量。
當來自顯示這樣的表達的植物的花粉被用作雜交中的傳粉者時，在雄性配子體細胞類型中的內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽的表達的抑制可以導致平均種子重量減少約10％到約50％，例如，約10％到約40％，或約10％到約30％，或約10％或約20％，或約15％到約30％，或約15％到約25％。類似地，當胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽在雌性配子體細胞類型中進行表達，并且這樣的植物在雜交中被用作雌性時，觀察到約相同量級的平均種子重量的減少。
典型地，認為植物相對于相應的對照植物的表型諸如種子重量的差異在p≤0.05時具有統計學意義，其中進行了適當的參數或非參數統計，例如卡方檢驗，student’s t檢驗，Mann-Whitney檢驗，或F檢驗。在一些實施方案中，在p＜0.01，p＜0.005，或p＜0.001時，差異才具有統計學意義。例如，在來自轉基因測試植物的種子的種子重量與來自非轉基因對照植物的種子的種子重量比較的統計學上的顯著差異顯示在該測試植物中存在的重組核酸改變了種子重量。
將理解的是，在雜交中的親本都具有胞嘧啶DNA甲基轉移酶的被調節的表達，并且由此獲得了與其中僅有一個親本植物具有被調節的甲基轉移酶表達的雜交相比，種子表型更大的改變。因此，首先，傳粉者植物可以在雄性配子體細胞中抑制內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的轉錄或翻譯。第二，具有種子的植物可以在雌性配子體細胞中表達胞嘧啶DNA甲基轉移酶。在由第一植物授粉后，在第二植物上形成的種子具有與相應的第一和第二植物相比，減少的種子重量，所述相應的第一和第二植物分別不顯示胞嘧啶DNA甲基轉移酶的抑制或過量表達。
編碼甲基轉移酶的核酸本發明還包括編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽的核酸，與胞嘧啶DNA甲基轉移酶具有同源性的核酸，例如胞嘧啶DNA甲基轉移酶的反義序列，胞嘧啶DNA甲基轉移酶的核酶序列或胞嘧啶DNA甲基轉移酶的干擾RNA序列。用于本文時，核酸指RNA或DNA，包括cDNA，合成DNA或基因組DNA。該核酸可以是單或雙鏈，并且如果是單鏈，可以是編碼或非編碼鏈的任一。關于核酸用于本文時，“分離的”指(i)編碼本發明的多肽的部分或全部的天然存在的核酸，但是其不包含這樣的序列，即在正常情況下位于基因組中的編碼多肽的核酸的一側或兩側的側面的編碼序列；(ii)結合到載體中或結合到生物的基因組DNA中的核酸從而使得到的分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不相同；或(iii)cDNA，基因組核酸片段，由聚合酶鏈式反應(PCR)產生的片段，或限制性酶切片段。具體而言，被排除于該定義的是存在于核酸分子或細胞的混合物中的核酸。
適合的核酸的實例包括在序列表中顯示的編碼鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)，稻(Oryza sativa)，玉米(Zea mays)胞嘧啶-5DNA甲基轉移酶的核酸。在Genbank接受號AF063403和AC093713中描述了示范性核酸。然而，應該理解的是，本文公開的具有除了特定核苷酸序列之外的核苷酸序列的核酸仍舊可以編碼具有例示的氨基酸序列的多肽。遺傳密碼子的兼并性是本領域眾所周知的；即對于許多氨基酸而言，存在超過一種的作為氨基酸的密碼子的核苷酸三聯體。
重組核酸構建體可以包含除本文所述的其它序列的克隆載體序列。適合的克隆載體序列是可商購的，并且是普通技術人員常規使用的。本發明的核酸構建體還可以包含編碼其它多肽的序列。這些多肽可以，例如，促進將核酸構建體引入宿主生物或維持在其中。其它的多肽還可以影響被編碼的甲基轉移酶的表達，活性，或生化或生理作用。備選地，可以在單獨的核酸構建體上提供其它的多肽編碼序列。
可以通過例如，DNA合成或聚合物酶鏈式反應(PCR)來獲得編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶的核酸。PCR指一種方法或技術，其中對靶核酸進行擴增。PCR可以用于從DNA以及RNA中擴增特異性的序列，包括來自總基因組DNA的序列，或來自總細胞RNA的序列。例如，在PCR PrimerALaboratory Manual，Dieffenbach，C.& Dveksler，G，Eds.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1995描述了各種PCR方法。通常，來自目標區域或除此之外的區域的末端的序列信息用于設計寡核苷酸引物，所述引物與待擴增的模板的相對鏈的序列相同或相似。可獲得各種PCR策略，通過這些策略可以將位點特異性的核苷酸序列修飾引入模板核酸。
核酸的檢測可以通過方法諸如瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色，DNA或RNA印跡雜交，PCR或原位雜交來進行。雜交典型地包括DNA或RNA印跡法(見，例如，Sambrook等，1989，“Molecular Cloning，A LaboratoryManual”，第二版，Cold Spring Harbor Press，Plainview；NY的9.37-9.52部分)。探針應該在高嚴格條件下與核酸或其互補序列雜交。高嚴格條件可以包括，使用低離子強度和高溫度洗滌，例如在65℃的0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉(0.1X SSC)，0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)。此外，可以將變性劑，諸如甲酰胺在高嚴格雜交中進行使用，例如在42℃的50％甲酰胺與0.1％的牛血清白蛋白/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液與750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉。
真核生物術語“宿主”或“宿主細胞”不僅包括原核生物，諸如大腸桿菌(E.coli)，還包括真核生物，如真菌、昆蟲、植物和動物細胞。動物細胞包括，例如COS細胞和HeLa細胞。真菌細胞包括酵母細胞，如釀酒酵母(Saccharomyces cereviseae)細胞。可以利用本領域那些普通技術人員已知的技術，如磷酸鈣或醋酸鋰沉淀、電穿孔、脂轉染和微粒轟擊，用DNA分子(例如，載體)轉化或轉染宿主細胞。含有載體的宿主細胞可以用于這樣的目的如增殖載體，產生核酸(例如DNA或干擾RNA)或表達多肽或其片段。
植物本發明中描述的真核生物是含有本文所述重組核酸構建體的植物，所述核酸構建體例如可操作性連接到雄性配子體特異性調節元件或雌性配子體特異性調節元件上的胞嘧啶DNA甲基轉移酶編碼序列或干擾RNA序列。
在上述方法中用作親本的植物可以是對于重組構建體雜合或純合的。不過，當核酸構建體編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶多肽時，使用對于構建體純合的植物能夠導致種子表型的改變，其比當使用雜合植物時獲得的改變量級更大。另一方面，當所述核酸構建體編碼核酸諸如反義序列、干擾RNA序列，或核酶時，雜合的植物經常能夠導致種子表型的改變，其與用純合植物觀察到的改變一樣大。
在另一方面，本發明以處理植物的方法為特征，所述方法包括將重組核酸構建體引入植物細胞中。將外源核酸引入單子葉植物和雙子葉植物中的技術是本領域已知的，包括，而不限于，農桿菌介導的轉化、病毒性載體介導的轉化、電穿孔和基因槍轉化，例如，美國專利5,204,253和6,013,863。如果細胞或組織培養物被用作轉化的受體組織，可以通過本領域技術人員已知的技術由轉化的培養物再生出植物。可以將轉基因植物加入到培育程序中，例如，將編碼多肽的核酸導入其它品系中，將核酸轉移到其它物種中或用作進一步選擇其它的所需特性。或者，可以對適用于這些技術的那些物種進行無性繁殖。后代包括特定植物或植物品系的后代。本發明植物的后代包括在F1，F2，F3上形成的種子，以及在隨后世代的植物，或在BC1，BC2，BC3上形成的種子，以及在后世代的植物。由轉基因植物產生的種子可以生長并且隨后自交(或異型雜交和自交)以獲得對于重組核酸構建體純合的種子。
用來實施本發明的適合植物組包括雙子葉植物，諸如紅花，苜蓿，大豆，油菜籽(高芥子酸和油菜)，或向日葵。單子葉植物如玉米，小麥，黑麥，大麥，燕麥，水稻，粟(millet)，莧屬植物或高粱屬植物也是適合的。蔬菜作物或根作物如馬鈴薯，西瓜，椰菜，豌豆，甜玉米，爆裂種玉米(popcorn)，西紅柿，豆類(包括云豆，利馬豆，干豆，綠豆)等也是適合的。水果作物如桃、梨、蘋果、櫻桃、橙、檸檬、葡萄柚(grapefruit)、李子、芒果和棕櫚也是適合的。因而，本發明對于廣泛的植物具有用途，包括來自腰果屬(Anacardium)，落花生屬(Arachis)，天門冬屬(Asparagus)，顛茄屬(Atropa)，燕麥屬(Avena)，蕓苔屬(Brassica)，柑桔屬(Citrus)，西瓜屬(Citrullus)，辣椒屬(Capsicum)，紅藍花屬(Carthamus)，椰子屬(Cocos)，咖啡屬(Coffea)，香瓜屬(Cucumis)，南瓜屬(Cucurbita)，胡蘿卜屬(Daucus)，油棕屬(Elaeis)，花菱草屬(Eschscholzia)，草莓屬(Fragaria)，大豆屬(Glycine)，棉屬(Gossypium)，向日葵屬(Helianthus)，Heterocallis，大麥屬(Hordeum)，天仙子屬(Hyoscyamus)，萵苣屬(Lactuca)，亞麻屬(Linum)，黑麥草屬(Lolium)，羽扇豆屬(Lupins)，番茄屬(Lycopersicon)，蘋果屬(Malus)，木薯屬(Manihot)，Majorana，苜蓿屬(Medicago)，煙草屬(Nicotiana)，木犀欖屬(Olea)，稻屬(Oryza)，黍屬(Panicum)，Pannesetum，罌粟屬(Papaver)，鱷梨屬(Persea)，菜豆屬(Phaseolus)，松屬(Pinus)，Pistachia，豌豆屬(Pisum)，梨屬(Pyrus)，李屬(Prunus)，蘿卜屬(Raphanus)，蓖麻屬(Ricinus)，黑麥屬(Secale)，千里光屬(Senecio)，白芥屬(Sinapis)，茄屬(Solanum)，高粱屬(Sorghum)，Theobromus，胡盧巴屬(Trigonella)，小麥屬(Triticum)，野豌豆屬(Vicia)，葡萄屬(Vitis)，豇豆屬(Vigna)和玉蜀黍屬(Zea)的物種。在液體培養基或在半固體培養基上培養的細胞和組織也是適合的。
改變植物種子表型，例如，增加或減小種子重量的能力，能夠向農業生產者和向消費者提供利益。例如，平均種子重量的提高能夠導致來自收獲農作物的總體產量或收獲指標提高，由此向農民提供經濟利益。而且，平均種子重量的提高能夠導致每平方英畝特殊種子成分(specialty seedcomponent)的更大收獲，由此提供更大的田地使用效率。例示性的特殊種子成分包括藥物，生物堿，類萜，抗體，特殊的淀粉，特殊的油，特殊的蛋白質，和營養藥(nutraceuticals)諸如甾醇。相反地，使用本文公開的方法實現平均種子重量的減少能夠導致水果或蔬菜作物由于較小的種子而被消費者優先選擇。
種子組合物在另一方面，本發明以一種植物種子組合物為特征，其包含至少兩種類型的種子。所述兩種類型可以是種群(例如，人造的種群)，品系，近交系，雜種，或商業變種。人造的種群是這樣一組個體植物，其成員是多親本交配方案的后代，從而使得所述組作為一個整體代表了所有親本的等位基因頻率。見，例如，美國專利6,320,106。在組合物中每種類型的比例被測量為特定類型種子數除以組合物中種子總數，并且根據需要可以進行配制以符合基于地理位置、所需成熟度等的需求。第一類型的比例可以從大約80％到約99.9％，例如，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％。第二類型的比例可以從大約0.1％到大約20％，例如，0.5％，1％，2％，3％，4％，或5％。如果第三類型存在于組合物中，第三類型的比例可以從約0.1％到約5％，例如，0.5％，1％，2％，3％，4％，或5％。當配制大量的種子組合物時，或當對相同組合物進行重復配制時，樣品中每種類型的比例可能有一些變化。取樣誤差是統計學上已知的。在本發明中，這些取樣誤差一般為預測比例的約±5％，例如，90％±4.5％，或5％±0.25％。能夠以大約35千克(kg)或更多，大約100kg或更多，大約1,000kg或更多，大約10,000kg或更多，或大約50,000kg或更多的量配制種子組合物。在一些實施方案中，植物種子組合物還包含其它類型，例如，大約0.1到大約5％的第三類型的種子。
由第一類型的種子生長的植物能夠在雄性配子體細胞中過量表達胞嘧啶DNA甲基轉移酶。由第二類型的種子生長的植物可以或不可以具有一種重組核酸構建體，其在雌性配子體細胞中抑制胞嘧啶DNA甲基轉移酶的表達。
例如，本發明的種子組合物可以由兩種玉米雜種制得。第一玉米雜種可以構成組合物中90％的種子并且具有構建體，所述構建體包含可操作地連接到有效減少總胞嘧啶DNA甲基化作用水平的核酸序列上的雌性配子體組織特異性調節元件。如果需要，所述第一玉米雜種可以是雄性不育的。第二玉米雜種可以構成組合物中10％的種子并且具有在雄性配子體組織中表達胞嘧啶DNA甲基轉移酶的構建體。或者，兩種雜種的其中之一不包含本文所述的核酸構建體。在培養了這些組合物的其中之一后，來自第二雜種的花粉將對第一雜種的穗進行授粉，導致對于組合物的所有植物的收獲的作物種子重量提高。制備和培養兩種種子類型的其它技術在U.S.5,004,864中進行了描述并且對本文所述的方法可以采用這些技術及其改進。還見，U.S.5,706,603。
一般，通過本領域已知的方法將每種類型的種子的基本上均一的混合物在包裝材料中進行保存和包裝以形成一項制品。這種種子袋優選地具有包裝標記附于袋上，例如，系在包裝材料上的標簽或標記，印在包裝材料上的標記或插入袋中的標記。所述包裝標記表明其中的種子是多種類型，例如，兩種不同類型的混合物。所述包裝標記可以表明生長自這些種子的植物相對于相應的對照植物產生具有提高的種子重量的收獲作物。
在本發明種子組合物中的類型一般具有相同或非常相似的成熟度，即，相同或非常相似的從萌發到作物種子成熟的天數。然而，在一些實施方案中，本發明的種子組合物中的一種或多種類型與組合物中的其它類型相比可以具有不同的相對成熟度，即，組合物中一種類型的從萌發到成熟種子的天數與組合物中另一種類型的天數在統計學上顯著不同。
在下列實施例中對本發明作進一步描述，所述實施例并不限制本發明的范圍。
實施例實施例1反義擬南芥甲基轉移酶構建體基于
圖1中所示的擬南芥基因組DNA序列的下劃線部分，制備擬南芥Met1胞嘧啶DNA甲基轉移酶基因組序列的反義核酸。所述反義核酸的長度為大約2.7kb；其序列顯示于序列表中。
利用包含左和右農桿菌T-DNA邊界的載體制成Met1反義核酸構建體。將2.7kb Met1反義片段可操作地連接到來自FIE的啟動子，其優先驅動在胚囊發育期間于雌性配子體組織中的轉錄，并且插在T-DNA邊界之間。所述啟動子的序列顯示于SEQ ID NO5中。還見，美國專利出版物20030126642。所述啟動子促進極核，中央細胞和胚乳發育早期部分中的表達，但不驅動卵細胞、合子或雄性配子體組織中可檢測的表達。所述反義片段還可操作性地連接到nos 3′末端序列。命名為pRP:Met1 a/s的構建體，也在左和右T-DNA邊界之間包含一條可選擇的標記基因。
實施例2含有擬南芥甲基轉移酶反義構建體的轉基因植物分析下列符號被用在實施例中除非另外指定T1第一代轉化體；T2第二代，自花授粉的T1植物的后代，T3第三代，自花授粉的T2植物的后代；T4第四代，自花授粉的T3植物的后代。
通過基本上如在Bechtold，N.等，C.R.Acad.Sci.Paris，3161194-1199(1993)中所述的植物浸漬法將實施例1的pRP:Met 1a/s反義構建體引入Arabidopsis Columbia中。回收了二十三種獨立的轉化體。將T1種子萌發并讓其自花授粉。在14種轉化體中，T2種子的大小是野生型的，在一些或許多長角果中具有敗育的胚珠。在這14種轉化體中的一種中，一些T2種子是白色的。
在9種轉化體中，T2種子的大小可以是野生型的，也可以更大。一些長角果具有敗育的種子。將來自這9種轉化體每一種的T2種子的樣品萌發并通過PCR分析來分析pRP:Met 1a/s構建體的存在。所述9種轉化體中的八種被發現以預期的3∶1比例對于pRP∶Met 1a/s構建體發生分離，表示構建體插入在單一位置上。將單一位置轉化體培養到成熟并讓其自花授粉。對來自所述8種轉化體每一種的200T3種子的三個重復樣品進行稱重。所述8種轉化體的5種的平均T3種子重量高于野生型Columbia植物的平均種子重量。
