專利名稱：硫酸酯化多糖及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種硫酸酯化多糖及其制備方法和應用。
背景技術：
目前，許多經硫酸酯化的多糖，如香菇多糖、地衣多糖、右旋糖酐、裂褶多糖、木聚糖等的硫酸酯具有明顯的體外抑制艾滋病病毒(HIV-1)的作用。Yoshida等報導了不同硫含量和分子量的curdlan sulfate的抑制效果，當硫含量小于5.6％時，硫酸酯化產物無抑制HIV活性，而硫含量為12.1-14.7％的產物在濃度為3.3μg/mL時，即可抑制HIV活性(Yoshida T.等，Macromolecules，1990，23卷，第3712-3722頁)。Wirvrouw M等報導了硫酸酯化多糖的抗病毒作用不僅與硫酸根含量相關，而且與分子量(Mr)也有很大的關系，如硫酸葡聚糖的抗HIV-1活性隨分子量的增加而增加，在Mr＝10000時達到最大(Wirvrouw M等，Antiviral Chem Chemother，1994，5(6)，第345-359頁)。而非硫酸酯化葡聚糖、木糖呋喃聚糖、核糖呋喃聚糖、凝膠聚果糖等，在硫酸酯化前無抗HIV活性的多糖，在硫酸酯化以后抑制HIV對細胞的感染，這說明硫酸基對于抗病毒活性起重要作用。
硫酸酯化反應是多糖中引入硫酸酯基的常用方法。目前常用的硫酸酯化多糖的方法主要有三氧化硫-吡啶法、濃硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-二甲基甲酰胺法，其中氯磺酸-吡啶法是最常用的一種方法，這些硫酸酯化方法均是在常規條件下進行反應的，存在所需反應時間長、溶劑用量較大、高溫下降解較劇烈的缺點。Jianhong Yang等報導的生漆多糖的硫酸酯化條件為162mg多糖懸浮于16.2mL二甲亞砜中，60℃或70℃下反應1-5小時，在較高溫度下降解較劇烈(Jianhong Yang等，Biological Macromolecules，2002，31，第55-62頁)。
發明內容
本發明的目的是提供一種硫酸酯化多糖以及提供一種所用時間短、溶劑用量較小、高溫下降解較小的硫酸酯化多糖的制備方法和其在體外具有抗艾滋病病毒活性上的應用。
本發明提供的硫酸酯化多糖硫的重量百分含量為1.01～16.60％，每個單糖單位的硫酸根取代度DS為0.05～1.78，重均分子量Mw為3.9×103～10.6×104。
上述硫酸酯化多糖為硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖和硫酸酯化茶樹菇多糖。
本發明還提供了硫酸酯化多糖的制備方法在冰鹽浴中，將氯磺酸滴入1～10倍體積的吡啶中，得到氯磺酸吡啶混合物；稱取一定量的多糖，將其溶解或懸浮在10～90倍重量比的溶劑中，接著加入與多糖殘基的摩爾比為1∶2～30的上述氯磺酸吡啶混合物，于微波合成儀中進行酯化反應，微波功率為20～150W，反應溫度為35～100℃，反應時間為3～30min；反應結束后，冷卻，用1～4mol/L NaOH中和，透析，透析內液經冷凍干燥即得硫酸酯化多糖。
上述溶劑為二甲亞砜、二甲基甲酰胺、甲酰胺和吡啶中的任何一種。
上述方法中所用的透析袋截留分子量為3500Da。
本發明的硫酸酯化多糖在體外具有抗艾滋病病毒(HIV-1)活性。
硫酸酯化多糖分子參數的測試方法為采用硫酸鋇濁度法測定產物的硫的重量百分含量，并根據公式計算每個單糖單位的硫酸根取代度DS＝(1.62×S％)/(32-1.02×S％)，采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定多糖的重均分子量Mw。
采用p24抗原檢測的方法測定硫酸酯化多糖對HIV-1病毒的抑制作用。試驗采用96孔板，將硫酸酯化多糖以RPMI-1640無血清培養液配制成2000μg/mL的溶液，并作4倍系列稀釋，每孔100μL，每濃度設4個復孔，另設病毒對照、細胞毒對照和細胞對照孔。另配50萬細胞(含1000TCID50病毒液)，于上述96孔板加有藥液的孔中，每孔加入100μL。37℃，5％CO2孵育1.5h，棄去游離的病毒，繼續培養5天，其中在第3天換液。第5天取每孔上清，用p24試劑盒測定p24抗原量以表示硫酸酯化多糖對病毒的抑制作用。
具體實施例方式
實施例1在冰鹽浴中，將2mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的4mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取870.4mg枸杞多糖，溶解或懸浮于15mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為40W，50℃反應15min。反應結束后，冷卻，加NaOH溶液中和，于蒸餾水中透析至透析液中無SO3-存在，透析內液經冷凍干燥即得淡棕色固體粉末狀硫酸酯化枸杞多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
實施例2在冰鹽浴中，將1mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的2mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取867.1mg姬松茸多糖，溶解或懸浮于20mL二甲亞砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為45W，50℃反應10min。反應結束后，處理方法同實施例1，得棕色固體粉末狀硫酸酯化姬松茸多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
