專利名稱：提高紅豆杉中紫杉醇含量的方法
技術領域：
本發明涉及植物生長調節劑應用領域，特別是一種通過使用植物生長調節劑提高紅豆杉紫杉醇含量的方法。
背景技術：
紫杉醇(Paclitaxel)是紅豆杉樹皮中的結構復雜的二萜類生物堿，廣泛存在于Taxus屬的紅豆杉樹中，是具有獨特生理活性的新一代癌癥化療藥物。商業用的紫杉醇主要來源于紅豆杉的樹皮，紅豆杉是一個生長極其緩慢的樹種，在樹皮中紫杉醇的含量也很低，僅占干重的0.01％，治療一個病人的紫杉醇需要量相當于60磅的紅豆杉樹皮，意味著有4株大樹將被砍伐。雖然紅豆杉屬植物分布較廣，但由于部分地域資源遭受破壞，天然林木日趨減少，已屬于瀕危珍惜樹種。相對于原料資源來講，紫杉醇存在供不應求的局面，而且目前矛盾十分尖銳。紅豆杉野生資源利用十分有限，細胞培養技術目前還沒有達到工業化生產水平，利用人工繁殖栽培擴大紅豆杉資源是目前紫杉醇資源的可靠途徑。我國雖然已建立了多處紅豆杉的栽培生產基地，但生長極慢，紫杉醇含量低，提高栽培群體紫杉醇的含量是當前面臨解決的一個難題。針對這一難點，企圖通過采用使用一種新型植物生長調節劑冠菌素的方法，在一定時間內大幅度提高紅豆杉莖葉中紫杉醇的含量。
植物生長物質是影響紫杉醇代謝的重要因素，目前研究最多的生長物質為茉莉酸或茉莉酸甲酯，它在植物次生代謝過程中起有重要的作用。大量研究發現，紅豆杉細胞培養時加入不同濃度的茉莉酸甲酯(methyl jasmonate)，均能促進紫杉醇合成，其中以繼代培養7天后加入作用效果最為明顯，在紅豆杉培養過程中加入10μmol/l茉莉酸甲酯，紫杉醇含量提高15倍，當茉莉酸甲酯與乙烯利(Ethrel)共同作用時紫杉醇提高19倍；而(3R，7R)和(3S，7R)-構型的茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞中紫杉醇的合成有較強的促進作用。
目前很多研究都是針對細胞培養的研究，對于植株紫杉醇代謝的研究很少，缺乏有效的調控技術。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于針對現有技術的不足，提供一種大幅度提高紅豆杉中紫杉醇含量的方法。
為實現上述目的，本發明的方法是向紅豆杉幼樹的莖葉上噴施濃度為0.05-0.1mg/L冠菌素。所述的紅豆杉幼樹是溫室內3-5年生紅豆杉或野外扦插5-10年生紅豆杉。
特別是，向溫室內3-5年生紅豆杉樹葉面噴施冠菌素，重復噴施2-4次，每相鄰兩次噴施時間間隔為10-20天。
特別是，在8-10月份向野外扦插5-10年生紅豆杉樹葉面噴施冠菌素，重復噴施3-5次，每相鄰兩次噴施時間為間隔10-15天。
本發明的方法的優點和積極效果在于通過使用一定濃度的冠菌素，調節紅豆杉的次生代謝系統，使紅豆杉的莖葉紫杉醇含量提高1.6-2.9倍，大幅度提高紫杉醇產量，降低生產成本，提高生產企業的經濟效益。
具體實施例方式
冠菌素(coronatin)，冠菌素是假單胞菌產生的一種物質，已證實它是茉莉酸的環戊烷結構類似物，可從多方面模擬茉莉酸多方面的功能。研究發現冠菌素與脫落酸、茉莉酸對植物有類似的功能，而且活性是后兩者的數千倍，被認為是對植物有極大生理活性的生長調節物質。該調節劑為生物代謝產物，用量低，對環境是安全的。
實施例1溫室內紅豆杉處理處理材料為溫室內栽培的4年生紅豆杉小樹，選擇株高和分支數相同的小樹，向紅豆杉樹葉面噴施濃度為0.05mg/L冠菌素，重復3次，每相鄰兩次噴施時間間隔15天。其中紅豆杉樹選擇溫室內3-5年生的、冠菌素濃度在0.05-0.1mg/L、噴施間隔時間為10-20天、重復噴施次數在2-4次范圍內都是可行的。
2周后紫杉醇含量測定每個重復取5株，取樣后先用自來水沖凈根系，然后用蒸餾水清洗全株，吸水紙吸干水后分樣，分別剪取側根、莖、新葉和老葉，稱取樣品1g加入5ml甲醇研磨后，于超聲波中處理4小時，離心吸出浸泡液再加入2ml甲醇，再重復一次，合并3次浸泡液9ml，減壓蒸干后加入甲醇溶解；得到1ml甲醇提取液。吸取甲醇提取液加到SPEC18固相萃取柱頂端，分別順序用10ml20％、80％甲醇溶液洗脫，萃取過程溶劑洗脫速度控制在3ml/min。收集80％甲醇洗脫液蒸干，加入0.5ml乙腈溶解，經0.22um微孔濾膜過濾，用HPLC分析紫杉醇含量。