將來自所述8種單一位點轉化體的T3種子萌發并讓得到的植物進行自花授粉。測量T3植物上的長角果并收集和測量成熟T4種子。源自T2植物#23和T1轉化事件#34的十種純合T3植物的結果，以及源自T2植物#20和T1轉化事件#34的五種純合T3植物的結果顯示于表1中。
源自T2植物#23和T1轉化事件#32的十種純合T3植物的結果，以及源自T2植物#13和T1轉化事件#32的五種純合T3植物的結果顯示于表2中。
表1來自事件#34的兩種T3純合子的T4種子的分析


表2來自事件#32的兩種T3純合子的T4種子的分析

結果顯示對于事件#34的后代來說，T4世代種子中的平均種子重量分別提高了15.1％和16.9％。結果顯示對于事件#32的后代來說，T4世代種子中的平均種子重量分別提高了15.8％和18.1％。
實施例3擬南芥甲基轉移酶有義構建體構建含有全長擬南芥Met1甲基轉移酶編碼序列的核酸。所述核酸長度為大約4.5kb。通過在有義方向將4.5kb Met1核酸可操作地連接到啟動子上而形成Met1有義核酸構建體，所述啟動子優先在胚囊發育期間于雌性配子體組織中驅動轉錄。所述啟動子促進極核，中央細胞和胚乳發育早期部分中的表達，但不驅動卵細胞、合子或雄性配子體組織中可檢測的表達。所述啟動子還在胚乳發育的早期部分中驅動表達。所述有義構建體被命名為pRP:Met1s。
實施例4包含擬南芥甲基轉移酶有義構建體的轉基因植物的分析通過基本上如在Bechtold，N.等，C.R.Acad.Sci.Paris，3161194-1199(1993)中所述的植物浸漬法將實施例3的pRP:Met1s構建體引入擬南芥Wassilewskija(WS)中。回收了十一種獨立的轉化體。培養T1轉化體并讓其自花授粉。三種所述轉化體產生了T2長角果，其具有野生型種子、小種子和一些敗育的胚珠。將來自事件#1的T2種子萌發并讓得到的植物自花授粉。測量T2植物上的長角果并收集和測量成熟的T3種子。來自T1轉化體，事件#1其中一種的成熟T3種子被觀察成為兩種類別，看起來具有正常大小的種子和看起來具有更小大小的種子。對兩種類型的種子的樣品進行分析并將結果顯示于表3中。
表3來自事件#1的T3種子的分析


結果表明II類種子具有比對照W/S種子小32.5％的平均重量。
實施例5擬南芥甲基轉移酶反義構建體將實施例1的2.7kb反義核酸可操作地連接到擬南芥DME啟動子核酸上。DME啟動子的核苷酸序列顯示于Kinoshita等，Proc.Natl.Acad.Sci.9814156-14161(2001)中。將DME:Met1a/s構建體引入如在Bechtold，N.等，C.R.Acad.Sci.Paris，3161194-1199(1993)中所述的擬南芥栽培品種WS中。將成熟T1種子萌發并讓其自花授粉。來自獨立轉化體的成熟T2種子被觀察到分成兩種類別，看起來具有正常大小的種子和看起來具有更大大小的種子。將每種類別的T2種子萌發并讓其自花授粉。對T3種子分析平均種子重量和DME:Met1 a/s轉基因的存在。
實施例6轉基因擬南芥種子的組合物收集來自實施例2中所述的純合植物(#34-20和#34-23)的T3種子和來自#34-20和#34-23的兩種子代植物(#34-20-10，#34-20-13，#34-23-04和#34-23-06)的T4種子。相對于由品系#34-16-04收集的非轉基因T4分離種子中的水平，測量每批種子中82種化合物的水平。進行分析的化合物為L-丙氨酸，甘氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-絲氨酸，L-脯氨酸，L-蘇氨酸，高絲氨酸，反式-4-L-羥脯氨酸，L-天冬氨酸，L-蛋氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-苯丙氨酸，L-天冬酰胺，L-鳥氨酸，L-賴氨酸，L-組氨酸，L-色氨酸，DL-乳酸，羥基乙酸，丙酮酸，草酸，磷酸，甘油酸，苯甲酸，延胡索酸，琥珀酸，檸蘋酸，蘋果酸，2-羥基苯甲酸，核糖酸-γ-內酯，α-酮戊二酸，奎尼酸，莽草酸，檸檬酸，異檸檬酸，3-磷酸甘油酸，葡萄糖酸，木糖/阿拉伯糖，巖藻糖，果糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、異麥芽糖、gycerol、核糖醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、甘露醇、環己六醇、麥芽糖醇，十一烯酸、辛酸(C8:0)，癸酸(C10:0)，月桂酸(C12:0)，肉豆蔻酸(C14:0)，棕櫚酸(C16:0)，硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1)，亞油酸(C18:2)，亞麻酸(C18:3)，二十二烷酸(C22:0)，二十四烷酸(C24:0)，L-十四烷醇，十六烷醇，L-十八烷醇，L-二十二烷醇，L-二十八烷醇，L-三十烷醇，角鯊烯，膽甾醇，豆甾烷醇，谷甾醇和菜油甾醇。
從每批種子中以兩次重復或三次重復進行抽提以產生重復樣品進行GC-MS分析。相對于內部標準和相對于對照水平進行標準化的數據的檢查顯示含有pRP:Met1 a/s構建體的種子的組合物與對照種子對于82種化合物中的80種而言基本上無差別。相對于對照種子來自#34-23-04，#34-23-06和#34-20-10植物的T4種子的亞油酸和亞麻酸含量減少。相對于對照種子來自#34-20-13植物的T4種子的亞油酸和亞麻酸含量有極微弱的減少。在親本#34-23或#34-20T3種子中沒有觀察到亞油酸或亞麻酸含量的減少。
實施例7包含擬南芥甲基轉移酶RNAi構建體的轉基因植物的分析通過將CaMV35S啟動子可操作地連接到有效轉錄成干擾RNA的序列上來形成RNAi構建體。所述RNAi序列包含有義方向上的大約2.7kb的擬南芥Met1序列以及nos終止子序列的反向重復。利用標準分子生物學技術形成所述構建體。見，Brummell等，Plant J.，33793-800(2004)。將所述構建體插入到載體中，所述載體包含賦予對除草劑Basta的抗性的可選擇標記基因。
通過實施例2中所述的農桿菌介導的方法將RNAi構建體載體導入擬南芥中。在對Basta抗性進行選擇后再生出八種獨立的T1植物，讓所述植物進行自花授粉。對來自T1植物的無性組織分析內源Met1轉錄物的量。作為對照，空白RNAi載體也被引入擬南芥中，所述空白RNAi載體中將CaMV35S啟動子可操作性地連接到反向nos終止子序列，并且在發育的相同階段對來自對照植物的無性組織進行分析。結果顯示T1植物中的內源轉錄物水平范圍為對照量的15％到58％。
實施例8包含水稻甲基轉移酶RNAi構建體的轉基因植物的分析下列符號用于本實施例中T0由轉化的組織培養物再生的植物；T1第一代，自花授粉的T0植物的后代；T2第二代，自花授粉的T1植物的后代；T3第三代，自花授粉的T2植物的后代。
通過將CaMV35S啟動子可操作地連接到有效轉錄成干擾RNA的序列上來形成RNAi構建體。所述RNAi序列包含約600個核苷酸的水稻胞嘧啶DNA甲基轉移酶有義鏈(N端區)以及nos終止子序列的反向重復。使用標準分子生物學技術來制備構建體。35S水稻Met反向nos構建體的序列顯示于SEQ ID NO1中。所述構建體的水稻Met部分顯示于SEQ ID NO2中。將所述構建體插入到載體中，所述載體包含賦予對除草劑Basta的抗性的可選擇標記基因。
通過農桿菌介導的轉化方法將RNAi構建體載體引入水稻栽培品種Kitaake的組織培養物中。由對于Basta抗性選擇的組織再生出來自十二種獨立事件的T0植物并讓其自花授粉。對十二種事件的轉化組織分析存在的特異性甲基轉移酶的內源轉錄物的量，其預計會被RNAi構建體所影響。作為對照，在發育的相同階段分析來自轉基因KitaakeT0組織植物的組織培養樣品，所述植物包含這樣一種載體，其具有連接到反向nos終止子上的35S啟動子但缺少甲基轉移酶RNAi。結果顯示T0植物中的內源轉錄物水平范圍為對照量的2％到53％。
除了使用約600個核苷酸的水稻甲基轉移酶C端區的區域之外，以相同的方式制成第二RNAi構建體。第二構建體的序列顯示于SEQ ID NO3中。所述第二構建體的水稻Met部分顯示于SEQ ID NO4中。通過農桿菌介導的方法將第二RNAi構建體引入水稻栽培品種Kitaake中。
已經描述了本發明的若干實施方案。然而，將要理解的是可以在不背離發明的精神和范圍的前提下進行各種改進。因此，其它實施方案在下列權利要求的范圍之內。
序列表<110>塞雷斯公司<120>改變種子表型的方法和組合物<130>18207-002W01<150>US 60/510,924<151>2003-10-14<160>50<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>8812<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成產生的構建體<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>NB42-35S-OsMET1Nt-RNAi #14<400>1aaatccaagc tcgatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg 60cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa 120aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat 180tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac 240tttattgcca aatgtttgaa cgatcgagcg ctagcgccta tatcgctagc gatcgcgagc 300tacgtacaca tcatgcatcg cgatcgagct tcgcgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 360tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa 420ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 480tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 540aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgct agatttcaca 600tacaccaaaa aaatgctgca taattctcgg ggcagcaagt cggttacccg gccgccgtgc 660tggaccgggt tgaatggtgc ccgtaacttt cggtagagcg gacggccaat actcaacttc 720aaggaatctc acccatgcgc gccggcgggg aaccggagtt cccttcagtg aacgttatta 780gttcgccgct cggtgtgtcg tagatactag cccctggggc cttttgaaat ttgaataaga 840tttatgtaat cagtctttta ggtttgaccg gttctgccgc tttttttaaa attggatttg 900taataataaa acgcaattgt ttgttattgt ggcgctctat catagatgtc gctataaacc 960tattcagcac aatatattgt tttcatttta atattgtaca tataagtagt agggtacaat1020cagtaaattg aacggagaat attattcata aaaatacgat agtaacgggt gatatattca1080ttagaatgaa ccgaaaccgg cggtaaggat ctgagctaca catgctcagg ttttttacaa1140cgtgcacaac agaattgaaa gcaaatatca tgcgatccta gaattaattc aggtaggtca1200gatttgagta acaggtctaa caggtctagg aggagcagga agctcgaaat ctctttgcca1260gaatccaaca tcatgccatc ctccatgctt gtatccagca gctctaagag ttcctctagc1320agtgtatcca agagcctcat gaagtctaac agaaggatcg ttaggaagtc caataacagc1380aacaacagac ttgaatcctt gagcctccat agacttaaga agatgagtgt aaagagtaga1440tccaagtcca agtctttgat gtctatgaga aacgtaaaca gtagactcaa cagtccaatc1500gtaagcgttt ctagccttcc aaggtccagc gtaagcaatt ccagcaacaa ctccctcaac1560ctcagcaaca agccaagggt atctatcttg aagtctctca agatcatcga tccactcttg1620aggagtttga ggctcagttc tgaagttaac agtagaagtc tcaatgtaat ggttaacaat1680atcacaaaca gcagccatat cagcagcagt agcaggtcta atctcaacag gtcttctctc1740aggagacatt ttgtttagct gtcaaaacaa aaacaaaaat cgaaacatca gaatcaacaa1800aaatacatca accatcaact atacaacaac caaaacgtca acaatataat caaacacaga1860
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<223>合成產生的構建體<221>misc_featute<222>(0)...(0)<223>(NB42-35S-OsMET1ct-RNAi #2<400>3aaatccaagc tcgatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg 60cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa 120aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat 180tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac 240tttattgcca aatgtttgaa cgatcgagcg ctagcgccta tatcgctagc gatcgcgagc 300tacgtacaca tcatgcatcg cgatcgagct tcgcgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 360tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa 420ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 480tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 540aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgct agatttcaca 600tacaccaaaa aaatgctgca taattctcgg ggcagcaagt cggttacccg gccgccgtgc 660tggaccgggt tgaatggtgc ccgtaacttt cggtagagcg gacggccaat actcaacttc 720aaggaatctc acccatgcgc gccggcgggg aaccggagtt cccttcagtg aacgttatta 780gttcgccgct cggtgtgtcg tagatactag cccctggggc cttttgaaat ttgaataaga 840tttatgtaat cagtctttta ggtttgaccg gttctgccgc tttttttaaa attggatttg 900taataataaa acgcaattgt ttgttattgt ggcgctctat catagatgtc gctataaacc 960tattcagcac aatatattgt tttcatttta atattgtaca tataagtagt agggtacaat1020cagtaaattg aacggagaat attattcata aaaatacgat agtaacgggt gatatattca1080ttagaatgaa ccgaaaccgg cggtaaggat ctgagctaca catgctcagg ttttttacaa1140cgtgcacaac agaattgaaa gcaaatatca tgcgatccta gaattaattc aggtaggtca1200gatttgagta acaggtctaa caggtctagg aggagcagga agctcgaaat ctctttgcca1260gaatccaaca tcatgccatc ctccatgctt gtatccagca gctctaagag ttcctctagc1320agtgtatcca agagcctcat gaagtctaac agaaggatcg ttaggaagtc caataacagc1380