實施例3在冰鹽浴中，將0.9mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的1.8mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取802.7mg苦瓜多糖，溶解或懸浮于18mL二甲亞砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為45W，60℃反應8min。反應結束后，處理方法同實施例1，得紅棕色固體粉末狀硫酸酯化苦瓜多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
實施例4在冰鹽浴中，將0.8mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的1.6mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取702.8mg云芝多糖，溶解或懸浮于16mL二甲亞砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為50W，70℃反應10min。反應結束后，處理方法同實施例1，得棕色固體粉末狀硫酸酯化云芝多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
實施例5在冰鹽浴中，將0.8mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的1.6mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取700.2mg茶樹菇多糖，溶解或懸浮于15mL二甲亞砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為50W，70℃反應10min。反應結束后，處理方法同實施例1，得淡棕色固體粉末狀硫酸酯化茶樹菇多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
實施例6在冰鹽浴中，將1mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的2mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取700.5mg茶樹菇多糖，溶解或懸浮于15mL二甲亞砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為50W，70℃反應10min。反應結束后，處理方法同實施例1，得淡棕色固體粉末狀硫酸酯化茶樹菇多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
實施例7在冰鹽浴中，將1mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的2mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取700.0mg枸杞多糖，溶解或懸浮于15mL二甲亞砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為40W，100℃反應6min。反應結束后，處理方法同實施例1，得淡棕色固體粉末狀硫酸酯化枸杞多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
實施例8在冰鹽浴中，將1mL氯磺酸緩慢滴入到已預冷的2mL吡啶中制備氯磺酸吡啶混合物。然后，稱取600.2mg枸杞多糖，溶解或懸浮于12.8mL甲酰胺中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率為45W，70℃反應6min。反應結束后，處理方法同實施例1，得淡棕色固體粉末狀硫酸酯化枸杞多糖。其分子參數及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性見表1。
表1硫酸酯化多糖的分子參數和對HIV-1感染MT4細胞的抑制作用
注表1中藥毒“+”表示有毒性，“-”表示無毒性；p24抗原抑制率“-”表示無p24抑制作用。
權利要求
1.一種硫酸酯化多糖，其特征在于硫酸酯化多糖硫的重量百分含量為1.01～16.60％，每個單糖單位的硫酸根取代度為0.05～1.78，重均分子量為3.9×103～10.6×104。
2.根據權利要求1所述的硫酸酯化多糖，其特征在于所述的硫酸酯化多糖為硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖和硫酸酯化茶樹菇多糖。
3.根據權利要求1所述的硫酸酯化多糖的制備方法，其特征在于該方法的步驟為(1)在冰鹽浴中，將氯磺酸滴入1～10倍體積的吡啶中，得到氯磺酸吡啶混合物；(2)稱取一定量的多糖，將其溶解或懸浮在10～90倍重量比的溶劑中，接著加入與多糖殘基的摩爾比為1∶2～30的上述氯磺酸吡啶混合物，于微波合成儀中進行酯化反應，微波功率為20～150W，反應溫度為35～100℃，反應時間為3～30min；(3)反應結束后，冷卻，用1～4mol/L NaOH中和，透析，透析內液經冷凍干燥即得硫酸酯化多糖。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的溶劑為二甲亞砜、二甲基甲酰胺、甲酰胺和吡啶中的任何一種。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于微波功率為40～60W。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于反應時間為4～20min。
7.根據權利要求1所述的硫酸酯化多糖在體外具有抗艾滋病病毒活性。
全文摘要
本發明涉及一種硫酸酯化多糖及其制備方法和其在體外具有抗艾滋病病毒活性上的應用。該多糖硫含量(重量)為1.01～16.60％，每個單糖單位的硫酸根取代度為0.05～1.78，重均分子量為3.9×10
文檔編號A01N31/00GK1730496SQ200510098339
公開日2006年2月8日 申請日期2005年9月9日 優先權日2005年9月9日
發明者閆紅, 易劍平, 李澤琳, 曾毅, 鐘儒剛 申請人:北京工業大學