取樣期內器官紫杉醇含量最高的為根(0.0140±0.0045mg/g)其次為老葉(0.0113±0.0015mg/g)、莖(0.0082±0.0008mg/g)和新葉(0.0058±0.0011mg/g)。冠菌素處理在處理后兩周根、莖、新葉、老葉的紫杉醇含量分別為對照的2.9倍、2.0倍、2.4倍、1.6倍，見表1；0.1mg/l冠菌素處理紅豆杉2周采收可以大幅度提高器官內紫杉醇的含量，使人工種植紅豆杉獲得高的紫杉醇產量，提高資源利用率和生產者的經濟效益。
表1 冠菌素處理對紅豆杉紫杉醇含量影響比較分析
表1中數據為處理Taxol含量/對照Taxol含量比值實施例2野外紅豆杉處理處理材料為野外栽培基地扦插繁殖的6年生紅豆杉，選擇株高相似的材料處理，于九月向紅豆杉樹葉面噴施濃度為0.1mg/l冠菌素，重復4次，每相鄰兩次噴施時間間隔12天。其中野外扦插紅豆杉樹選擇5-10年生的、噴施時間8-10月、冠菌素濃度為0.05-0.1mg/l、噴施重復次數3-5次、間隔時間10-15天都是可行的。
2周后紫杉醇含量測定每個重復取5株，分別剪取莖、針葉，風干粉碎，過100目篩后，稱取混合樣品1g放到20ml試管中，加入10ml甲醇于超聲波清洗器中超聲處理4小時，離心倒出浸提液，再加入l0ml甲醇，重復兩次上述超聲處理步驟，合并3次浸泡液30ml，用旋轉蒸發儀減壓蒸干。然后加入1ml甲醇溶解，再用0.5ml甲醇洗兩次，合并甲醇液得到2ml甲醇提取液。吸取甲醇提取液加到SPEC18固相萃取柱頂端，分別順序用10ml20％、80％甲醇溶液洗脫，萃取過程溶劑洗脫速度控制在3ml/min。收集80％甲醇洗脫液蒸干，加入0.5ml乙腈溶解，經0.22um微孔濾膜過濾，用HPLC分析紫杉醇含量。
Cor處理兩周后，紅豆杉莖、葉的紫杉醇含量分別為0.288±0.07mg/g、0.118±0.03mg/g，為對照莖、葉紫杉醇含量的2.1倍1.5倍；表明0.1mg/l冠菌素處理可以大幅度提高器官內紫杉醇的含量。
使用本發明的方法可產生可觀的經濟效益由于使用冠菌素在短期內使紅豆杉器官內紫杉醇產量大幅度提高，比對照提高1.6-2.9倍，降低生產成本，提高生產企業的經濟效益。
使用本發明的方法可產生積極的生態效益紅豆杉屬第四紀冰川后殘遺物種，天然分布地域狹窄、零散，加之人為偷盜、野蠻采種，使天然紅豆杉生存處于瀕危邊緣，藥用取其嫩小枝、葉、根做提取紫杉醇的原料，本發明可以大幅度提高栽培紅豆杉的紫杉醇產量，減輕紫杉醇生產的巨額利潤所帶來環境壓力，從根本上保護野生資源。
所以本發明的方法具有推廣價值瀕危紅豆杉林繁育已被列入東北老工業基地高技術產業化項目和星火計劃，黑龍江共栽種紅豆杉1.24萬畝，總栽種株數552萬株；云南僅麗江就栽植1至2年生紅豆杉苗250萬多株。因此本專利有巨大的應用前景和經濟效益。
權利要求
1.一種提高紅豆杉中紫杉醇含量的方法，其特征在于向紅豆杉幼樹的莖葉上噴施濃度為0.05-0.1mg/L冠菌素。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紅豆杉幼樹是溫室內3-5年生紅豆杉或野外扦插5-10年生紅豆杉。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于向溫室內3-5年生紅豆杉樹葉面噴施冠菌素，重復噴施2-4次，每相鄰兩次噴施時間間隔為10-20天。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于在8-10月份向野外扦插5-10年生紅豆杉樹葉面噴施冠菌素，重復噴施3-5次，每相鄰兩次噴施時間間隔為10-15天。
全文摘要
本發明提高紅豆杉中紫杉醇含量的方法屬于植物生長調節劑應用技術領域。該方法是向紅豆杉幼樹的莖葉上噴施濃度為0.05－0.1mg/L冠菌素。使用本發明的方法可以調節紅豆杉的次生代謝系統，使紅豆杉的莖葉紫杉醇含量提高1.6－2.9倍，大幅度提高紫杉醇產量，降低生產成本，提高經濟效益。本發明的方法可產生積極的生態效益紅豆杉屬第四紀冰川后殘遺物種，天然分布地域狹窄、零散，加之人為偷盜、野蠻采種，使天然紅豆杉生存處于瀕危邊緣，藥用取其嫩小枝、葉、根做提取紫杉醇的原料，本發明可以大幅度提高栽培紅豆杉的紫杉醇產量，減輕紫杉醇生產的巨額利潤所帶來環境壓力，從根本上保護野生資源。所以本發明的方法值得推廣、普及。
文檔編號A01N63/00GK1685832SQ20051001145
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月21日 優先權日2005年3月21日
發明者董學會, 李召虎, 段留生, 張明才, 何鐘佩 申請人:中國農業大學