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<221>misc feature<222>(0)...(0)<223>OsMET1的C-末端結構域<400>4ttgagctagg tggttcagac aaaccaaagg atgggcaatc agagaactgt cttgcaacac 60ttgacatttt tgctggttgt ggaggtttat ctgaaggatt gcagcgatca ggattgtcac120ttactaaatg ggctattgaa tatgaagaac ctgctgggga tgcatttggt gaaaaccatc180cagaagctgc agtatttgtc gaaaactgca atgtgattct gaaggcaatt atggacaagt240gtggtgattc tgatgattgc atctccactt ctgaggctgc tgaacgagca gctaaacttt300ctgaggacaa gattaagaat ctgcccgtgc ctggcgaagt agaattcata aatggtggcc360ctccgtgtca gggtttttct gggatgaaca gattcaatca aagtccctgg agcaaagtcc420agtgcgagat gatcttagca ttcctgtcat ttgcggagta tttccgtcct agattctttc480tcttagaaaa tgttaggaac tttgtctcgt tcaacaaagg acagaccttc agattgacac540tggcatcact cctggagatg ggataccagg tccgatttgg aattttagag gcaggggctt600atggtgttgc gcagtccagg aaaagggcat tcatttgggc cgctgcacct ggagagactc660tt 662<210>5<211>1187<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成產生的<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>啟動子(FIE)<400>5ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg atgagtttct caaagtttgg 60accttgatta tcttgtttgg agatgttcaa atcgttatat ccaaatagtg aacttctaat120tttctttttt gataatgtga cttatttgga aaagtattcc aaagtattca aataaaccct180ttaaaaatcc attaaataca ttttaaataa gtaaaatgct ctcaacgaag agatatcatg240gtaaataaca acagtgagag gataaaatgt taaatcaatt tatttacaac ttcaaatagg300cggacatcaa acctacttag cacactttct attttcaaat tggttatggt ttgtctatta360gttgttgcat ctatgttttt taattcttat atcggtgatc ttgattttgt tttggtgtat420ctaaaatcta ttttagttaa agtgcaagaa aataaaataa aaacttaagg taagagatga480aagtaagctt taaataaaac agagcacttc tatggtcgat tatagagcca agttcgttcc540tccattttgg cttaatgcaa tattacaagt aaatcttata aaactttcca taagtatcgt600attacccatg gatactatga tatataaact ctcggaggtg tagtccagaa gaaatgatcc660atatttgcat acagtaaact tgatggaaaa aatatgtggt actgttggaa ttgtagctat720tgagtatcaa atttgagaaa aaggtaaaaa aatatgtaaa atttgggtgg aagaaaagaa780ttacataaaa ttgagaaatg tatgtaattg acaaaataat gttttcaaaa cataaaaacg840
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<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>YP0102<400>6gaggtcagtg aagtcgattg ggatttggtt gataacgttt tactcgacta attatatact 60tcagaaggat agtaatagaa taccaaaata attaaatgat tggttagtgc cttagtggag 120actttttaac cgattctaat agactaatga tgtagctaag cattatttgg gatcatcact 180gtttgaaaac gtgaaatgtg ataaaagtta tgaaacgatt aaaatataaa ataaccgtac 240aaaacattat gtaccgtttt tttctctgtt cttttggcga tttggtttag ttcgttacac 300tctaaatgtt attgcatata tatatataat gatgcatttg catctgagga acatataatt 360ccggttaaca cttccaaatc ttatatccgt ctaggtaggg attttataaa tcatttgtgt 420catcatgcgt tatgcttgtc ggctttgacc ataacgcaga gatatagaac tagcttttac 480ttaactttta gatttattat ttgatctaga gttaagtgga gatatatagt gtttttgtta 540gattattggt ggatgtgaga gtttgtcttt agtttcaagt tgagaatata aggcaagagg 600agactctgag gcaatcagag gttttgattg gcaaaatatc caaaaggccc aaaccaagtc 660gaagcccatc tcgtacaaaa aaagaaagag atctgtaaga aaaaatattc tttgatattc 720ttacaaaaat aagtgtaaaa cttttattag tcaaaatctt caatctttaa aaactctcat 780cactcctacg aaagcgcgtg agagttatga gacattcctt aatagcatta ctcacaagtc 840acaagttcaa aacgtctgac tgaaacagaa acaagccttt gttgaagtct tgaagaagag 900acattagtac tcgtcgtata gccataaaag gtaatatacg aaatttcttc gctaatctct 960tcaccttcct ctacgcgttt cactttcact ttataaatcc aaatctccct tcgaaaaca 1019<210>7<211>1023<212>DNA<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)<220>
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tgccagcgag caacaacaat cgaagcgcga gaaagcaact attgatgacg ctaagaactc 540gtccaagaac aaaaatcttg accgcagtgt cgatgaggta accgatcttc cccacaaaac 600atattcataa ataccattac ttgatttttt ttatggaatt ccttattcat gtagaacata 660ttttctattt gatgaattct ccatgcatga tgtttcaatc ttcttttttt tattgtgtgg 720agtatataaa agtaattaga atttgtagca cctggacata tgcagcaaat tattcatcta 780ctactatagt tcggatttat ttttatcgat gcaaattgga tttggataga aatgtacatt 840cttttatttt agtcagaata aaagtttctt ctatctagaa tatactataa taacatatct 900atctaaaaca aatatggtac aacacacttg caactagcag caagttccct gaaagatgtt 960tgtctaatgc tatggtgatc tctttcacta cagtttggtg tatgtgtgtc catagtagaa1020tatgagtcct gcaaaagcaa acatcatcat gccaacaaaa atggcccatg tgccatcaat1080aattcaaggt gcccgttgat gagtaacaga acatttgatt gtgtcaccct accacaaaca1140cacatggaag gccattgcat tccctataag gacatcatgg tcattccaaa atgtactgac1200acctgctcaa tgcagacaaa aaccccttca aaaaacagaa gaatctccct cttaaaaaaa1260ctgattaaat gattatttct gaaataaaaa tgttgagttt ttatttttaa atagtttata1320tcattctatt cttttagaaa cgtagtacaa acatagatac ttacagcgtg cgcatactca1380tctatataaa tgcacacctc tgaaaaacta aagagaagtg gaaaaaatgg caagatttac1440taataattag attatagttt ttcacatcta ataggaaaat tatagattaa ataatttttt1500gaaagaaaaa aatatttgaa aacttattta ttttcaagta tttgaaatta tttaaataaa1560gagtaaattt tagaaaacta caactacagt gaaaaaacta tcagtttgct ataactttta1620cgtgatatgt tgctacagtt gtcacctaca tgtcctgtag cagtatatca catcaaagtt1680gtagttttgt gataattttt catgctattg gtgcaaaaaa ctgaaataga tcattaatat1740tacagcaaac tgatagttct atcactgtag ttatagtttt ctgaaattta agatctaaaa1800gaagaaaaaa aggggggggg ggggggtgag atttacacac agccacacga cacgaggcag1860ggctacccca ctagacaatc tgtccactca ccactggcct cacttccttg atctcttctc1920gtcttctcca ccccgcacgc ggccaccccc gcagggaccc cgtgacccgc gcccgcgccc1980gcgcctcacc gca 1993<210>28<211>1534<212>PRT<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)<220>
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atcccatgaa cttcctgcca tttattttgt ggagtatatg tatgaaacat tgaatggaag2460caaaatgttt catggaagag tgatggagcg aggatcccag actgttcttg gcaacactgc2520caatgagagg gaggtatttt tgacaaatga gtgcacaaat ttggcattaa aggaagttaa2580acaggcagct gctgtgggca ttaaagtaat gccgtggggg catcagtata ggaaggataa2640tgctgatgct aacagaactg atagagcaag ggcagaagag aggaagagga agggtttgcc2700gactgaatat tactgtaaaa gcttgtattg cccagagaga ggtgctttcc ttagtctttc2760acgtgatact atgggtctgg gttctggtgc ctgccactct tgcaaaatga atgaagccga2820ggaggccaag gaagtattta aagtgaattc atcaaaaact ggttttgtat acaggggagt2880tgagtactca gttcatgatt atgtctatgt aagtccccat tattttggtg tggaaaggat2940ggaaactgaa attttcaagg ctggaaggaa tttggtgctg aaagcttatg tcgtgtgcca3000agtgctggag atagttgtta tgaaggagtc taaacgacct gaaatagaat ctacccaggt3060taaagtaaga agatttttca gaccagagga catatctgtt gagaaggcat acagttcgga3120tattagagag gtctactaca gtgaacaaac acacatcgtg cctgttgata atatagaaag3180aaaatgtgaa gtcagaaaga agagtgatct tccagtatgt aatgctcctg tcattttcca3240gcatattttc ttctgtgaac atctatatga tccttctaaa gggtctatta agcagttgcc3300agctcacatc aaactgaggt actcaacagg aggtgggcat gctgattcta gaaagagaaa3360gggcaagtgc aaagaaggag aaaatgtttc agaagttgag aaccagagag ttgattctga3420gcagaaacgc ctagccacat tggatatatt tgctggttgc ggtggcttgt ctaatgggtt3480gcgtcagtct ggtgcttcaa taaccaagtg ggcaattgag tatgaagagc ctgctgggga3540tgctttcaaa ctcaaccatc ctgagtcatt ggtttttatc aataactgca atgtgatctt3600aagggccgta atggaaaaat gtggggacac agatgattgt attgcaactt ctgaagctgc3660tgaattggct gcatcacttg atgaggaggt taaaaatgat ttgccgttgc cggggcaggt3720agatttcatc aatggaggac ctccatgccg gggtttctct ggaatgaata ggttcaccca3780aagcccttgg attaaatttc attgtaaaat gatttgggct tgcttagcct ttgccgacta3840cttccggcca aagttgttcc cgctggagaa tgtgaggaaa tttgtgtcat tcaataaagg3900gcagacattt cagcttactt tggcttccct tctcgaaatg ggttaccagg tgagatttgg3960aatcctggag gccggtgcat atggaatatc ccaatctcgt aaacgagctt tcatttgggc4020tgctgcacca gaagaagttc tccctgaatg gcctgagccg atgcatgtct ttggtgttcc4080aaagttgaa aatctcactat ctcaaggttt acattatgct gctgttcgta gtactgcact4140tggtgcccct ttccgtccaa tcaccgtgag agacacaatt ggtgatcttc catacgtaga4200aaacggagac tctaggacaa acaaagagta taaagaggtt gcagtctcgt ggttccaaaa4260ggagataaga ggaaacacga ttgctctcac tgatcatatc tgcaaggcta tgaatgagct4320taacctcatt cgatgcaaat taatcccaac taggcctggg gctgattggc atgacttgcc4380aaagagaaag gttacgttat ctgatgggcg cgtagaagaa atgactcctt tttgtctccc4440aaacacagct gagcgccaca acggttggaa gggactatat gggagattag attggcaagg4500aaactttccg acttccgtca cggatcctca gcccatgggt aaggttggaa tgtgctttca4560tcttgaacag cacagaatcc ttacagtccg tgaatgcgcc cgttctcagg ggtttccgga4620tagctacgag tttgcaggga acataaatca caagcacagg cagattggga atgcagttcc4680tcctactttg gcctatgcat tggggactaa actcaaggaa gcaattgaca gcaagaggtt4740gtcttcacaa gagtaagagt ggttgttgtt gtttgtttct atgtaatact gatagttcca4800tttggttgcc ttctaaggca aaaacacagc tcagtttgtt gtctttgatt ttcttcttat4860attgtgtttg taaacttgtc ttgattgagg aacttcaatt aaatacacac aagcattttt4920cttcaggaga caagtgtcac aaaagtttgg tacatatata tatttgaaat tattttactt4980tavtttagaaa aa 4992<210>32<211>265<212>PRT<213>大豆(Glycine max)<220>
<221>肽<222>(0)...(0)<223>Ceres克隆520982 Met1同系物<400>32Met Glu Lys Cys Gly Asp Thr Asp Asp Cys Ile Ser Thr Ser Glu Ala1 5 10 15Ala Glu Leu Ala Ala Lys Leu Asp Glu Lys Glu Ile Ser Ser Leu Pro20 25 30
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<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>Ceres克隆520982 Met1同系物<400>33aattgcaatg ttattcttag ggctgtaatg gagaagtgtg gggacacaga tgattgtatc 60tcaacatccg aagctgcaga attggctgca aagcttgatg agaaggaaat aagtagttta 120ccaatgcctg gacaagttga tttcatcaat ggtggtcctc catgtcaggg tttctctggg 180atgaataggt ttaaccagag cagttggagt aaagtccagt gtgagatgat attggcattc 240ttatcctttg ccgattattt ccggccaagg tatttcttgt tggagaatgt gaggaacttt 300gtgtctttca ataaagggca gacattccgt ttaactttgg cttcacttct tgagatgggc 360tatcaggtga ggtttggtat ccttgaggct ggagcatatg gggtttccca gtcaagaaaa 420agggcattca tatgggcagc ctctcctgag gatgtgcttc ctgaatggcc tgaaccaatg 480catgtctttt cggcccctga gttgaagatt acattatcag aaaatgtcca gtatgctgct 540gtccgcagta ctgcaaatgg tgctccatta cgttcaataa ctgttcaaga tactattggt 600gatctcccag ctgttggcaa tggagcctca aaaggaaaca tggagtatca aaatgatcca 660gtctcatggt ttcaaaagaa gattcgaggt gatatggttg tcttgactga tcatatatca 720aaggagatga atgaattgaa cttgattcga tgccagaaaa ttcccaagag accaggcgct 780gattggcgtg accttccaga agaaaaggtg aagttaaata tttgagtttt agcataacat 840tttttgtgat ctatctaata tgtgaaatct aatgaaatgc agataaaatt gtctactgga 900caagttgttg atttgatacc atggtgcttg ccaaacacgg ctaagcggca caatcagtgg 960aagggactgt ttggcaggtt ggattggcaa gggaatttcc caacttccat tactgaccct1020cagccaatgg ggaaggttgg aatgtgcttc caccctgacc aagataggat tcttactgtt1080
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tgaaactaag aaggatcagg ttgcagaagg agaattgcta gcagtccgta tgactgctgg 360acaagaggat gaccgcccaa atagaagact tacagacttt atccttcatg atgaaagtgg 420tgcagcacag gcacttgaga tgcttgaaat caaggattta ttcatcactg gacttatatt 480gccactagaa ggaaatgctg acaagaaaaa agagcaaggt gttagatgtc atggttttgg 540tcgaattgag tcatgggaca tatctggtta tgaggatggc tctccagtga tatggatttc 600tactgagatt gctgactatg attgccagaa accagctggt acctacaaaa aatactatga 660tcttttcttt gaaaaagctc gggcttgctt agaagtgtac aaaaaactag caaagtcttc 720tgggggagat cctgacataa gccttgatga gttacttgct ggcatggcac ggtcaatgag 780tggtagcaag tacttttctg gaactgcatc actaaaggaa ttcattattt ctcagggtga 840ttttatttat aagcaactca ttggtttaga cacaatgttg aaggcaaatg acaaggggtt 900tgaagatatt cctgctttga ttgctcttag agatgagagc aagaaacaag cacactttgc 960aaacacacaa gtgaggccat caaatgcgac tttaaggatt ggttcgggaa ttgtagatga1020agagaaaaag aatcagatgg attctgtaga tgaagaggat gaggatgcaa agttagctcg1080actattgcag gatgaagagt attggaaatc taacaggcag aggaaaaact ctagatcatc1140atcttcatct aataaattct atatcaagat taatgaagat gagattgcaa atgattatcc1200tctccctgct tattataaaa cttctcttca agaaacggat gaatttatag tttttgataa1260tgactgtgac atatatgaca ctgaagatcc ttctagaagc atgttgcaca attgggcttt1320atacaactct gattctagat tgatttccct ggaacttctt cccatgaaac cttgttcaga1380gatggatgtt acaatctttg gatcaggtac aatgacttca gatgatggaa gtggtttcaa1440tcttgataca gaggctggcc aatcttccgt tgcttctgga gcacaagaca ctgatggtat1500tccaatttat ctgagtgcaa taaaagagtg gatgattgaa tttggatcat ctatggtttt1560catatccatc cgaacagatt tggctggtat aggacttggc aaaccatcaa agcagtacac1620tccttggtat gacacagtat tgaaaactgc aagaattgct ataagcatta tcacgttgtt1680gaaggagcag agccgtgtat cacggctttc atttccagat gttataaaaa aagtatctga1740gtatactcag gacaataagt catatatttc ttctgatcca ttggctgtag aaagatatat1800tgttgtccat ggacagataa ttctgcaact atttgcagaa tttccagatg acaagatcag1860gaagtctcct ttcgtgactg gtcttatgaa caaaatggaa gaaaggcacc ataccaaatg1920gttagtgaag aagaagaaac tgtcgccaaa gagtgagcca aatttgaatc ctagggcagc1980aatggctcct gttgtatcta aaaggaaagc tatgcaagct acagcaacaa agctaatcaa2040tagaatatgg ggtgagtatt actcaaacca cttacccgag gaatcaaaag aaggaactgc2100tattgaagaa aaggatgatg atgaagcaga ggaacaggaa gagaatgaag acgaggatgc2160tgaggaagag acagtactgt tggaggaaac actaaagcca cgtatagttt ccaaacagat2220taaagcattt tctgatgatg gagaggttag atgggaaggg gttcccgaaa ggaaaaccag2280ttctggattg cctctttata agcaggcaat tattcatgga ggaagttgtt tctgtgggaa2340tatctgtgtc agtcggaagt tgatgaatca gatgagcttc ctgatatata ttacattgaa2400tatatgtttg aatccaaaga atggggaaaa gatgtttcat ggtaggatga tgcaacatgg2460ttgtcacact gttcttggca atgccgcaag tgagagagag gtgtttttga ctaatgagtg2520cagggatttg ggactgcaag atgttaagca gataaatgtt gcaagcatcc gaaaaacacc2580ttgggggcat cagcatcgaa aggctagtaa tgctgcaggt aaaatcgata gagagagagc2640tgatgaaagg aagaagaaag gactgcctac tgaatattac tgtaaaagct tgtactggcc2700tgagaggggt gctttcttca gtcttccgtt tgatacgctg ggtttagggt ctggtgtctg2760tcactcttgc aatatacaag aagctgacaa ggcgaaggaa attttcaaag taaattcgtc2820taagtctagt tttgtattgg atggaacaga atattctctc aatgactatg tttatgtaag2880cccttttgaa tttgaggaaa agatagagca gggaactcat aagagtggga ggaatgtagg2940gctgaaagct tttgttgtat gccaagtgct cgagatcatt gccaaaaagg aaacaaaaca3000agctgaaata aaatctacag aactcaaagt cagaagattc tttcgaccag aagatgtatc3060aagtgagaaa gcatactgct ctgatgtaca agaggtgtat ttcagtgatg aaacatatac3120tatctctgtt caatctgtag aaggtaaatg tgaagtcagg aaaaagattg atatccctga3180aggaagtgcc cctggagcct ttcacaatgt ctttttctgt gaactcctgt atgatcctgc3240cacaggatcg ctcaagaagt tgccatctca tatcaaagta aaatattcta gtggacctac3300agctgataat gcagctagaa agaaaaaggg aaaatgtaaa gagggagata gcatttcagt3360gcctgatata aaaagtaaaa catcaaatga aaaccgttta gcaaccctgg acatttttgc3420aggatgcggt gccttatcag aggggttgca taagtctggt gcttcatcaa ctaaatgggc3480tattgaatat gaagaaccag ctggcaatgc attcaaagct aatcatcctg aagctttggt3540gtttattaac aactgtaatg taattctcag ggctataatg gagaaatgtg gagatataga3600tgaatgtatc tcaacagccg aggctgcaga attggcctct aagcttgatg ataaggattt3660gaatagttta ccattacctg ggcaagttga tttcattaat ggggggcctc catgccaggg3720tttctctggg atgaatagat ttaacacaag cacttggagt aaagtccagt gtgagatgat3780
attagcgttc ttatcctttg ctgattattt ccggccgagg tatttcctct tggagaatgt3840gaggaacttt gtgtctttta ataaaggaca gactttccgt ttaactttgg cttcacttct3900cgagatgggt taccaggtga ggtttggtat cctcgaggct ggagcttttg gtgtttctca3960gtcaagaaaa agggcattta tatgggctgc ctctccagaa gatgtgcttc ctgagtggcc4020agaaccaatg catgtcttct ctgcccctga gttgaaaatc acattggcag aaaatgtcca4080gtatgctgcc gtctgcagta ctgcaaatgg tgctccgtta cgggcaataa ctgttcgtga4140taccattggt gaactcccag ctgttggcaa tggagcctct aggacaaaca tggagtatca4200aagcgatcct atctcgtggt ttcaaaagaa gatccgaggc aatatggctg tcttgactga4260tcatatatca aaggaaatga atgagttgaa cttgatccga tgtcagaaaa ttcctaagag4320accaggttgt gattggcgtg atcttccaga cgaaaagata aaactttcaa ctggacaact4380tgttgatttg ataccatggt gcttgccaca cacagctaag aggcataatc aatggaaggg4440actgtttggt aggttagatt ggcaagggaa tttcccaact tccatcaccg accctcaacc4500aatggggaag gttggaatgt gcttccatcc cgatcaagat agaattctta ctgttcgtga4560atgcgcccga tctcaaggct ttccagacta ctatcaattt tctggtaaca tcatacacaa4620gcacaggcag attggtaacg cggttcctcc tcctctggca tttgcattag gaaggaaact4680caaggaagca ttggatagta agagcgccaa ttagaggatt agggcgcatc tttcaaaaag4740catcttttta tcatatagtt ttgtctttca gtgttctgga aacaacccaa cccttgtata4800tagttgtttt cttggctatt tttcttagtt taatcaattc tttgtttaaa aggattgatg4860gaatggatta tgctataaaa ctcatttttt ctatcaaaaa aaaaaaaaaa 4910<210>36<211>1545<212>PRT<213>Daucus carota<220>
<221>肽<222>(0)...(0)<223>gi|2895087|gb|AAC39355.1|Met1-類型胞嘧啶DNA-甲基轉移酶<400>36Met Gly Ser Ser Ala Val Val Asp Ala Pro Ala Leu Asp Ala Gly Leu1 5 10 15Glu Thr Lys Lys Asn Lys Arg Lys Asn Ala Asp Cys Asp Ser Glu Lys20 25 30Thr Ala Val Ser Gly Gln Lys Lys Gln Arg Ala His Ala Leu Lys Ser35 40 45Ser Glu Thr Pro Val Gly Ser Arg Lys Met Pro Lys Arg Ala Ala Ala50 55 60Cys Ala Asp Phe Lys Glu Lys Ser Ile Gln Ile Ser Lys Lys Ser Ser65 70 75 80Ile Ile Glu Thr Lys Lys Asp Arg Ser Val Asp Glu Glu Glu Val Ala85 90 95Val Arg Leu Thr Ala Gly Gln Glu Asp Gly Arg Pro Cys Arg Arg Leu100 105 110Thr Asp Phe Ile Phe His Asn Ser Asp Gly Ile Pro Gln Ala Phe Glu115 120 125Met Leu Glu Val Asp Asp Leu Tyr Ile Ser Gly Leu Ile Leu Pro Leu130 135 140Glu Asp Ser Ser Gln Lys Glu Ala Cys Ser Ile Lys Cys Glu Gly Phe145 150 155 160Gly Arg Ile Glu Asn Trp Ala Leu Ser Gly Tyr Glu Glu Gly Val Pro165 170 175Thr Ile Trp Val Ser Thr Asp Val Ala Asp Tyr Asp Cys Val Lys Pro180 185 190Ser Ala Ser Tyr Lys Lys His Tyr Glu His Leu Phe Ala Lys Ala Thr195 200 205Ala Cys Val Glu Val Tyr Lys Lys Leu Ser Lys Ser Ser Gly Gly Asn210 215 220
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<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>AB030726.1；GI7288139；DNA(胞嘧啶-5-)-甲基轉移酶mRNA，完整的cds<400>41atggcttatt cttttttcca tttttttgct ggttattcag gacacaaaaa ggagaaaagc 60aaacgagatt ctgtgtcaaa aaggaaggca cctgcaactg acaagaagga aaagaaacag 120cctgtttctg aagctattga ggagcccact gctgcacgca aaaggcccaa gcgagctgct 180gcttgttcaa attttaaaga gaaaaatgtt catttatcaa aaaattctgc agtcattgaa 240acaaagaagg accaatgcgt agaggaagag gttttggcta ttcggttaac tgcgggtcta 300caggattctc agcgaccctg tagaagacta acagatttta tctttcataa tttggaagga 360ataccacaac cttttgaaat gtctgaagtt gatgatctgt ttattactgg tctcatttta 420ccacttgagg acaataatga caaagaaaaa gcaaaaggaa ttagatgtga aggctttggg 480cgtatagaag aatgggctat ctctggctat gaagatggaa ctcctatcat atggatctca 540acagagacag ctgattatga ttgtaaaaaa ccctcaggtg gctataagaa gttttatgac 600cacttcttcg ccaaagctac agcctgcatt gaggtttaca aaaagctgtc gaaatcttct 660ggaggaaatc ctgatttaag ccttgatggg ttgcttgcag gggttgtccg agcaatgagt 720ggtttaaaat gcttttcggg tggtgtatca atcagggact ttctcatttc tcagggagag 780tttgtctata agcaacttat cggtcaggac gatacatcaa agaagactga tcagcttttt 840gttgagttac ctgtcctggc ttcccttaga gatgaaagca gcaatcagga aatgctttca 900caaccagagc ctttatcatt tggtaggact ctaactatag gtccaaaagt aggcaaagga 960gaaggcaaga gagatcaatc tgatttaacc actggtccag aacaagaaga ggaagatctg1020aaattggcca aactgttaca tgaacaggag tactggcact ccttgaacca gaagacaagc1080cgtagtacat cttcctcatc tagcaaattt tacatcaaga tcaatgagga tgagattgca1140
agtgattatc ctttacctgc atattacaag acatgtaatg aagagaccga tgagtatatc1200gtctttgaca gtggggttga tacatactat attgatgact tgcctcgcag tatgcttcat1260aattgggcat tgtacaactc agactcaaga ctaatttctt cagagctcct gcctatgaaa1320ccatgcgctg atattgatgt aaccatattt gggtctggag tgatgactgc tgatgatgga1380tctggataca atgttgatgc tgatgctaat aactcctctt caggtggttc tggatcagct1440gagattgatg gaatgccaat ttatttgagt gcaataaaag aatggatgat tgagtttggg1500tcctcgatga tctttatatc tattcggact gatatggcct ggtataggct tgggaagcca1560tcaaaacagt atgctccttg gtatgaacca gtcctaaaga ctgcgaagtt ggcagtgagc1620attattactt tgttaaagga acaaagtcgt tgtgctagac tttcttttgg agatgtcatt1680aaaagggttt cagagttcaa gaaacaccat cctgcttata tatcatctaa tacagatgtg1740gtggaaagat atgtggttgt acatggacag attattctgc agcagttttc agaatttcct1800gatgaaagca ttaggaaatg tgcatttgtg attggcctct caaggaaaat ggaggagagg1860caccatacaa aatggttgat taagaagaag aaggttgtgc agagacatga acagaactta1920aatcctagag catctatggc gccatctgta aaaaggaaag ctatgcaggc tactacaaca1980agactaatca acagaatctg gggggagtac tattccaatt actcacctga gacgtcaaag2040gaggttgttg cttgtgaggt gaaggatgat gaagaagtag atgagcagga ggaaaatgac2100gaggatgatg ctcaagagga gaacttggaa gtttcagaga aaactcatac accttgctct2160acaagaaggc atattaagtc acgttctgac agcaaagaaa taaactggga tggggaatcc2220ataggtaaaa cagcgtctgg tgaactgttg tttaaaaagc ctagaattca tggaaatgag2280attgctgttg gagattcagt tctggtggaa catgatgaac cagatgaact tccttctatt2340tactttgtcg aatacatgtt tgaaaaattg gatggtagca aaatgctcca tggaagaatg2400atgcaacggg gatctgaaac tgtacttgga aatgcagcta atgaaagaga ggtatttttg2460atcaatgaat gcatggattt gcaactagga gatgtcaaag aaagtgtagt tgtcagtatc2520aggatgatgc catggggaca tcagcataga aaagcgaatg cttatgttga taaacttgat2580agagcaaagg cagaagacag gaagaagaag ggattgccat ccgaatttta ttgcaaaagc2640ttttatcagc ctgacagagg tgctttcttc agacttccgt ttgataagat gggtcttggt2700aatggcttat gttactcctg tgagttgcag caaattgatc aggaaaagga atcttttaag2760ttggatatgt ccaactccag ttttgtatat ctggggactg agtattcaat tgatgacttt2820gtttatatac accctgatca ctttgctgta gaaagagggg gaagtggaac tttcaaagct2880gggagaaatg tggggttgat ggcctatgta gtgtgtcaac taatagagat ttctggcccc2940aagggatcta aacaagctaa agtagattct accaacgtca aagtcaggag attcttcaga3000ccagaggaca tttcttcaga taaggcatac tcttctgata ttcgggagat ctactatagt3060gaggagatac atacagttcc ggtagaaaca attgaaggta aatgtgaagt gaggaagaag3120tatgatattc cgtctgaaga tgtccctgcc acctttgacc atgttttctt ttgtgaatat3180ttgtatgatc cattgaatgg atccctcaaa cagttaccag ctcaggtaaa gctgagattc3240tcaagagtta aactagatga tgctgcatct aggaagagaa agggaaaagg caaggaagga3300gaggatgaac tgagagttgg gcaactaaat gtagcttctc aacagaatcg tttggccaca3360ctagatatct ttgctggttg tggtggcctg tctgaggggt tgcagcgttc gggtgtctca3420gatacaaaat gggcaattga atatgaagag cctgctggag atgcgtttaa acttaatcat3480ccagaggcaa aggtgttcat acagaattgc aatgtgattc tgagggctgt catgcaaaag3540tgtggagatg ctgagaactg tatctcaacc tcagaggctt ctgaattagc tgcagcaatg3600gatgagaacg aactgaatag tttgccactg ccaggacaag tggacttcat aaatggaggc3660cctccttgtc aggggttttc tggaatgaat agatttaatc agagcacctg gagtaaagtt3720cagtgcgaga tgattctggc atttttatcc tttgctgatt attatcggcc taagttcttt3780ctcttggaga atgttaggaa ttttgtgtcg ttcaaccaaa aacaaacatt tcgcttaact3840gttgcttccc ttcttgagat gggttatcag gtgaggtttg gtatccttga agctggagcg3900tttggagttc ctcagtctag gaagagagca tttatctggg ctgcttcccc agaggagatt3960cttccagagt ggccagaacc aatgcatgta tttggtgtcc cagaattaaa aatcacatta4020tctgaaactt gtcactatgc agctgtgagg agtactgcta gtggagctcc attccgttcg4080cttactgtca gagacacaat tggagatctt cctgctgttg gcaacggagc atccaagacc4140tgtatagagt atcaagttga cccgatatcc tggttccaaa ggaaaattcg gggcaactca4200ataacattat ccgatcacat tacgaaagag atgaacgagc ttaacctaat caggtgccaa4260agaattccta agcggccagg agccgactgg cgtgaccttc cggatgaaaa ggttaaacta4320tgtaatggtc aactggttga tttgattccg tggtgcctgc ctaacactgc taagaggcac4380aaccagtgga aggggctctt tgggaggttg gattgggatg ggaacttccc cacttccttt4440actgaccccc agccgatggg taaggtgggg atgtgttttc atcccgacca agacaggatt4500gttacagttc gtgaatgtgc gcgttctcaa ggtttcccag atagctatca atttgctggt4560aacattttgc acaagcacag gcaaatagga aatgctgttc cacctccttt ggcatatgca4620
ctgggaagga aacttaagga agctgttgag agcaagaaga ggtccactta gaagtttgta4680aattttgtgg aacaagagat gagtggtcat actgcacctg aatttaagct ttcaaattta4740aatgtcaaac agcatgattc acatgtcaat tttctgttgt acaagatagc ttattgcaga4800atcaatgtta cataaaaaaa aa 4822<210>42<211>152<212>PRT<213>小麥(Triticum aestivum)<220>
<221>肽<222>(0)...(0)<223>Ceres克隆890048；Met1同系物<221>變體<222>142，143，146，148<223>Xaa＝任何氨基酸<400>42Asp His Ile Ser Lys Glu Met Asn Glu Leu Asn Leu Ile Arg Cys Lys1 5 10 15His Ile Pro Lys Arg Pro Gly Cys Asp Trp His Asp Leu Pro Asp Glu20 25 30Lys Val Lys Leu Ser Ser Gly Gln Met Val Asp Leu Ile Pro Trp Cys35 40 45Leu Pro Asn Thr Ala Lys Arg His Asn Gln Trp Lys Gly Leu Tyr Gly50 55 60Arg Leu Asp Trp Glu Gly Asn Phe Pro Thr Ser Val Thr Asp Pro Gln65 70 75 80Pro Met Gly Lys Val Gly Met Cys Phe His Pro Asp Gln Asp Arg Ile85 90 95Ile Thr Val Arg Glu Cys Ala Arg Ser Gln Gly Phe Pro Asp Ser Tyr100 105 110Gln Phe Ser Gly Thr Ile Gln Ser Lys His Arg Gln Ile Gly Asn Ala115 120 125Val Pro Pro Pro Leu Ala Phe Ala Leu Gly Arg Lys Leu Xaa Xaa Ala130 135 140Val Xaa Gly Xaa His Gln Gln Ala145 150<210>43<211>457<212>DNA<213>小麥(Triticum aestivum)<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>Ceres克隆890048；Met1同系物<400>43cgatcacata tctaaggaga tgaatgaatt aaatctcata agatgcaaac atattcccaa 60acgacctggt tgtgactggc atgacctgcc agatgagaag gtgaagctat cttctgggca 120aatggtggac ctgatacctt ggtgcttgcc taacaccgct aaaaggcaca atcagtggaa 180gggtctgtat gggaggttag attgggaggg caatttcccc acgtctgtga ctgatcctca 240gccgatgggc aaggttggca tgtgcttcca ccctgaccag gataggatta tcacggtccg 300cgaatgtgcg cgatctcagg gctttcctga cagctaccag ttttcgggca ccattcagag 360caagcacagg cagattggca atgctgtgcc accccctctt gcctttgcgc ttgggaggaa 420gctgamtsaa gccgttsatg ggaakcacca gcaggcc 457
<210>44<211>1525<212>PRT<213>玉米(zea mays)<220>
<221>肽<222>(0)...(0)<223>gi|3132825|gb|AAC16389.1|假定的胞嘧啶-5-甲基轉移酶<400>44Met Gln Ser Lys Ala Thr Lys Glu Gly Arg Gly Ile His Arg Lys Gln1 5 10 15Gln Ala Gly Glu Trp Ile Ser Gly Tyr Asn Arg Arg Gly Ala Ser Trp20 25 30Ser Arg Lys Ser Asp Gly His Val Thr Arg Lys Arg Pro Arg Arg Ser35 40 45Ala Ala Cys Ser Asp Phe Lys Glu Lys Ser Ile Arg Leu Ser Glu Lys50 55 60Lys Ser Val Val Met Val Lys Lys Asn Arg Met Glu Glu Glu Glu Val65 70 75 80Asp Ala Val Asn Leu Thr Lys Leu Gly Pro Glu Asp Pro Pro Pro Cys85 90 95Arg Lys Leu Ile Asp Phe Ile Leu His Asp Ala Glu Gly Asn Pro Gln100 105 110Pro Phe Glu Met Ser Glu Ile Asp Asp Phe Phe Ile Thr Ala Leu Ile115 120 125Met Pro Met Asp Asp Asp Leu Glu Lys Glu Arg Glu Arg Gly Val Arg130 135 140Cys Glu Gly Phe Gly Arg Ile Glu Asp Trp Asn Ile Ser Gly Tyr Asp145 150 155 160Glu Gly Thr Pro Val Ile Trp Val Ser Thr Asp Val Ala Asp Tyr Glu165 170 175Cys Val Lys Pro Ser Thr Asn Tyr Lys Ser Tyr Phe Asp His Phe Tyr180 185 190Glu Lys Ala Gln Val Cys Val Glu Val Phe Lys Lys Leu Ala Lys Ser195 200 205Val Gly Gly Asn Pro Asn Gln Gly Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Val210 215 220Val Arg Ser Thr Asn Ala Met Lys Gly Tyr Ser Gly Thr Met Ser Lys225 230 235 240Asp Leu Val Ile Ser Ile Gly Glu Phe Val Tyr Asn Gln Leu Val Gly245 250 255Leu Asp Glu Thr Ser Asn Asn Asp Asp Glu Lys Phe Ala Thr Leu Pro260 265 270Val Leu Leu Ser Leu Arg Asp Gln Cys Arg Ser Arg Val Glu Leu Thr275 280 285Lys Leu Pro Ser Asn Phe Ser Asn Thr Ser Leu Lys Ile Lys Asp Ser290 295 300Glu Cys Asp Glu Thr Ala Glu Asp Asp Asp Asp Ala Lys Leu Ala Arg305 310 315 320Leu Leu Gln Gln Glu Glu Glu Trp Lys Met Met Lys Lys Gln Arg Gly325 330 335Arg Arg Gly Thr Pro Ser Gln Lys Asn Val Tyr Ile Lys Ile Ser Glu340 345 350Ala Glu Ile Ala Asn Asp Tyr Pro Leu Pro Ala Tyr Tyr Lys Pro Phe355 360 365Ser Gln Glu Met Asp Glu Tyr Ile Phe Asp Ser Asp Asp Ser Ile Phe370 375 380
Ser Asp Asp Val Pro Val Arg Ile Leu Asn Asn Trp Thr Leu Tyr Asn385 390 395 400Ala Asp Ser Arg Leu Ile Ser Leu Glu Leu Ile Pro Met Lys Ser Gly405 410 415Ala Glu Asn Asp Val Val Val Phe Gly Ser Gly Phe Met Arg Asp Asp420 425 430Asp Gly Ser Cys Cys Ser Thr Ala Glu Ser Val Lys Ser Ser Ser Ser435 440 445Ser Ser Lys Ala Asp Gln Leu Asp Ala Gly Ile Pro Ile Tyr Leu Ser450 455 460Pro Ile Lys Glu Trp Ile Ile Glu Phe Gly Gly Ser Met Ile Cys Ile465 470 475 480Thr Ile Arg Thr Asp Va1 Ala Trp Tyr Lys Leu Arg Gln Pro Thr Lys485 490 495Gln Tyr Ala Pro Trp Cys Glu Pro Val Leu Lys Thr Ala Arg Leu Ala500 505 510Val Ser Ile Ile Thr Leu Leu Lys Glu Gln Ser Arg Ala Ser Lys Leu515 520 525Ser Phe Ala Asp Val Ile Arg Lys Val Ala Glu Phe Asp Lys Gly Asn530 535 540Pro Ala Phe Ile Ser Ser Asn Ile Thr Leu Val Glu Arg Tyr Ile Val545 550 555 560Val His Gly Gln Ile Ile Leu Gln Gln Phe Ala Asp Phe Pro Asp Glu565 570 575Thr Ile Arg Arg Ser Ala Phe Val Ser Gly Leu Leu Leu Lys Met Glu580 585 590Gln Arg Arg His Thr Lys Leu Val Met Lys Lys Lys Thr Gln Val Met595 600 605Arg Gly Glu Asn Leu Asn Pro Ser Ala Ala Met Gly Pro Ala Ser Arg610 615 620Lys Lys Ala Met Arg Ala Thr Thr Thr Arg Leu Ile Asn Arg Ile Trp625 630 635 640Ser Asp Tyr Tyr Ala His His Phe Pro Glu Asp Ser Lys Glu Gly Asp645 650 655Gly Asn Glu Thr Lys Glu Ile Asp Asp Glu Gln Glu Glu Asn Glu Asp660 665 670Glu Asp Ala Glu Asp Glu Gly Gln Ile Glu Glu Asn Ile Ser Lys Thr675 680 685Pro Pro Ser Thr Arg Ser Arg Lys Leu Leu Ser Gln Thr Cys Lys Glu690 695 700Ile Arg Trp Glu Gly Glu Thr Ser Gly Lys Thr Leu Ser Gly Glu Thr705 710 715 720Leu Tyr Lys Cys Ala Tyr Val Arg Glu Leu Arg Ile Pro Val Gly Gly725 730 735Thr Val Ala Leu Glu Asp Asp Ser Gly Asp Thr Val Ile Cys Phe Val740 745 750Glu Tyr Met Phe Gln Lys Val Asp Gly Ser Lys Met Val His Gly Arg755 760 765Ile Leu Gln Lys Gly Ser Gln Thr Ile Leu Gly Asn Ala Ala Asn Glu770 775 780Arg Glu Val Phe Leu Thr Asn Asp Cys Leu Glu Phe Lys Leu Asp Asp785 790 795 800Ile Lys Glu Leu Val Met Val Asp Ile Gln Ser Arg Pro Trp Gly His805 810 815Lys Tyr Arg Lys Glu Asn Ser Glu Ala Asp Lys Val Glu Gln Val Lys820 825 830Ala Glu Glu Arg Lys Lys Lys Gly Gln Pro Met Val Tyr Phe Cys Lys835 840 845
Ser Leu Tyr Trp Pro Glu Lys Gly Ala Phe Phe Ala Leu Ser Arg Asp850 855 860Lys Met Gly Leu Gly Ser Gly Leu Cys Ser Ser Cys Asp Asn Ile Glu865 870 875 880Pro Asp Ser Asp Glu Leu Lys Ile Phe Ser Lys Thr Ser Phe Val Tyr885 890 895Arg Lys Val Thr Tyr Asn Val Asn Glu Phe Leu Tyr Ile Arg Pro Asp900 905 910Phe Phe Ala Glu Asp Glu Asp Arg Ala Thr Phe Lys Ala Gly Arg Asn915 920 925Val Gly Leu Lys Pro Tyr Ala Val Cys Gln Ile Leu Ser Ile Pro Glu930 935 940Gly Ala Gly Ser Lys Lys Leu Asn Pro Ala Ser Ala Asn Ile Ser Ala945 950 955 960Arg Arg Phe Tyr Arg Pro Asp Asp Ile Ser Ser Ala Lys Ala Tyr Ala965 970 975Ser Asp Ile Arg Glu Val Tyr Tyr Ser Glu Asp Val Ile Asp Val Pro980 985 990Val Asp Met Ile Glu Gly Lys Cys Glu Val Arg Lys Lys Asn Asp Leu995 10001005Ala Ser Ser Asp Leu Pro Val Met Phe Glu His Val Phe Phe Cys Glu101010151020Leu Ile Tyr Asp Arg Ala Ser Gly Ala Leu Lys Gln Leu Pro Pro Asn1025103010351040Val Arg Phe Met Ser Met Val Gln Arg Thr Ser Ala Leu Lys Lys Asn104510501055Lys Gly Lys Gln Ile Cys Glu Pro Asp Gln Ile Asp Ser Gly Lys Trp106010651070Leu Asp Val Pro Lys Glu Asn Arg Leu Ala Thr Leu Asp Ile Phe Ala107510801085Gly Cys Gly Gly Leu Ser Glu Gly Leu Gln Gln Ala Gly Val Ser Phe109010951100Thr Lys Trp Ala Ile Glu Tyr Glu Glu Pro Ala Gly Glu Ala Phe Asn1105111011151120Lys Asn His Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Asn Cys Asn Val Ile112511301135Leu Lys Ala Ile Met Asp Lys Cys Gly Asp Thr Asp Asp Cys Val Ser114011451150Thr Ser Glu Ala Ala Glu Gln Ala Ala Lys Leu Pro Glu Val Asn Ile115511601165Asn Asn Leu Pro Val Pro Gly Glu Val Glu Phe Ile Asn Gly Gly Pro117011751180Pro Cys Gln Gly Phe Ser Gly Met Asn Arg Phe Asn Gln Ser Pro Trp1185119011951200Ser Lys Val Gln Cys Glu Met Ile Leu Ala Phe Leu Ser Phe Ala Glu120512101215Tyr Phe Arg Pro Arg Phe Phe Leu Leu Glu Asn Val Arg Asn Phe Val122012251230Ser Phe Asn Lys Gly Gln Thr Phe Arg Leu Ala Val Ala Ser Leu Leu123512401245Glu Met Gly Tyr Gln Val Arg Phe Gly Ile Leu Glu Ala Gly Ala Phe125012551260Gly Val Ala Gln Ser Arg Lys Arg Ala Phe Ile Trp Ala Ala Ala Pro1265127012751280Gly Glu Met Leu Pro Asp Trp Pro Glu Pro Met His Val Phe Ala Ser128512901295Pro Glu Leu Lys Ile Thr Leu Pro Asp Gly Gln Tyr Tyr Ala Ala Ala130013051310
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<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>AF063403.1；GI3132824；假定的胞嘧啶-5 DNA甲基轉移酶(ZMET1)基因，完整的cds<400>45ccctccactg ctcctacctt taacgaagca gcctggcagc acataaactt tcattttgaa 60cttgttcaac ccgctgctgt gtttatggat ctttggcatc attgatggca ttaaactttt 120gagtctggca cttactgatc tccaccttga accaggacat ttcttcatcc cattttgctt 180cctttctgtt ctttgttgct ttctcaaatc ttccctaaac ccaaccaaat ttctttaaac 240aaaaacgtgt atatgtgcat ttttagccca cacgcggatt cgagaacaag ctctatgagc 300atcttcctcc ctattgactg tcaaaaaaaa gacggtgatg catgacacca cctcacctta 360tcgaatcatg tctcccttgt tctgttctcc aaccatgctg cacacctgcc atttgtcata 420tactcatcaa aattcatata aaacccccaa tcgtatcaat tccaatcccg tactagttaa 480aagataacta tgtggagttg tcgcttcttc ccgtaatgta gttaagttag agggccctgg 540tgtggcgctc ccgtcctggg tttgagcctt ggcattgcac cggtggtgca cccacctcat 600ggctggtggc ggtgcaaatg gttctgtgac caccaatgaa gcgagtgcac atgaggttct 660tgcctgcttt ccgtggtttg gtgggtccct atcttaatac agtcaaatgt acatctctcc 720ttgatcaaat ttccccgtta acccatgtgg attatgtggt attgagtcgt aaatccatag 780caagtcaaaa ttcatcacaa tccattccaa tacactccaa tccacatgga attggaataa 840ccgaacaatg ccttagttgg aaatggagtc attccagtct cttacatctg acacaaatat 900ctttcctgag ttgtgacaac cagtgttacc cagacatctg cgttcctttt ttttgcggag 960ccagaaaact tgtcggtttc caagtggtgt accccccccc cccccccccc aatttttttt1020tgtcaaactg gacacctgca cccgtaccgg acacaaatac ccgcactagc atgtgtccca1080tgtgacactg gtaaagtatt tggcattttg tgttcccatt taccctccca taatggtaat1140
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<221>肽<222>(0)...(0)<223>gi|24416628|dbj|BAC22505.1|胞嘧啶甲基轉移酶<400>48Gln Arg Val Trp Ser Lys Val Gln Cys Glu Met Ile Leu Ala Phe Leu1 5 10 15Ser Tyr Ala Asp Tyr Phe Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Glu Asn Val20 25 30Arg Asn Phe Val Ser Phe Asn Lys Gly Gln Thr Phe Arg Leu Thr Met35 40 45Ala Ser Leu Leu Glu Met Gly Tyr Gln Val Arg Phe Gly Val Leu Gln50 55 60Ala Gly Asn Phe Gly Val Ser Gln Ser Arg Lys Arg Ala Phe Ile Trp65 70 75 80
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<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>AB080617.1；GI24416627；胞嘧啶甲基轉移酶的基因，部分的cds<400>49tcaaagagta tggtctaaag tacaatgtga gatgattcta gcgttcttat cctacgccga 60ctatttccgt cctcgatact tcttgcttga aaatgttcgg aacttcgtgt cattcaacaa 120gggccaaact ttcagattaa caatggcctc tctcctcgag atgggttatc aggtacgctt 180tggcgtccta caagctggga actttggtgt ttctcagtct aggaagaggg cattcatctg 240ggcagcagct ccagatgagt cattaccaga ttggcctgag gccagacacg tctctgcaag 300ctcacaacta ggagtaactt tgcctggtgg tgggcagtac gccgcagtga gagacgcagg 360gctgggtgcc cctttcaggg ccattactgt cagagacaca atcgctgacc ttcccccggt 420ggctaacggt gctgacaccc taaagacagt ctatacccaa cctgctgagt cgtggtttca 480aatgcatatt agagggaaga ccgacgtatt gactgatcac atttccaagg aaatgaatga 540actgaatttg attcgctgcc agcgtattcc caaaaggccc ggggccgatt gccgggatct 600tcctgccgag aagattaaat tgtccacagg acaactggtc gacctcatac cctggtgcct 660gcctaatacg gccgctcggc acaaccagtg gaagggtctc tttggacgtc ttgattggga 720cggcaatttt cccacttcga tcaccgatcc tcagcccatg gggaaagtag gaatgtgctt 780ccatcccgtt caaaatcgaa ttgtcacagt ccgagagtgt gcccgctctc aggggtttcc 840ggattcctat aagtt 855<210>50<211>372<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>共有序列<221>變體<222>4<223>Xaa＝Gly或Cys<221>變體<222>7<223>Xaa＝Gln或Thr<221>變體<222>11，33，167，224，268，271，324，372<223>Xaa＝Ile，Leu，Val，或Met<221>變體<222>14，30，139，155，162，195，203，342<223>Xaa＝Thr，Gly，或Ala<221>變體<222>17<223>Xaa＝Asn或Ala<221>變體<222>24<223>Xaa＝Thr或Asp<221>變體<222>26，218，281<223>Xaa＝Glu或Lys<221>變體<222>27，165，296，340<223>Xaa＝Gln或Glu<221>變體<222>28<223>Xaa＝Lys或Ile<221>變體<222>90，344<223>Xaa＝Thr或Asn<221>變體<222>101，187，267<223>Xaa＝Arg或Gln<221>變體<222>142，270，319<223>Xaa＝Glu或Asp<221>變體<222>156，225<223>Xaa＝Val或Ala<221>變體<222>158<223>Xaa＝Lys或Glu
<221>變體<222>166<223>Xaa＝Gly或Asn<221>變體<222>168<223>Xaa＝His或Gln<221>變體<222>177<223>Xaa＝Leu或Asn<221>變體<222>181<223>Xaa＝Phe或Leu<221>變體<222>183<223>Xaa＝Pro或Set<221>變體<222>197<223>Xaa＝Glu或Gly<221>變體<222>200<223>Xaa＝Asp或Ala<221>變體<222>202，254<223>Xaa＝His，Lys，或Arg<221>變體<222>205<223>Xaa＝Lys或Met<221>變體<222>208，243<223>Xaa＝Lys或Gln<221>變體<222>209<223>Xaa＝Glu或Asn<221>變體<222>210<223>Xaa＝Val或Asp<221>變體<222>211<223>Xaa＝Ala或Pro<221>變體<222>222<223>Xaa＝Asn或Asp<221>變體
<222>223<223>Xaa＝Thr或Met<221>變體<222>231<223>Xaa＝Cys或Ser<221>變體<222>233<223>Xaaa＝Ala或Glu<221>變體<222>244，258，369，370<223>Xaa＝任何氨基酸<221>變體<222>247，262<223>Xaa＝Thr或Lys<221>變體<222>251<223>Xaa＝Ala或Cys<221>變體<222>259<223>Xaa＝Arg或Glu<221>變體<222>264<223>Xaa＝Ser或Asn<221>變體<222>265<223>Xaa＝Asp或Ser<221>變體<222>269<223>Xaa＝Glu或Val<221>變體<222>274<223>Xaa＝Phe，Tyr，或Trp<221>變體<222>285<223>Xaa＝Gly或Gln<221>變體<222>321<223>Xaa＝His或Asp<221>變體<222>347<223>Xaa＝His或Ser<400>372Met Glu Lys Xaa Gly Asp Xaa Asp Asp Cys Xaa Ser Thr Xaa Glu Ala1 5 10 15
Xaa Glu Leu Ala Ala Lys Leu Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Leu Pro20 25 30Xaa Pro Gly Gln Val Asp Phe Ile Asn Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly35 40 45Phe Ser Gly Met Asn Arg Phe Asn Gln Ser Ser Trp Ser Lys Val Gln50 55 60Cys Glu Met Ile Leu Ala Phe Leu Ser Phe Ala Asp Tyr Phe Arg Pro65 70 75 80Arg Tyr Phe Leu Leu Glu Asn Val Arg Xaa Phe Val Ser Phe Asn Lys85 90 95Gly Gln Thr Phe Xaa Leu Thr Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Gly Tyr100 105 110Gln Val Arg Phe Gly Ile Leu Glu Ala Gly Ala Tyr Gly Val Ser Gln115 120 125Ser Arg Lys Arg Ala Phe Ile Trp Ala Ala Xaa Pro Glu Xaa Val Leu130 135 140Pro Glu Trp Pro Glu Pro Met His Val Phe Xaa Xaa Pro Xaa Leu Lys145 150 155 160Ile Xaa Leu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Ala Val Arg Ser Thr Ala165 170 175Xaa Gly Ala Pro Xaa Arg Xaa Ile Thr Val Xaa Asp Thr Ile Gly Asp180 185 190Leu Pro Xaa Val Xaa Asn Gly Xaa Ser Xaa Xaa Asn Xaa Glu Tyr Xaa195 200 205Xaa Xaa Xaa Val Ser Trp Phe Gln Lys Xaa Ile Arg Gly Xaa Xaa Xaa210 215 220Xaa Leu Thr Asp His Ile Xaa Lys Xaa Met Asn Glu Leu Asn Leu Ile225 230 235 240Arg Cys Xaa Xaa Ile Pro Xaa Arg Pro Gly Xaa Asp Trp Xaa Asp Leu245 250 255Pro Xaa Xaa Lys Val Xaa Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile260 265 270Pro Xaa Cys Leu Pro Asn Thr Ala Xaa Arg His Asn Xaa Trp Lys Gly275 280 285Leu Tyr Gly Arg Leu Asp Trp Xaa Gly Asn Phe Pro Thr Ser Val Thr290 295 300Asp Pro Gln Pro Met Gly Lys Val Gly Met Cys Phe His Pro Xaa Gln305 310 315 320Xaa Arg Ile Xaa Thr Val Arg Glu Cys Ala Arg Ser Gln Gly Phe Pro325 330 335Asp Ser Tyr Xaa Phe Xaa Gly Xaa Ile Xaa Xaa Lys His Arg Gln Ile340 345 350Gly Asn Ala Val Pro Pro Pro Leu Ala Phe Ala Leu Gly Arg Lys Leu355 360 365Xaa Xaa Ala Xaa370
權利要求
1.一種用于產生種子的方法，所述方法包括容許第一植物給第二植物授粉的步驟，所述第一植物具有第一重組核酸構建體，所述第一重組核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的第一核酸序列可操作連接的雄性配子體組織特異性調節元件，所述第二植物具有第二重組核酸構建體，所述第二重組核酸構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的第二核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件，其中在所述第二植物上發育的種子具有的平均種子重量，與在相應的第二植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的第二植物缺乏所述第二重組核酸構建體，并且被缺乏所述第一重組核酸構建體的相應的第一植物進行授粉。
2.權利要求1的方法，其中所述第一植物是近親交配的，雜交的，異質的種群或人造的種群。
3.權利要求1的方法，其中所述第二植物是近親交配的，雜交的，異質的種群，或人造的種群。
4.權利要求1的方法，其中所述第一植物對于所述重組核酸構建體是雜合的。
5.權利要求1的方法，其中所述第一植物對于所述重組核酸構建體是純合的。
6.權利要求1的方法，其中所述第二植物對于所述重組核酸構建體是雜合的。
7.權利要求1的方法，其中所述第二植物對于所述重組核酸構建體是純合的。
8.權利要求1的方法，其中所述第一和第二植物是雙子葉植物。
9.權利要求8的方法，其中所述第一重組核酸構建體的所述第一核酸序列編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，所述甲基轉移酶包含具有在SEQ IDNO50中提出的序列的多肽區域。
10.權利要求8的方法，其中所述第一重組核酸構建體的所述第一核酸序列編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，所述甲基轉移酶與在SEQ ID NOS28，30，34，36，38，和40中提出的序列之一具有50％或更大的序列同一性。
11.權利要求8的方法，其中所述第二重組核酸構建體的所述第二核酸序列被轉錄為干擾RNA。
12.權利要求8的方法，其中所述第二重組核酸構建體的所述第二核酸序列被轉錄為反義核酸。
13.權利要求1的方法，其中所述第一和第二植物是單子葉植物。
14.權利要求13的方法，其中所述第一重組核酸構建體的所述第一核酸序列編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，所述甲基轉移酶與在SEQ ID NOS44和46中顯示的氨基酸序列之一具有50％或更大的序列同一性。
15.權利要求14的方法，其中第一核酸序列與在SEQ ID NOS44和46中顯示的氨基酸序列之一具有80％或更大的序列同一性。
16.權利要求15的方法，其中第一核酸序列具有在SEQ ID NO44中提出的氨基酸序列。
17.權利要求15的方法，其中第一核酸序列具有在SEQ ID NO46中提出的氨基酸序列。
18.權利要求13的方法，其中所述第一和第二植物是玉米或水稻植物。
19.權利要求1的方法，其中所述雄性配子體組織特異性調節元件包括在SEQ ID NO8中提出的序列。
20.權利要求1的方法，其中在所述被授粉的植物上發育的種子的平均種子重量比在相應的第二植物上發育的種子的平均種子重量至少大10％，所述相應的第二植物缺乏所述第二重組核酸構建體，并且被相應的缺乏所述第一重組核酸構建體的第一植物所授粉。
21.權利要求20的方法，其中在所述被授粉的植物上發育的種子的平均種子重量比在相應的第二植物上發育的種子的平均種子重量多大約10％到約50％，所述相應的第二植物缺乏所述第二重組核酸構建體，并且被缺乏第一重組核酸構建體的相應第一植物所授粉。
22.一種用于產生種子的方法，所述方法包括容許第一植物給第二植物授粉的步驟，所述第一植物具有重組核酸構建體，所述重組核酸構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的第一核酸序列可操作連接的雄性配子體組織特異性調節元件，其中在所述第二植物上發育的種子具有的平均種子重量，與在相應的第二植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量減少，所述相應的第二植物被缺乏所述重組核酸構建體的相應的第一植物進行授粉。
23.一種用于產生種子的方法，所述方法包括容許植物授粉的步驟，所述植物具有重組核酸構建體，所述構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件，所述授粉以缺乏所述重組核酸構建體的花粉進行，其中在所述植物上發育的種子具有的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體，并且由缺乏所述重組核酸構建體的植物進行授粉。
24.權利要求23的方法，其中所述被授粉的植物是雙子葉植物。
25.權利要求24的方法，其中所述調節元件是選自由SEQ ID NOS6，25，和22組成的組的雌性配子體組織特異性啟動子。
26.權利要求24的方法，其中所述有效減少胞嘧啶DNA甲基化的水平的核酸序列被轉錄成干擾RNA。
27.權利要求26的方法，其中所述核酸序列具有10個核苷酸到4,500個核苷酸的長度，并且與在SEQ ID NOS29，31，33，35，37，39，41中提出的核酸序列之一，或其互補序列之一具有70％或更大的序列同一性。
28.權利要求27的方法，其中所述核酸序列具有20個核苷酸到1,000個核苷酸的長度，并且與在SEQ ID NOS29，31，33，35，37，39，41中提出的核酸序列之一，或其互補序列之一具有80％或更大的序列同一性。
29.權利要求23的方法，其中有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的所述核酸序列被轉錄為反義核酸。
30.權利要求23的方法，其中所述被授粉的植物是單子葉植物。
31.權利要求30的方法，其中所述有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的所述核酸序列被轉錄為干擾RNA。
32.權利要求31的方法，其中所述核酸序列具有10個核苷酸到4,500個核苷酸的長度，并且與在SEQ ID NOS43，45，47，49中提出的核酸序列之一，或其互補序列之一具有70％或更大的序列同一性。
33.權利要求32的方法，其中所述核酸具有20個核苷酸到1,000個核苷酸的長度，并且與在SEQ ID NOS43，45，47，49中提出的核酸序列之一，或其互補序列之一具有80％或更大的序列同一性。
34.權利要求30的方法，其中有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的所述核酸序列被轉錄成反義核酸。
35.權利要求23的方法，其中所述授粉以來自非轉基因植物的花粉進行。
36.一種用于產生種子的方法，所述方法包括容許植物授粉的步驟，所述植物具有重組核酸構建體，所述重組核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件，所述授粉以缺乏所述重組核酸構建體的花粉進行，其中在所述植物上發育的種子具有的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量減少，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體，并被缺乏所述重組核酸構建體的植物進行授粉。
37.一種用于產生種子的方法，所述方法包括容許第一植物給第二植物授粉的步驟，所述第一植物具有重組核酸構建體，所述重組核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雄性配子體組織特異性調節元件，其中在所述第二植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物被缺乏或不表達所述重組核酸構建體的植物所授粉。
38.權利要求37的方法，其中所述第一和第二植物是雙子葉植物。
39.權利要求38的方法，其中有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的所述核酸序列編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，所述甲基轉移酶包括具有在SEQ ID NO50中顯示的氨基酸序列的多肽區域。
40.權利要求37的方法，其中所述雄性配子體組織特異性調節元件是SEQ ID NO8擬南芥YP0180啟動子。
41.權利要求37的方法，其中所述第一和第二植物是單子葉植物。
42.權利要求41的方法，其中所述核酸序列編碼胞嘧啶DNA甲基轉移酶，所述甲基轉移酶與在SEQ ID NO44和SEQ ID NO46中顯示的氨基酸序列之一具有50％或更大的序列同一性。
43.權利要求37的方法，其中在所述被授粉的植物上發育的種子的平均種子重量比所述相應的植物上發育的種子的平均種子重量多至少10％，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體。
44.權利要求43的方法，其中在所述被授粉的植物上發育的種子的平均種子重量比在所述相應的植物上發育的種子的平均種子重量多約10％到約50％，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體。
45.一種用于產生種子的方法，所述方法包括容許在多種植物中授粉的步驟，所述多種植物包括多種第一植物，所述第一植物的每一種都具有第一重組核酸構建體，所述第一重組核酸構建體包括與有效增加胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雄性配子體組織特異性調節元件，其中在授粉后在所述第一植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體。
46.權利要求45的方法，其中所述授粉主要是自花授粉。
47.權利要求45的方法，其中所述多種第一植物是雙子葉植物。
48.權利要求45的方法，其中所述多種植物還包含多種第二植物，所述第二植物具有第二重組核酸構建體，所述第二重組核酸構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件，并且其中在授粉后在所述第二植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體。
49.權利要求48的方法，其中所述第一和第二植物是單子葉植物。
50.權利要求49的方法，其中所述多種植物還包括多種第二植物，所述第二植物具有重組的核酸構建體，所述核酸構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件，并且其中在授粉后在所述第二植物上發育的種子的平均種子重量與在相應的植物上發育的種子的平均種子重量相比，重量增加，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體。
51.權利要求45的方法，其中在所述授粉的植物上發育的種子的平均種子重量比在所述相應的植物上發育的種子的平均種子重量多至少10％，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體。
52.權利要求51的方法，其中在所述授粉的植物上發育的種子的平均種子重量比在所述相應的植物上發育的種子的平均種子重量多約10％到約50％，所述相應的植物缺乏所述重組核酸構建體。
53.一種轉基因宿主細胞，其包括重組核酸構建體，所述重組核酸構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列，所述核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件賦予植物雌性配子體細胞類型中的轉錄。
54.權利要求53的宿主細胞，其中所述一個或多個調節元件包括在SEQ ID NOS6，22，和25中提出的序列之一。
55.一種轉基因宿主細胞，其包括重組核酸構建體，所述構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列，所述核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件在植物雄性配子體細胞類型中賦予轉錄。
56.權利要求55的宿主細胞，其中所述一個或多個調節元件包括在SEQ ID NO8中提出的序列。
57.一種轉基因植物，其包括重組核酸構建體，所述重組核酸構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列，所述核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件在雌性配子體細胞類型中賦予轉錄。
58.權利要求57的植物，其中所述一個或多個調節元件相對于與卵細胞，合子和胚胎，在極性細胞核和中央細胞中賦予優先轉錄。
59.權利要求57的植物，其中所述一個或多個調節元件包括選自SEQID NOS6-27的序列。
60.權利要求57的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
61.權利要求60的植物，其中有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的所述核酸序列被轉錄為干擾RNA。
62.權利要求61的植物，其中所述核酸序列具有10個核苷酸到4,500個核苷酸的長度并與在SEQ ID NOS29，31，33，35，37，39和41中提出的核酸序列之一，或其互補序列之一具有70％或更多的序列同一性。63.權利要求62的植物，其中所述核酸具有20個核苷酸到1,000個核苷酸的長度，并且與在SEQID NOS29，31，33，35，37，39，41中提出的核酸序列之一或其互補序列之一具有80％或更多的序列同一性。
64.權利要求60的植物，其中有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的所述核酸序列被轉錄為反義核酸。
65.權利要求57的植物，其中所述植物是單子葉植物。
66.權利要求65的植物，其中所述有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列被轉錄為干擾RNA。
67.權利要求66的植物，其中所述核酸序列具有10個核苷酸到4,500個核苷酸的長度，并且與在SEQ ID NOS43，45，47，49中提出的序列之一或其互補序列之一具有70％或更多的序列同一性。
68.權利要求67的植物，其中所述核酸具有20個核苷酸到1,000個核苷酸的長度，并且與在SEQ ID NOS43，45，47，49中提出的核酸序列之一或其互補序列之一具有80％或更多的序列同一性。
69.權利要求65的植物，其中所述有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列被轉錄為反義核酸。
70.一種轉基因植物，其包括重組核酸構建體，所述重組核酸構建體包括有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列，所述核酸序列與一個或多個調節元件可操作地連接，所述調節元件在雄性配子體細胞類型中賦予轉錄。
71.一種制品，其包括包裝材料，和在所述包裝材料中的至少第一類型的種子和第二類型的種子，其中所述第二類型的所述種子具有重組核酸構建體，所述重組核酸構建體包括與有效減少胞嘧啶DNA甲基化水平的核酸序列可操作連接的雌性配子體組織特異性調節元件。
72.權利要求71的制品，其中所述第一類型的種子是非轉基因種子。
73.權利要求71的制品，其中所述種子是玉米種子。
全文摘要
本發明公開了表達胞嘧啶DNA甲基轉移酶并且可以用于賦予改變的種子表型，例如，種子重量增加的植物。還公開了這樣的植物，其中內源胞嘧啶DNA甲基轉移酶的表達被抑制并且顯示了改變的種子表型，例如種子重量的增加。還公開了適合于賦予這樣的表型的核酸和多肽。
文檔編號A01H5/00GK101031650SQ200480037301
公開日2007年9月5日 申請日期2004年10月14日 優先權日2003年10月14日
發明者R·I·彭內爾, V－D·丹格 申請人:塞雷斯公司